专利名称：用于生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的改进方法
技术领域：
本发明涉及用于生产水解木质纤维素生物量的酶的方法。
现有技术生物乙醇产能的增加及其在生物燃料中的质量是目前的“热门话题”。采用目标在欧盟范围内的讨论下，基于到2020年20%使用可再生能源的最初提议，其中采用10%的生物燃料，这服从于可持续性标准，该标准应当实现从木质纤维素生物量生产的第二代生物燃料。木质纤维素生物量的特征在于由三种主要的聚合物纤维素、半纤维素和木质素构成的复杂结构。 以往，生物量转化成乙醇的过程包括多个步骤。预处理可以产生纤维素和可能的半纤维素，它们是酶水解的目标，可以接近酶。预处理的目的是，为了改进木质素和半纤维素的基质中受困的纤维素的可达性而修饰木质纤维素材料的物理和物理-化学特性。可以使用水解纤维素和/或水解半纤维素的酶利用酶水解步骤将纤维素和半纤维素转化为糖。通过木质纤维素生物量的水解获得的糖是戊糖(主要为木糖和阿拉伯糖)、二糖(纤维二糖)和葡萄糖，其可以被微生物发酵。例如，在醇发酵步骤过程中酵母酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)可以很容易地将葡萄糖转化为乙醇。最后，蒸馏步骤可以分开并回收从发酵必须物质发酵获得的产物，S卩，在上述情况下的乙醇。各种技术-经济研究已经证明，为了使产生的乙醇的成本值接近于从淀粉获得的乙醇的成本值，有必要降低与酶水解步骤相关的成本。目前,主要通过丝状真菌里氏木霉、Trichoderma reesei)生产工业的纤维素酶，因为它具有高纤维素酶分泌的能力。降低成本的办法之一包括优化纤维素酶生产过程的操作条件，以增加其生产率，或者获得具有改进的比活性的酶鸡尾酒。在诱导基质存在的情况下，里氏木霉的野生型菌株能够分泌很好地适合于纤维素水解的酶复合物。酶复合物的酶包含三种主要类型的活性内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。其他蛋白，如木聚糖酶，其对于木质纤维素生物量的水解是必要的，也由里氏木霉产生。诱导基质的存在对于水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的表达是必不可少的。已经详细研究了各种碳源队纤维素酶的基因的调节。葡萄糖对纤维素酶生产发挥代谢阻遏作用。这在纤维素，其水解产物如纤维二糖或某些寡糖，尤其是二糖如乳糖或槐糖存在的情况下被诱导(Ilm6n等.1997，Appl. Environ. Microbiol. Vol 63,P1298-1306)。碳质基质的性质对酶复合物的组成具有主要影响。因此，可以使用与碳质诱导基质如纤维素或乳糖相关的木糖来显著改善“木聚糖酶活性”(当它以0. 5至ImM程度的限制性浓度存在时)(Mach-Aigner等，2010 Applied and Environmental Microbiology,Vol 76 N0 6，P1770-1776)。用木聚糖酶溶解残留的半纤维素(木聚糖)可以促进酶水解(Varnai 等,2010 Enzyme and Microbial Technology Vol 46 pl85 - 193)。为了获得良好的酶生产率，有必要提供可以被快速吸收以允许里氏木霉快速生长的碳源，以及可以允许纤维素酶表达并分泌到介质中的诱导基质。纤维素可以起双重作用。然而，它在工业规模上难以使用，它已经被也作为诱导基质起作用的可溶性碳源如乳糖所替代。也已经描述了作为诱导物的其他糖如纤维二糖或槐糖(Ilmen等.(1997)，Foreman 等.(2003) Biol Chem 278, p31988_31997, Pakula 等.(2005) Microbiology,151，pl35-143)，但是太昂贵不能在工业规模上使用。通常，已经观察到，因为在高浓度很容易被吸收的糖的阻遏作用，里氏木霉使用可溶性基质的纤维素酶的产量远低于以分批模式(即在密封的介质中)基于纤维素所获得的。 以本申请人的名义的专利FR-B-2 555 603提出，连续供给碳质基质，以便通过限制培养物中的残留浓度而解除代谢阻遏，并通过优化糖类的数量，以便获得更好的产量和更好的酶生产率。本专利中所述的方法提出使用可溶性糖类(任选地混合物的形式)作为碳源来开始提供基质。然而，与乳糖或与另一种纤维素酶的诱导剂(槐糖，纤维二糖，等)无关的葡萄糖或木糖的连续供给限制不能用来获得高酶生产率。在工业的纤维素酶生产过程中，乳糖仍然是最合适的基质之一。除了价高，其价格波动很大，占酶的成本价的约三分之一。专利EP-B-O 448 430中设想并提出的解决方案之一是使用从模型，例如水解的半纤维素，获得的碳质基质作为诱导性碳源。然而，生产率仍然很低，为与单独使用乳糖作为诱导基质的方法相比的约50%。专利申请WO 2009/026716描述了一种用于生产纤维素酶的方法，其中水解半纤维素的衍生物占碳源的40%以上，诱导纤维素酶生产的糖类占该混合物的3% -20%。可以使用该方法来生产与仅使用从半纤维素糖获得的糖类的方法相比至少两倍量的纤维素酶。然而，纤维素酶生产性能仍然低于仅使用乳糖的方法。目前的研究表明，为了改进水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的生产方法，有必要开发新的诱导基质，其至少和使用乳糖的那些方法一样好，并且成本更低。这构成了本发明的范围。发明概述
本发明描述了用于生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶(其中诱导基质是葡萄糖、乳糖和木糖的混合物)的方法。发明的详细说明
根据本发明的由水解纤维素和/或水解半纤维素的微生物生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的方法包括至少一个在碳源存在的情况下的生长阶段以及至少一个在诱导基质存在的情况下的生产阶段，其中所述诱导基质是葡萄糖或纤维素水解产物、乳糖和木糖或半纤维素水解产物的溶液的混合物，所述混合物的每个成分的量由下列限定所定义
40%-65%重量的葡萄糖或纤维素水解产物；
21%-25%重量的乳糖；和 10%-39%重量的木糖或半纤维素水解产物的溶液；
这三种成分的总和等于100%。除了上面列出的成分以外，诱导基质没有任何糖。因此，选择各个成分的相对比例使得基于重量的量的总和等于100%。由于本发明的方法使用特定糖类的混合物作为诱导基质，获得的蛋白的最终浓度比使用乳糖作为唯一的生产基质所获得的最终浓度高50% -60%。它们也比现有技术文献WO 2009/026716所述的用富含木糖的改进的混合物获得的最终浓度高约3倍。本发明的方法使用基于葡萄糖的混合物。超过60%的乳糖(纤维素酶生产的诱导齐U)可以用葡萄糖(然而，已知葡萄糖是纤维素酶生产的抑制剂)替代，具有诱导混合物的改进的最终表现。葡萄糖比乳糖便宜得多，其在水中的溶解度比乳糖高约3倍。因此，可能降低使用的体积。因此，在本方法中，葡萄糖不仅用于生长阶段，而且以组成诱导基质的混 合物的60 %的量用于生产阶段。也可以用从纤维素酶水解步骤获得的，即从木质纤维素生物量向乙醇转化的过程中直接获得的葡萄糖，替代糖类的混合物中使用的葡萄糖。这有助于通过使用过程的副产物降低酶生产的成本。因此，它们被称为纤维素水解产物。可以用从木质纤维素生物量向乙醇转化的过程中获得的，尤其是从生物量的预处理获得的半纤维素水解产物的溶液替代组成诱导糖的混合物中使用的木糖。此外，使用非常高度浓缩的糖类混合物的可能性可以有利地限制污染的风险。将木糖加入组成诱导基质的混合物的事实意味着大大增加了最终酶鸡尾酒的木聚糖酶活性。可以有利地用第二代生物燃料生产过程中木质纤维素生物量的预处理过程中从半纤维素的水解获得的半纤维素的水解产物溶液替代木糖；如果需要，它可以浓缩。优选地，组成诱导基质的混合物包含50% -65%重量的葡萄糖或纤维素水解产物，22% -24%重量的乳糖和15% -25%重量的木糖或半纤维素水解产物的溶液(任选地从木质纤维素生物量的预处理获得)，所述成分的总和等于100%。高度优选地，诱导基质是由60%重量的葡萄糖或纤维素水解产物，23%重量的乳糖和17 %重量的木糖或半纤维素水解产物组成的混合物。生长阶段过程中使用的碳质基质选自葡萄糖、木糖、乳糖、纤维素生物量的酶水解产物的单糖的乙醇发酵之后获得的残留物和/或可能源自纤维素生物量的预处理的水溶性戊糖的未精制的提取物。高度优选地，生长基质是葡萄糖。使用的工业菌株属于通过突变选择过程而修饰以改进水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的里氏木霉菌种(Trichoderma reesei)。可以引用的一个例子是菌株IFPCL847。也可以使用通过基因重组技术改进的菌株。它们必须缺失葡萄糖的代谢阻遏(ACREl); 一个例子是 CL847。在与它们的生长和酶的生产相容的条件下在摇动的通气的生物反应器中培养这些菌株。所述条件使得PH调整至3.5-6，温度在201-351。优选地，在生长阶段过程中选择4. 8的pH和27°C的温度，在生产阶段过程中选择4的pH和25°C的温度。在过程期间应用的通气的程度，表不为每分钟每个体积的反应介质的空气的体积，或vvm,为0. 3-1. 5mirT1,旋转速率,rpm,必须允许O2压力调整至20%-60%。优选地,选择0.5 vvm的通气度和摇动以允许O2压力调整至30%。取决于其性质，在灭菌前将选择用于获得生物量的碳质基质加入生物反应器，或者将其单独灭菌并在其灭菌后加入生物反应器，以便产生15-60 g/L的初始糖浓度。就生产阶段而言，选择用于酶生产阶段的包含由葡萄糖/乳糖/木糖混合物或半纤维素水解产物溶液组成的诱导基质的水溶液被制备为在使用的进料溶液中350-600 g /L的浓度。优选地，浓度为450-550 g/L。在初始基质已经耗尽之后注入水溶液以提供优化的量。供给溶液的流速为30-45mg/克细胞/小时。
在生产过程期间介质中的残留糖浓度小于I g/L(分批投料)以限制生物量的生产。优选地，该浓度小于0.5g/L，还更优选小于0. I g/L。
实施例在下面的实施例中，实施例I提供了在生长阶段和生产阶段过程中使用葡萄糖作为碳质基质的培养。该实施例表明当这种糖被用作唯一的碳质基质时，获得了低蛋白产量，即使在分批投料阶段过程中限制流速(葡萄糖的残留浓度接近于0)。第二个实施例提供了在生长阶段和生产阶段过程中使用乳糖作为碳质基质的参照发酵，其允许高蛋白产量。实施例3重复了专利申请WO 2009/026716中所述的在生产阶段中使用包含高比例的木糖的混合物的实验，根据作者所述，与其中使用木糖或半纤维素衍生物作为唯一的碳质基质的实验相比，所述实验允许大大增加纤维素酶的产量。实施例4-6是与本发明的方法一致的专利的那些实施例。实施例I:基于葡萄糖生产酶(与本发明不一致)
在机械搅拌生物反应器中进行纤维素酶的生产。无机盐介质具有以下组成KOH I. 66g. /L, H3PO4 85% 2 mL/L, (NH4) 2S04 2. 8 g/L, MgSO4. 7 H2O 0. 6 g/L, CaCl2 0. 6 g/L,MnSO4 3.2 mg/L, ZnSO4.7 H2O 2.8 mg/L, CoCl2 IOH2O 4.0 mg/L, FeSO4.7 H2O 10 mg/L,玉米浆I. 2 g/L,消泡剂0. 5 mL/L。包含无机盐介质的生物反应器在120°C灭菌20分钟；葡萄糖碳源从120°C灭菌20分钟，然后在无菌条件下加入生物反应器中，以产生30g/L的终浓度。用里氏木霉的CL847菌株的液体预培养物使生物反应器初始至10% (v/v) 0预培养的无机盐介质与生物反应器的介质相同，除了加入浓度为5 g/L的邻苯二甲酸钾以缓冲pH。使用浓度为30g/L的葡萄糖作为碳质基质进行预培养中真菌的生长。接种物的生长持续2-3天并在振荡培养箱中在28°C进行。如果葡萄糖的残留浓度低于15g/L，进行向生物反应器的转移。在生物反应器中进行的实验包括两个阶段
基于葡萄糖碳质基质(初始浓度=30 g/L)，在27°C的温度，4. 8的pH (用5. 5 M氨水调节)的生长阶段。通气在0. 5 vvm,以p02 (溶解氧压力)的函数在200-800 rpm之间增加摇动，所述p02保持在30%以上；
酶生产阶段。当发酵罐的初始基质耗尽时，以30-40 mg/克细胞/小时的流速连续注入250 g/L葡萄糖溶液，最长达164小时。温度降低至25°C，pH至4，直到培养结束。通过添加5.5 N氨水溶液(其提供了合成分泌的蛋白所必需的氮)调节pH。通过调整通气和搅拌使溶解氧含量保持在15% -20%以上。酶生产以后，在通过过滤或离心从菌丝体分离之后，使用Lowry法和BSA标准品测定胞外蛋白。测定的水解纤维素活性如下
滤纸活 性(FPU =滤纸单元)，这意味着可以测定内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶合并物的总的活性；
芳基￠-葡糖苷酶和木聚糖酶活性的比活性。以50 g/L的初始浓度在Whatman No I纸上测定FPU活性(IUPAC生物技术委员会推荐的操作)；测定来自待分析的酶溶液的试验样品，其在60分钟内释放了 2 g/L葡萄糖的等效物(比色法测定)。滤纸活性的原理是通过DNS (二硝基水杨酸)测定从WhatmanNo I纸获得的还原糖的量(IUPAC生物技术委员会推荐的操作)。用于测定芳基P -葡糖苷酶活性的基质是对硝基苯基-D-批喃葡糖苷(PNPG)。它由￠-葡糖苷酶裂解以释放对硝基苯酚。一个芳基0 -葡糖苷酶活性单位被定义为每分钟从PNPG产生I微摩尔对硝基苯酚所需的酶的量，以IU/ml表示。木聚糖酶活性测定的原理在于通过DNS试验测定从水解的木聚糖酶溶液获得的还原糖的量。这种测定方法使用糖类，主要为木糖的还原特性。木聚糖酶活性以IU/ml表示，对应于每分钟产生I微摩尔木糖所需的酶的量。通过将IU/ml表示的活性除以蛋白的浓度而获得比活性。它们以IU/mg表示。对实施例I的最终必需物质的分析测定产生了以下结果
最终必需物质的分析测定产生了以下结果
生物量15. 2 g/L
蛋白2.9 g/L
FPU 1.4 IU/mL
木聚糖酶29. I IU/mg
^ -葡糖苷酶比活性0. 35 IU/mg。提供的CL847菌株被处理以便使葡萄糖行使的对纤维素酶生产的代谢阻遏去阻遏(derepressed)(它从CREl基因中缺失)。似乎,甚至对于在葡萄糖限制的条件下进行的分批投料反应，蛋白的最终产量是非常低的。实施例2:基于乳糖生产酶(与本发明不一致)
在与实施例I中相同的条件下进行酶生产。在生长和生产阶段过程中的碳质基质是纯乳糖。乳糖是纤维素酶生产的一种重要的诱导物。它是这样的基质，其对于工业规模上生产纤维素酶是最广泛使用的。生长30小时后，在初始基质耗尽后，以35 mg/克细胞/小时的流速连续注入250g/L分批投料溶液，最长达164小时。最终必需物质的分析测定产生了以下结果
生物量13. 5 g/L
蛋白 37.8 g/L FPU 22. I IU/mL 木聚糖酶408. 5 IU/mg
葡糖苷酶比活性0.96 IU/mg。
实施例3:用97%木糖/3%诱导纤维素酶生产的糖CIC的混合物的生产(与本发明不一致)
在与实施例I相同的条件下，在生长阶段过程中使用纯木糖作为唯一的碳质基质，在生产阶段中使用专利申请WO 2009/026716 Al中提供的97%木糖/3% CIC混合物进行实验。CIC(诱导纤维素酶的生产的糖)是允许诱导纤维素酶生产的糖的混合物。其组成如下56%龙胆二糖，14%槐糖，10%海藻糖，6%纤维二糖，6%麦芽三糖，8%葡萄糖。初始基质耗尽后，根据所述的推荐方案，以0.4 g碳/L/h的流速注入360 g/L97%木糖/ 3% CIC混合物。最终必需物质的分析测定产生了以下结果
生物量14. 3 g/L
蛋白 18.7 g/L FPU 6. 4 IU/ml 木聚糖酶6000. I IU/mg FPU 比活性 0. 34 IU/mg
葡糖苷酶比活性1.15 IU/mg。最终蛋白产量接近于WO 2009/026716 Al (其中作者用P59G菌株获得了 25 g/L的最终蛋白浓度)中提供的最终蛋白产量。FPase比活性(0.34 IU/mg)较低，而木聚糖酶活性是非常高的。实施例4:用500 g/L的乳糖(23% )/葡萄糖(60% )/木糖(17% )混合物的生产(与本发明一致)
在与实施例I相同的条件下，使用60 g/L的量的葡萄糖作为用于生长的碳质基质进行 实施例4的实验。在分批投料生产阶段过程中，我们使用了一种溶液，其中以下列比例混合三种碳质基质500 g/L浓度的乳糖(23% )/葡萄糖(60% )/木糖(17% )。以45 mg/g/h注入该混合物。最终必需物质的分析测定产生了以下结果
生物量26. I g/L 蛋白 61. 8 g/L FPU 33. 7 IU/ml 木聚糖酶4017 IU/mg FPU 比活性 0. 55 IU/mg
葡糖苷酶比活性1.2 IU/mg。最终蛋白产量比实施例3的最终蛋白产量高3倍以上。滤纸活性，其是纤维素酶活性的指标，要高约5倍。木聚糖酶活性比以乳糖作为唯一的生长和生产碳质基质的实施例2的木聚糖酶活性高10倍以上，但比实施例3的木聚糖酶活性低约50%。实施例5:使用500 g/L的乳糖(23% )/葡萄糖(60% )/C5糖溶液(17% )混合物(与本发明一致)
在与实施例4相同的条件下进行实施例5。在生长阶段过程中使用浓度为15 g/L的葡萄糖。使用可溶性半纤维素溶液或C5糖溶液(是从用0.08 N硫酸浸溃并通过蒸汽爆发(19巴，5分钟)预处理的麦秸获得的)的溶液替代分批投料溶液的木糖。以30 mg/g/h注入该混合物，持续170 h。最终必需物质的分析测定产生了以下结果
生物量19. I g/L
蛋白 57.3 g/L FPU 25. I IU/ml 木聚糖酶1151 IU/mg FPU 比活性 0. 44 IU/mg
葡糖苷酶比活性1.4 IU/mg。本实验允许与实施例2相比蛋白产量增加超过50 %，木聚糖酶活性要好几乎3倍。在生长阶段和生产阶段过程中用葡萄糖和C5糖溶液替代大多数乳糖。与实施例4相比，在生长阶段过程中葡萄糖的浓度降低，从60 g/L降低至15 g/L。生物量的浓度从26 g/L降·低至19 g/L，但这对于蛋白的最终浓度影响很小(低7%)。因此，优化糖的使用，碳源的成本降低相当多。实施例6:使用500 g/L的乳糖(23% )/ C6水解产物(56% )/木糖(21% )混合物(与本发明一致)
在与实施例4相同的条件下进行实施例6。在生长阶段过程中使用浓度为15 g/L的葡萄糖。使用一种水解产物的溶液替代分批投料溶液的葡萄糖，所述水解产物的溶液是从用
0.08 N硫酸浸溃并通过蒸汽爆发(19巴，5分钟)预处理的麦秸的酶水解获得的。在50°C和4. 8的pH进行麦秸的酶水解。它导致了 95%的纤维素水解成葡萄糖。乳糖和木糖溶解在该溶液中以便产生如下混合物
500 g/L的乳糖(23% )/C6水解产物(56% )/木糖(21% )。在分批投料过程中以30 mg/g/h注入该混合物,持续170 h。最终必需物质的分析测定产生了以下结果
生物量16. I g/L
蛋白 43. I g/L FPU 31. 4 IU/ml 木聚糖酶6595. I IU/mg FPU 比活性 0. 73 IU/mg
葡糖苷酶比活性1.2 IU/mg。获得的酶鸡尾酒质量非常高，因为即使蛋白浓度更低，最终的FPase活性接近于实施例4中获得的活性。最终的FPase活性比实施例3获得的最终的FPase活性高约5倍，比实施例2 (其中在分批投料阶段过程中使用乳糖作为唯一的碳质基质)中获得的最终的FPase活性高约50*%。
权利要求
1.由水解纤维素和/或水解半纤维素的微生物生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的方法，包括至少一个在碳源存在的情况下的生长阶段以及至少一个在诱导基质存在的情况下的生产阶段，其中所述诱导基质是葡萄糖或纤维素水解产物、乳糖和木糖或半纤维素水解产物的溶液的混合物，所述混合物的每个成分的量通过下列限定所定义 40%-65%重量的葡萄糖或纤维素水解产物； 21%-25%重量的乳糖；和 10%-39%重量的木糖或半纤维素水解产物的溶液； 这三种成分的总和等于100%。
2.权利要求I的方法，其中所述微生物属于里氏木霉，并且所述微生物缺失葡萄糖的代谢阻遏。
3.权利要求I或2的方法，其中所述诱导基质在溶液中供给，所述诱导基质在生产阶段过程中使用的供给溶液中的浓度为350-600 g/L。
4.权利要求3的方法，其中所述浓度在450-550g/L的范围内。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中组成所述诱导基质的所述混合物包括50% -65%重量的葡萄糖或纤维素水解产物，22% -24%重量的乳糖和15% -25%重量的木糖或半纤维素水解产物的溶液，所述成分的总和等于100%。
6.权利要求5的方法，其中所述诱导基质是由60%重量的葡萄糖或纤维素水解产物，23 %重量的乳糖和17 %重量的木糖或半纤维素水解产物组成的混合物。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中生长阶段过程中使用的碳质基质选自葡萄糖、木糖、乳糖、纤维素生物量的酶水解产物的单糖的乙醇发酵之后获得的残留物和/或可能源自纤维素生物量的预处理的水溶性戊糖的未精制的提取物。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中pH调整至3.5-6，温度在20°C _35°C。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中引入供给溶液的流速为30-45mg/克细胞/小时。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中生长阶段过程中在介质中糖的残留浓度为小于I g/L，优选小于0.5 g/L，高度优选小于0. I g/L。
全文摘要
根据本发明的由水解纤维素和/或水解半纤维素的微生物生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的方法包括至少一个在碳源存在的情况下的生长阶段以及至少一个在诱导基质存在的情况下的生产阶段，其中所述诱导基质是混合物，所述混合物包括40％-65％重量的葡萄糖或纤维素水解产物、21％-25％重量的乳糖和10％-39％重量的木糖或木质纤维素半纤维素水解产物的溶液，这三种成分的总和等于100％。
文档编号C12R1/885GK102971418SQ201180034419
公开日2013年3月13日 申请日期2011年6月16日 优先权日2010年7月12日
发明者F.本沙巴纳, F.莫诺 申请人:Ifp 新能源公司