作为可替代的抗微生物剂的噬菌体裂解酶的制作方法

作为可替代的抗微生物剂的噬菌体裂解酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及来自噬菌体CP26F和CP39O的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶、以及在控制产气荚膜梭状芽孢杆菌中用途。
【专利说明】作为可替代的抗微生物剂的噬菌体裂解酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于控制产气荚膜梭状芽孢杆菌{Clostridium perfringens)细菌的噬菌体裂解酶或其功能性片段以及所述裂解酶的用途，包括但不限于治疗由产气荚膜梭状芽孢杆菌所致的疾病的组合物和方法。
【背景技术】
[0002]产气荚膜梭状芽孢杆菌是梭状芽胞杆菌属的革兰氏阳性、杆状、厌氧的产孢细菌。产气荚膜梭状芽孢杆菌在自然界普遍存在，通常可作为腐烂植物、海洋沉积物、人和其他脊椎动物的肠道、昆虫和土壤的成分而发现。尽管普遍存在，并且通常为良性，但产气荚膜梭状芽孢杆菌也是许多动物和人的严重感染的原因。的确，已知产气荚膜梭状芽孢杆菌是食物中毒、气性坏疽(梭菌性肌坏死)、坏死性肠炎、和非食物传播的胃肠感染的原因。因此，产气荚膜梭状芽孢杆菌是人和动物的病原体(Songer，1997)。尽管所有家畜均可被感染，但产气荚膜梭状芽孢杆菌尤其是养禽业的忧虑。的确，在禽类中，产气荚膜梭状芽孢杆菌导致最具破坏性的损失。
[0003]在鸡中，产气荚膜梭状芽孢杆菌导致坏死性肠炎，在现代肉用鸡群中最常见和具经济破坏力的细菌疾病。尽管临床疾病通常非常短暂，但在未经保护的禽群中死亡率可具破坏力。的确，通常在群体中坏死性肠炎的唯一迹象是死亡率的突然增加。除了增加死亡率之外，坏死性肠炎可存在于抑郁、起皱的羽毛和深色腹泻的禽类中。通常，在群体中疾病持续介于约5-10天之间，其具有介于约2-50%之间的死亡率。
[0004]通常，通过在水或饲料中预防给药施用的抗微生物药物来控制坏死性肠炎。然而，对在动物饲料中使用抗生素的公众反对声日益增加。例如，在欧洲，已经禁止在动物饲料中使用抗生素(参见例如，van Immerseel等人,2004，2008)。很快美国也会如此。如果没有用于预防坏死性肠炎和由产气荚膜梭状芽孢杆菌导致的其他疾病的传统抗生素，则这些疾病可能成为养禽业的 极大问题。
[0005]因此，本领域需要对预防和治疗由产气荚膜梭状芽孢杆菌(特别是影响家禽的产气荚膜梭状芽孢杆菌)所导致疾病有效的传统抗生素的替代选择。
[0006]幸运地，如从以下公开明显可见，本发明提供这些和其他需求。

【发明内容】

[0007]在一个实施方案中，本发明提供分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其中噬菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及其中，噬菌体裂解酶活性导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。在一示例性实施方案中，分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶包含具有与SEQ ID NO:1有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。在另一示例性实施方案中，分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶具有根据SEQ IDNO:1的序列。在另一示例性实施方案中，分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶包含具有与SEQ ID NO:3有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。在又一示例性实施方案中，分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶具有根据SEQ ID NO:3的序列。在又一示例性实施方案中，分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶由产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体分离，该产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体是选自具有ATCC保藏名称PTA-11081的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP390以及具有ATCC保藏名称PTA-11080的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP26F的成员。
[0008]在另一实施方案中，本发明提供编码产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的分离的核酸分子，其中噬菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及其中，噬菌体裂解酶活性导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。在一示例性实施方案中，分离的核酸分子是选自编码具有与SEQ ID NO:1有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽的分离的核酸以及编码具有与SEQ ID NO: 3有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽的分离的核酸的成员。在另一示例性实施方案中，分离的核酸分子编码具有根据SEQ ID N0:1的氨基酸序列的肽。在另一示例性实施方案中，分离的核酸分子编码具有根据SEQ ID N0:3的氨基酸序列的肽。
[0009]在另一实施方案中，本发明提供有效针对产气荚膜梭状芽孢杆菌的抗微生物组合物，该抗微生物组合物包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其中噬菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及其中，噬菌体裂解酶活性导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。在一示例性实施方案中，抗微生物组合物包含具有与SEQ ID NO:1有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。在另一示例性实施方案中，抗微生物组合物包含具有根据SEQ ID NO:1的序列的肽。在另一示例性实施方案中，抗微生物组合物包含具有与SEQ ID N0:3有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。在又一示例性实施方案中，抗微生物组合物包含具有根据SEQ ID N0:3的序列的肽。在另一示例性实施方案中，抗微生物组合物包含由产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体分离的噬菌体裂解酶，该产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体是选自具有ATCC保藏名称PTA-11081的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP390以及具有ATCC保藏名称PTA-11080的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP26F的成员。
[0010]在另一实施方案中，本发明提供包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的动物饲料，其中噬菌体裂解酶是 选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及其中噬菌体裂解酶在家畜中以有效地控制产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的量存在。在一示例性实施方案中，动物饲料适合饲养鸡类。
[0011]本发明的其他特征、目的和优势由以下详细描述显而易见。
【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1.SEQ ID NO:1:噬菌体CP26F溶素氨基酸序列。
[0013]图2.SEQ ID NO: 2:编码噬菌体CP26F溶素的示例性核酸序列。下划线序列是各自基因的“起始”和“终止”位点。
[0014]图3.SEQ ID NO: 3:噬菌体CP390溶素氨基酸序列。
[0015]图4.SEQ ID NO:4:编码噬菌体CP390溶素的示例性核酸序列。下划线序列是各自基因的“起始”和“终止”位点。
[0016]图5.CP26F溶素和CP390溶素的氨基酸序列的比较比对。【具体实施方式】
[0017]定义
如本文所使用的术语“家畜”是指在农业环境中饲养的一种或多种驯养家畜，通常但不必要地用于生产食品、纤维或者提供劳力。示例性家畜种类包括但不限于牛、猪、羊和家禽。
[0018]如本文所使用的术语“家禽”是指封闭培养或保存以用于繁殖、生产肉或蛋、或者补充猎物供应的家用禽类，例如，鸡；火鸡；珍珠鸡；鸭；鹅；鹌鹑；鸽子；诸如野鸡、鹧鸪、平胸鸟的猎鸟等。
[0019]如本文所使用的术语“抗微生物剂”、“杀微生物剂”或任意其他语法等同表达形式是指有效地控制诸如细菌(例如，产气荚膜梭状芽孢杆菌)的微生物的任意组合物和/或物质。在示例性实施方案中，“抗微生物剂”是包含有效地控制产气荚膜梭状芽孢杆菌的噬菌体裂解酶的抗微生物组合物。
[0020]如本文所使用，如在诸如短语产气荚膜梭状芽孢杆菌的“控制”、“使控制”产气荚膜梭状芽孢杆菌、“使控制产气荚膜梭状芽孢杆菌种群”、或者“使控制产气荚膜梭状芽孢杆菌感染”或者任意语法等同表达形式中的术语“控制”或者“使控制”是指用于预防感染或侵染；降低或消除已经感染的区域或生物体的种群；或者消除产气荚膜梭状芽孢杆菌或者需要“控制”的其他种属的种群。的确，如本文所使用的“使控制”是指成功地预防、消除、降低或改善产气荚膜梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌感染、或者产气荚膜梭状芽孢杆菌的种群的表征。
[0021]如本文所使用的表达“产气荚膜梭状芽孢杆菌感染”是指获取产气荚膜梭状芽孢杆菌微生物至“宿主”体内或体表。在一示例性实施方案中，“宿主”是动物，例如，鸡。在另一示例性实施方案中，“宿主”是人。“产气荚膜梭状芽孢杆菌感染”可或可不导致疾病。如本文所使用的表达“疾病”是指产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的特定案例，其中已经获得产气荚膜梭状芽孢杆菌至其体内或体表的宿主与产气荚膜梭状芽孢杆菌以使得导致具有外在表现的宿主损伤的方式来相互作用，该外在表现为例如疾病的临床症状，例如，在种群中增加的死亡率、抑郁、起皱的 羽毛和深色腹泻等。
[0022]如本文所使用的短语“有效量”或者“对……有效的量”或任意其他语法等同表达形式是指有效地控制产气荚膜梭状芽孢杆菌的诸如本文所公开的抗微生物剂噬菌体裂解酶的物质的量。本领域普通技术人员鉴于其技术和该公开、在没有过多试验下能够确定实施本文所公开的产气荚膜梭状芽孢杆菌控制方法的抗微生物剂噬菌体裂解酶的有效量。例如，在较高或较低剂量下特定抗微生物剂噬菌体裂解酶可更加有效。通过使用本文所述的方法来评价家畜，例如家禽，例如鸡，熟练操作人员能够确定所述家畜是否能够应答治疗以及知道如何调节对应的剂量水平。
[0023]如本文所使用的术语“使预防”或“预防”是指成功地预防、或改善疾病或感染的任意表征，包括任何客观或主观参数，例如减少、缓和和/或消除症状。例如，如本文所使用的术语“使预防”或“预防”是指预防与产气荚膜梭状芽孢杆菌相关的疾病；降低与产气荚膜梭状芽孢杆菌相关疾病的严重程度；降低罹患与产气荚膜梭状芽孢杆菌相关疾病的诸如家禽(例如，鸡)的家畜的预期死亡或死亡率。在示例性实施方案中，通过比较如与未经饲养、或另外经抗微生物噬菌体裂解酶处理的家禽中症状、发病率和/或死亡率相比较的经饲养、或另外经抗微生物剂噬菌体裂解酶处理的症状、发病率和/或死亡率；以及观察与未经饲养、或另外经抗微生物剂噬菌体裂解酶处理的家禽相比较的家禽的症状的严重程度或出现、和/或发病率和/或死亡率减轻、消除以及因而降低来测定与产气荚膜梭状芽孢杆菌相关的疾病预防的成功率。症状的预防、治疗、降低或改善可基于客观或主观参数；包括组织样品的物理检查、活检或微观检查、或者本领域已知的任何其他合适的方式。
[0024]如本文所使用的术语“坏死性肠炎”是指通常影响诸如鸡、火鸡和鸭的家禽的急性或慢性肠原性毒血症疾病。病症世界性爆发，并且通过产气荚膜梭状芽孢杆菌导致。疾病的特征尤其在与纤维蛋白-坏死性肠炎，通常在中-小肠中。
[0025]如本文所使用的术语“生物样品”或术语“诊断样品”是指从活或死生物体中获得的任意样品。生物样品的例子包括诸如分离的脾、气管、胸腺的分离的器官或身体部位；粘膜；棉签，例如阴沟棉 签、口咽棉签。
[0026]如本文所使用的术语“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”或“噬菌体裂解酶”、或“裂解酶”、或“噬菌体溶素”、或“溶素”、“噬菌体内溶素”或者“内溶素”是指切割或者能够切割肽部分、以及从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌的裂解的裂解酶，该肽部分在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间酰胺键处包含细菌肽聚糖细胞壁。在示例性实施方案中，产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-158有至少约90%同一'丨生的氨基酸序列。在一不例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌曬菌体裂解酶”或“噬菌体裂解酶”是源于噬菌体CP26F的CP26F溶素C-_fCP26F)，其依照布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定于2010年6月23日保存在美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection) (ATCC)以及指定保藏名称PTA-11080，其切割或能够切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键处包含细菌肽聚糖细胞壁的肽部分，从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌的裂解，其中CP26F溶素包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-158有至少约91%同一'丨生的氨基酸序列。在其他不例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”是CP26F溶素以及包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-158有至少约92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的氨基酸序列。在一示例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”是CP26F溶素以及具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1-212 有至少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的氨基酸序列。在另一示例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”是CP26F溶素，该CP26F溶素切割或能够切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键处包含细菌肽聚糖细胞壁的肽部分，从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌的裂解，其中CP26F溶素具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一示例性实施方案中，产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸1-158有至少约90%同一性的氨基酸序列。在一示例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”或“噬菌体裂解酶”是源于噬菌体CP390的CP390溶素C?77_fCP390)，其依照布达佩斯条约的规定于2010年6月23日保存在美国模式培养物保藏所(ATCC)以及指定保藏名称PTA-11081，其切割或能够切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键处包含细菌肽聚糖细胞壁的肽部分，从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌的裂解，其中CP390溶素包含与SEQ ID N0:3的氨基酸
1-158有至少约91%同一'丨生的氨基酸序列。在其他不例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”是CP390溶素，该CP390溶素切割或能够切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键处包含细菌肽聚糖细胞壁的肽部分，从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌的裂解，其中CP390溶素包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸1-158有至少约92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的氨基酸序列。在一示例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”是CP390溶素以及具有与SEQ ID NO:3的氨基酸1-212 有至少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的氨基酸序列。在另一示例性实施方案中，“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶”是CP390溶素以及具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
[0027]产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶可由任意来源分离和/或可通过本领域已知方法来合成(参见例如，R.B.Merrifield (1963) J.Am.Chem.Soc.85 (14): 2149 -2154 ;美国专利4，192，798 ;美国专利5，763，284 ;美国专利5，942，609等)，只要它们基本上与如本文所公开的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列相同以及能够切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键处产气荚膜梭状芽孢杆菌属的细菌肽聚糖细胞壁，从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。测定核苷酸和/或氨基酸序列同一'I"生和“基本上同一'I"生”的方法描述如下。
[0028]如本文所使用的术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指基本上或本质上没有当在其天然状态下发现的常规伴随的组分。在示例性实施方案中，使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法的分析化学技术来测定纯度和均一性。作为在制剂中存在的主要种类的核酸基本上被纯化。在一示例性实施方案中，将诸如26F裂解酶的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸与在其天然状态下旁侧相接噬菌体裂解酶核酸的开放阅读框和/或其他核酸序列分离。在示例性实施方案中，术语“纯化的”表示在电泳凝胶中核酸或蛋白导致基本上一条带。通常，分离的核酸或蛋白具有表达为范围的纯度水平。组分的纯度范围的下端为约60%、约70%或约80%以及 纯度范围的上端为约70%、约80%、约90%或者大于约90%。
[0029]如本文所使用的术语“核酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。通常，“核酸”聚合物以单链或双链形式出现，但也已知形成包含三或多链的结构。术语“核酸”包括天然存在的核酸聚合物以及包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其为合成、天然存在的以及非天然存在的，其具有如参照核酸的类似结合性质，以及以类似于参照核苷酸的方式将其代谢。示例性类似物包括但不限于:硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
[0030]除非另有说明，特定核酸序列也暗示性涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换物)以及互补序列、以及明确表示的序列。具体而言，通过生成其中一个或多个选择的(或者所有)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列可获得简并密码子置换物(参见例如，Batzer 等人，Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ；0htsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985);以及 Rossolini 等人，Mol.Cell.Probes8:91-98 (1994))o
[0031]在本文中可交换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。术语应用至天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
[0032]术语“氨基酸”是指天然存在的和合成氨基酸、以及以类似天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是通过遗传密码编码的那些、以及随后经修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有如天然存在的氨基酸的相同基本化学结构(即，结合氢的碳、羧基、氨基以及R基团)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者修饰的肽主链，但保留如天然存在的氨基酸的相同基本化学结构。氨基酸模仿物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以天然存在的氨基酸的类似方式发挥功能。
[0033]本文中氨基酸通过它们通常已知的三字母符号或通过IUPAC-1UB生化命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一字母符号来指代。类似地，核苷酸可通过它们通常可接受的单字母代码来指代。
[0034]“保守修饰的变体”应用至氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指其编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸未编码氨基酸序列至基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，所以大量功能上相同的核酸编码任意给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶均编码氨基酸丙氨酸。因此，在通过密码子指定丙氨酸的所有位置处，在未改变编码的多肽下可将密码子改变至所述任意对应的密码子。这些核酸变化是“沉默变化”，其·是保守修饰的变化的一种类型。本文的编码多肽的每一核酸序列也描述核酸的每种可能的沉默变化。技术人员意识到，可将在核酸中各密码子(除通常为蛋氨酸的仅有密码子的AUG、以及通常为色氨酸的仅有密码子的TGG之外)修饰以生成功能上相同的分子。相应地，编码多肽的核酸的各沉默变化暗示在各所述序列中。
[0035]至于氨基酸序列，技术人员意识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分率的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别置换、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中变化导致氨基酸被化学上类似的氨基酸置换。提供功能类似的氨基酸的保守置换表格是本领域众所周知的(参见，例如Creighton, Proteins (1984))。这些保守修饰的变体此外为以及不排除多形变体、种间同源物和等位基因。
[0036]以下八种基团示出一些示例性氨基酸，其为彼此的保守置换物:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。
[0037]诸如多肽结构的大分子结构依据组织的各种水平。对于该组织的一般讨论，参见例如，Alberts 等人，Molecular Biology of the Cell (第 3 版，1994)以及 Cantor和 Schimmel, Biophysical Chemistry Part 1: The Conformation of BiologicalMacromolecules (1980)。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指在多肽内局部有序的、三维结构。这些结构通常称为结构域。结构域是形成多肽的紧密单元的多肽的一部分，其通常为50至350个氨基酸长。通常结构域由更小组织的部分组成，例如β_折叠和α-螺旋的延伸。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指通过独立的三维单元的非共价缔合形成的三维结构。各向异性术语也称为能量术语。
[0038]如本文所使用的术语“标记”是指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方式检测的组合物。示例性标记包括32P、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，如通常在ELISA中所使用)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白。
[0039]如本文所使用的“核酸探针或寡核苷酸”是指通过一种或多种类型的化学键、通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成能够结合互补序列的靶核酸的核酸。如本文所使用，探针可包括天然(即，A、G、C或T)或者修饰的碱基(例如，7-去氮鸟苷、肌苷等)。此外，在探针中碱基可通过除磷酸二酯键之外的连接来接合，只要它不干扰杂交。因此，例如，探针可以为肽核酸，其中构成碱基通过肽键而不是磷酸二酯连接来接合。通过本领域技术人员理解，取决于杂交条件的严格性，在缺乏与探针序列的完整互补下探针可结合靶序列。在一示例性实施方案中，可直接使用同位素、发色团、发光团、色原体等标记探针。在其他示例性实施方案中，使用例如生物素来间接标记探针，抗生蛋白链菌素复合物可随后结合至该探针。通过评估探针存在与否，人们可检测选择序列或子序列存在与否。
[0040]因此，如本文所使用的术语“标记的核酸探针或寡核苷酸”是指通过接头或化学键共价或者通过离子、范德华力、静电或氢键非共价使探针结合至标记，使得通过检测结合至探针的标记的存在可检测探针的存在。
[0041]如本文所使用的术语“引物”是指短核酸，通常为至少约15个核苷酸长度的DNA寡核苷酸。在示例性实施方案中，通过核酸杂交将引物与互补靶DNA链退火以形成在引物和靶DNA链之间的杂交物。然后通过DNA聚合酶将退火的引物沿着靶DNA链延伸。通过例如聚合酶链反应(PCR)或本领域已知的其他核酸扩增方法可将引物对用于扩增核酸序列。
[0042]通过例如使用诸如Primer (版本 0.5 ?1991, Whitehead Institute forBiomedical Research, Cambridge, Mass.)的旨在用于该目的的计算机程序，PCR引物对通常源于已知序列。本领域技术人员理解，随着其长度增加，特定探针或引物的特异性增力口。因此，例如，包 含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的20个连续核苷酸的引物与具有比仅15个核苷酸的相应引物更高特异性的相关靶序列退火。因此，在示例性实施方案中，使用选择包含选择的序列的20、25、30、35、40、50或更多个连续核苷酸的探针和引物来获得核酸引物或探针的更大特异性。
[0043]基于本文所公开的核酸序列容易制备核酸探针和引物。制备和使用探针和引物的方法和标记的方法以及选择合适各种目的的标记指导讨论于例如Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第 2 版 1989, Cold Spring HarborLaboratory ?，以及 Current Pro toco Is in Molecular Biology, Ausubel 等人编辑，1994，John Wiley & Sons)。当涉及例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时,术语“重组体”表示通过引入异源性核酸或蛋白、或者改变天然核酸或蛋白来修饰细胞、核酸、蛋白或载体；或者细胞源于经修饰的细胞。因此，例如，重组体细胞表达在细胞的天然(非重组体)形式内发现的基因或者表达异常表达、过表达、表达不足或者根本未表达的天然基因。
[0044]如本文所使用的术语“启动子”或“启动子复合物”或“启动子序列”是指引导核酸转录的核酸表达控制序列的阵列。如本文所使用，“启动子”或“启动子复合物”或“启动子序列”包含靠近转录的起始位点处的诸如聚合酶II型启动子、TATA元件等的必要核酸序列以“控制”可操作连接的核酸的转录。在一些示例性实施方案中，“启动子复合物”或“启动子序列”也包括末端增强子或阻遏物元件，其可以但不必要地位于转录的起始位点的多达数千碱基对处。在其他示例性实施方案中，“启动子”或“启动子复合物”或“启动子序列”包括便于可操作连接的异源性核酸的转录和/或异源性核酸的最终蛋白产物的表达的序列，例如如本文所公开的内含子序列和/或内含子以及遍在蛋白单体序列。
[0045]如本领域众所周知，“连续”启动子是在大部分环境和发育条件下为活性的启动子。“可诱导”启动子是在环境或发育调节下为活性的启动子，例如，对温度的应答上调。启动子可全部源于天然基因；可包含天然基因的节段或片段；或者可由源于天然发现的不同启动子的不同元件组成；或者甚至包含合成DNA节段。本领域技术人员理解，不同启动子可引导在不同组织或细胞类型中、或者在不同发育阶段、或者应答不同环境或生理条件的基因表达。进一步理解，相同启动子可区别地表达在不同组织中和/或区分地表达在不同条件下。
[0046]如本文所使用的术语“在严格杂交条件下能够杂化”是指在严格杂交条件下(以下所定义)使第一核酸与第二核酸退火。在示例性实施方案中，第一核酸是测试样品，以及第二核酸是产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的有义或反义链。在标准严格条件下进行第一和第二核酸的杂交，例如高温和/或低盐含量，其倾向于不利于不同核苷酸序列的杂交。
[0047]术语“可操作连接”是指在核酸表达控制序列(例如，转录因子结合位点的阵列)以及第二核酸序列(例如，产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸序列)之间的功能性连接，其中表达控制序列引导应答第二序列的核酸的诸如转录的表达。在示例性实施方案中，“可操作连接”诸如产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的异源性核酸的启动子位于异源性核酸的上游以及框架中。
[0048]当涉及一部分核酸使用时，术语“异源性”表示核酸包含天然发现彼此之间不是相同关系的两个或更多个子序列。例如，核酸通常重组产生，其具有来自不相关基因的两个或更多个序列以得到新的功能性核算，例如来自一种来源的启动子以及来自另一来源的编码区。类似地，异源性蛋白表示蛋白包含天然发现彼此之间不是相同关系的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白 )。
[0049]如本文所使用的“表达盒”是指通常通过重组或合成生成的核酸构建体，其包含使在宿主细胞中特定核酸可转录的一系列规定的核酸元件。在示例性实施方案中，表达盒包含可操作连接至启动子的诸如产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶、诸如26F裂解酶序列、390裂解酶序列等的待转录的异源性核酸。
[0050]通常，“表达盒”是“表达载体”的一部分。如本文所使用的术语“载体”是指能够复制选择的宿主细胞或生物体的核酸。载体可复制为自发结构，或者可选择地整合至宿主细胞染色体内，以及因而沿着宿主细胞基因组复制。因此，“表达载体”是在诸如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段或者本领域已知的任意合适的构建体的选择的宿主细胞或生物体中能够复制的核酸，其包含“表达盒”。
[0051]如本文所使用的术语“转化”涵盖将核酸分子引入细胞内的任意和所有技术，包括但不限于使用病毒载体转染；使用质粒载体转化；以及通过电穿孔、脂质转染、农杆菌属感染和粒子枪加速引入裸DNA。
[0052]以下术语用于描述在两种或更多种核酸或多核苷酸之间的序列关系:“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性的百分比”以及“基本同一性”。“参考序列”是用作序列比较基础所定义的序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如，作为全长产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列或序列表中所给出的基因序列的节段，或者可包含完整产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列或基因序列。
[0053]在两种或更多种核酸或多肽序列的文本中术语“同一性”或“同一性”百分比是指当如使用序列比较算法或通过手工比对和目视检查测定的比较窗、或指定区域内比较和比对最大一致性时相同或具有相同的指定比例的氨基酸残基或核苷酸(例如，85%同一性、90%同一性、99%或100%同一性)的两种或更多种序列或子序列。
[0054]在两种核酸或多肽的文本中短语“基本上相同”是指当如使用序列比较算法或通过目视检查比较和比对最大一致性时，具有至少约85%同一性、至少约86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸或者氨基酸残基同一性的两种或更多种序列或子序列。在示例性实施方案中，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域内。在另一示例性实施方案中，基本同一性存在于至少约100个残基长度的序列区域内。在又一示例性实施方案中，基本同一性存在于至少约150或更多个残基长度的序列区域内。在一示例性实施方案中，在核酸或蛋白序列的全部长度内序列基本上相同。
[0055]对于序列比较，通常一种序列用作比较测试序列的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果必要，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定可选择的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对参考序列的序列同一性百分比。
[0056]如本文所使用，“比较窗”包括邻接位置的选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的任一数目的节段的参考，其中在任选比对两序列之后可比较序列与邻接位置的相同数目的参考序列。比较序列的比对方法是本领域众所周知的。通过例如Smith & Waterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)的局部同一性算法；通过Needleman &ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源性比对算法；通过 Pearson & Lipman,Proc.Nat’1.Acad.Sc1.USA 85:2444 (1988)的类似性方法的研究；通过这些算法的计算机化实施(在Wisconsin遗传软件包,遗传计算机组,575 Science Dr., Madison, ffis.中GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或者通过手工比对和目视检查(参见，例如，在CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel等人编辑，1995增补))可进行比较序列的任选比对。
[0057]序列比较的示例性算法是PILEUP。使用渐进、逐对比对，PILEUP产生来自一组相关序列的多个序列比对以显示关系和序列同一性百分比。它也绘制树形或树枝形结构图，其显示用于产生比对的聚集关系。PILEUP使用Feng & Doolittle, J.Mol.Evol.35:351-360 (1987)的渐进比对方法的简化。使用的方法类似于Higgins & Sharp, CABIOS5:151-153 (1989)所描述的方法。程序可比对至多300个序列，其各自最大长度为5，000个核苷酸或氨基酸。多种比对方法由两最相类似的序列的逐对比对开始，这得到两比对的序列的簇。然后将该簇比对至最相关序列或者比对序列的簇。通过两单独序列的逐对比对的简单延伸来比对序列的两簇。通过一系列渐进、逐对比对来得到最终比对。通过指定序列比较区域的特异性序列和它们氨基酸或核苷酸坐标以及通过指定程序参数来运行程序。使用PILEUP，经使用以下参数来比较参考序列以及其他测试序列，从而测定序列同一性百分比关系:默认缺口重量(3.00);默认缺口长度重量(0.10);以及加权末端缺口。由GCG序列分析软件包，例如，版本 7.0 (Devereaux 等人,Nuc.Acids Res.12:387-395 (1984)可获得 PILEUP。
[0058]适合测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一例子是BLAST和BLAST2.0 算法，其分别描述在 Altschul 等人，Nuc.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和Altschul 等人，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)中。进行 BLAST 分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)公开获得。通过在查询序列中识别长度W的短单字,该算法包括第一次识别高得分序列对(HSP)，当在数据库序列中比对相同长度的单字时，其匹配或满足一些正值阈值得分T。T称为相邻单字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始临近单字点击数用作开始寻找包含它们的更长HSP的种子。沿着各序列两方向延长单词点击数，直至可增加累积比对得分。使用参数M(—对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(不匹配残基的惩罚得分；总是〈0)对核苷酸序列计算累积得分。对于氨基酸序列，计分矩阵用于计算累积得分。当定量X由其获得的最大值下降至累积比对得分；由于一个或多个负值计分残余比对累积得分归零或者更低；或者到达各序列的末端时，在各方向中单字点击数的延伸中止。BLAST算法参数W、T和X测定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用11的字长(W)、期望值(E)或10、M=5、N4和两链的比较值作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长、10的期望值(E)、以及50的BL0SUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (1989))比对(B)、10 的期望值(E)、M=5、N=4以及两链的比较值。
[0059]BLAST算法也进行两序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin &Altschul, Proc.Nat’1.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787 (1993))。通过 BLAST 算法提供的相似性的一个测量值是最小和概率(P(N))，其提供两种核苷酸或氨基酸序列之间可偶然出现匹配的概率。例如，如果比较测试核酸与参照核酸的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，以及最优选小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。
[0060]两种核酸序列或多肽基本上相同的指示是通过第一核酸编码的多肽与相对如下所述通过第二核酸编码的多肽增加的抗体免疫交叉反应。因此，多肽与第二多肽通常基本上相同，例如，其中两种肽仅保守置换上不同。两种核酸序列基本上相同的另一指示是在如下所述严格条件下两种分子或它们的补体彼此杂交。两种核酸序列基本上相同的又一指示是可使用相同引物扩增序列。
[0061]短语“选择性(或特异性)杂交”是指当该序列存在于复合混合物中(例如，总细胞或文库DNA或RNA)时在严格杂交条件下仅结合、成双或杂交分子至特定核苷酸序列。通常，当在严格条件下两种分子或它们的补体选择性或特异性彼此杂交时，两种核酸序列称为“基本上相同”。
[0062]短语“严格杂交条件”是指通常在核酸的复合混合物中探针与它的靶序列、而不是其他序列杂交的条件。严格条件为序列依赖性以及在不同环境下不同。在较高温度下更长序列特异性杂交。对核酸的杂交更广泛的指导出现在Tijssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中。通常，在所定义的离子强度pH下选择严格条件为比特异性序列的热熔点(Tm)低约5-10°C。Tni是在平衡时50%的与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在所定义的离子强度、PH和核酸浓度下)(当在TmT存在的靶序列过量时，在平衡下占用50%的探针)。严格条件是其中在pH 7.0至8.3以及对于短探针(例如，10至50个核苷酸)至少约30°C以及对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60°C下盐浓度小于约1.0 M钠离子、通常约0.01至1.0 M钠离子浓度(或其他盐)的那些条件。添加诸如甲酰胺的去稳定剂也可达到严格条件。对于高严格杂交，正信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。示例性高严格或严格杂交条件包括:在42°C下50%甲酰胺、5xSSC和1% SDS孵育或者在65°C下5xSSC和1% SDS孵育，以及在65°C下0.2xSSC和0.1% SDS中洗涤。然而，可使用本领域已知的其他高严格杂交条件。
[0063]如果核酸编码的多肽基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的核酸也基本上相同。当例如使用通过遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时这种情况会出现。在这些情况下，核酸通常在中等严格条件下杂交。示例性“中等严格条件”包括在37°C下40%甲酰胺、I M NaCl,1% SDS的缓冲剂中杂交以及在45°C下在IxSSC中洗涤。正杂交是背景的至少两倍。本领域普通技术人员容易意识到，可利用可选择的杂交和洗涤条件以提供类似严格的条件。
[0064]I.引言:
产气荚膜梭状芽孢杆菌是产生毒素的 革兰氏阳性厌氧的产孢细菌，该毒素可导致在各种动物、人和家禽中的疾病症状和发病机理。
[0065]在美国，疾病控制和预防中心(Centersfor Disease Control and Prevention)(CDC)报道产气荚膜梭状芽孢杆菌为食物传播的疾病的第三种最常见原因，其经济消耗预估超过$1.2亿/年。据认为，制备差的肉和家禽是在人中产气荚膜梭状芽孢杆菌中毒的主要来源(参见例如，疾病控制和预防中心(O)C).Surveillance for foodbornedisease outbreaks - United States, 2006 以及遍册P Morb Mortal Vkly Rep.2009,58, 609-615)。
[0066]除了在人中导致食物传播的疾病之外，产气荚膜梭状芽孢杆菌也是家禽和家畜的重要病原。在鸡中，产气荚膜梭状芽孢杆菌是坏死性肠炎的病原体。坏死性肠炎是通常特征在于在家禽的小肠中坏疽病斑的急性或慢性肠原性毒血症。坏死性肠炎的临床征象包括例如可导致死亡的腹泻、脱水和饲料消耗降低。令人恐惧地，家禽生产商、严重急性案例可具有高达50%的死亡率。
[0067]亚临床感染也在家禽中作为亚临床感染损害家禽生产商，这可导致对诸如鸡的禽类的肠粘膜的损伤，从而导致降低的营养吸收、受限的重量增加以及增加的饲料转化比率。
[0068]坏死性肠炎通常受到添加至饲料的抗生素控制。然而，有在动物饲料中使用抗生素可导致在人细菌病原体之间抗菌素抗性的证据(参见例如,Chapin等人，(2005) Fundam.Applied Toxicol., 29: 1-17) ?而且,一些国家已经禁止在动物饲料中使用抗生素，即使这些国家因而经历梭菌坏死性肠炎的增加以及其他动物健康问题(参见例如，Casewell等人，(2003) Journal of Antimicrobial Chemotherapy 52, 159 — 16)。
[0069]因此，对于产气荚膜梭状芽孢杆菌的改善控制本领域有明确需求。而且，有开发可选择的抗微生物剂作为替代品或者补充当前使用的抗生素以控制在人和动物中产气荚膜梭状芽孢杆菌以及其他致病病原体的需求。
[0070]因此,在一不例性实施方案中，本发明提供分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌曬菌体裂解酶序列，包括但不限于氨基酸序列和核酸序列，其编码能够切割肽部分的酶以及从而导致产气荚膜梭状芽孢杆菌的裂解，该肽部分在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键处包含细菌肽聚糖细胞壁。因此，在本发明的一些示例性实施方案中，所公开的噬菌体裂解酶有效地控制产气荚膜梭状芽孢杆菌。
[0071]因此，在一示例性实施方案中，本发明提供使用本文所公开的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶来控制产气荚膜梭状芽孢杆菌的方法。
[0072]I1.分离噬菌体裂解酶和构建表达载体 A.一般方法
本发明利用重组体遗传学领域中常规技术。公开在该发明中使用的一般方法的基本文本包括 Sambrook 等人，Molecular Cloning—A Laboratory Manual (第二版)，1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ；Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);以及Current Protocolsin Molecular Biology (Ausubel等人编辑，1994))。除非另有说明，根据常规用途来使用技术术语。在分子生物学中常见术语的定义可在例如，Benjamin Lewin, Genes V,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew 等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A.Meyers (编辑)，Molecular Biology andBiotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers, Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
[0073]对于核酸，以千碱基(kb)或碱基对(bp)来给定尺寸。通常由测序的核酸、或公开的DNA序列的琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳得出评估值。对于蛋白，以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数来给定尺寸。由测序的蛋白、由衍生的氨基酸序列或者由公开的蛋白序列的凝胶电泳来评估蛋白尺寸 。
[0074]例如根据首先由Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯方法；使用如在Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168 (1984)中所述的自动合成器可化学合成无市售的寡核苷酸。寡核苷酸的纯化通过如Pearson & Reanier, J.Chrom.255:137-149 (1983)所述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或者通过阴离子交换HPLC。
[0075]在使用例如Wallace等人，Gene 16:21-26 (1981)的测序双链模板的链终止方法克隆之后可证实克隆基因和合成寡核苷酸的序列。
[0076]本文所公开的方法也可利用微生物学领域中常规技术。公开在该发明中使用的一般方法的基本文本包括例如ifeiAoofe for General and Molecular Microbiology,第3 版，C.A.Reddy 等人编辑，ASM Press (2008) Encyclopedia of Microbiology,第 2 版，Joshua Lederburg 编辑，Academic Press (2000)。
[0077]除非另有说明，根据常规用途使用技术术语。在微生物学中常见术语的定义可在例如，Cliffs Notes1.Edward Alcamo, Wiley (1996) !Encyclopediaof Microbiology, (2000)见上；Singleton 等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology (第2版，1994)中找到。在分子生物学中常见术语的定义可在例如，Benjamin Lewin, Genes V,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A.Meyers (编辑)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)中找到。
[0078]分离包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的核酸的方法
使用本领域技术人员已知各种方法中任一项可分离产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸，其可用于分离细菌核酸序列。例如，可由编码诸如26F裂解酶基因、390裂解酶基因等的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸基因的基因组DNA片段来分离产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸。在图2中显示示例性“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因”。在图4中显示另一示例性“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因”。术语“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因片段”或“产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因片段”是指一部分产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因，其小于基因的全部启动子和编码区。如下公开可制备编码诸如26F裂解酶和产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因片段的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的基因组片段。
[0079]在示例性实施方案中，使用标记的寡核苷酸探针由基因组DNA文库克隆包括产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸序列和相关核酸序列的核酸序列。在另一示例性实施方案中，使用扩增技术和标记的寡核苷酸引物由基因组DNA文库克隆包括产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸序列和相关核酸序列的核酸序列。
[0080]产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶核酸通常包含与在SEQ ID N0:2中所示核酸序列的核苷酸1-642或者在SEQ ID N0:4中所示核酸序列的核苷酸1-642相同、或显示基本序列同一性(如上定义)的序列。
[0081]因此，在严格杂交条件下产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶通常与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的核 酸序列的碱基对1-642杂交。
[0082]为了制备基因组文库，通常将DNA由目标组织提取以及机械剪切或酶消化以生成约15-20 kb的片段。然后通过梯度离心从将片段与非所需尺寸分离，并且构建在噬菌体λ载体中。如Sambrook等人，同上所述体外包装这些载体和卩遼菌体。如Benton和Davis,Science, 196:180-182 (1977)中所述通过噬斑杂交来分析重组体噬菌体。通常如在M.Grunstein 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA., 72:3961-3965 (1975)中所述来进行菌落杂交。例如在DNA印迹上通过与包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的标记的核酸探针杂交的能力来识别在基因组文库中编码产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因和/或产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因片段的DNA。通过本领域技术人员熟悉的标准方法来分离杂交DNA区域。参见例如，Sambrook等人，同上。
[0083]在示例性实施方案中，通过筛选具有标记的寡核苷酸探针的DNA文库来分离产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列，该标记的寡核苷酸探针具有源于由在图2，SEQ IDNO: 2中所示产气荚膜梭状芽孢杆菌CP26F噬菌体裂解酶的DNA序列的核苷酸1_642的序列。在另一示例性实施方案中，通过筛选具有标记的寡核苷酸探针的DNA文库来分离产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列，该标记的寡核苷酸探针具有源于在图4，SEQ IDNO:4中所示产气荚膜梭状芽孢杆菌CP390噬菌体裂解酶的DNA序列的核苷酸1_642的序列。
[0084]在又一示例性实施方案中，通过筛选和分析噬菌体基因组解析来分离产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列。
[0085]也可将本领域已知的其他方法用于分离包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的DNA片段。参见例如，SambiOok等人对DNA分离的其他技术的描述涉及已知序列的DNA分子。
[0086]产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的序列特征
全长噬菌体裂解酶通常包含约642个核苷酸。全长CP26F噬菌体裂解酶的序列作为SEQ ID N0:2显示在图2中。全长CP26F噬菌体裂解酶的序列作为SEQ ID N0:4显示在图4中。
[0087]本文所公开的CP26F和CP390噬菌体裂解酶具有高的整体序列相似性。然而，相似性不均衡地分布在序列长度内。例如，在C末端细胞壁结合结构域处所预期的蛋白氨基酸序列相同，而在N末端催化结构域处仅彼此共享56%同一性。具体而言，PlyCP390的残基164至213与编码细胞壁结合结构域的PlyCP26F的残基163至212相同。蛋白的可变N末端区域至位置162均为N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。
[0088]包含噬菌体裂解酶序列的载体的构建
一旦已经分离产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列，可使用各种方法构建表达盒、载体和其他DNA构建体。可以各种方式构建包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的表达盒。本领域技术人员充分意识到，遗传成分必须呈现在表达构建体/载体上以成功转化、选择和传播在宿主细胞中的表达构建体。操作编码产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的核酸的技术，例如亚克隆核酸序列至表达载体内、标记探针、DNA杂交等通常描述在Sambrook等人，同上中。
[0089]可将可操作连接异源性DNA序列的包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的DNA构建体插入各种载体内。通常，选择的载体是用于转化诸如大肠杆菌的细菌的表达载体。表达载体可以是质粒、病毒、粘粒、人工染色体、核酸片段等。通过使用本领域技术人员众所周知的重组体DNA技术可构建这些载体。然后可将包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的表达载体转染/转化至靶宿主细胞内。然后基于如下所公开的合适的标志物基因的存在来选择成功转化的细胞。
[0090]本领域技术人员可获得大量重组体载体以用于细菌和其他微生物的稳定转染(参见例如,Sambrook等人，同上)。通过本领域技术人员容易地选择恰当的载体。在示例性实施方案中，已知载体用于产生包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的表达构建体。
[0091]通常，转化载体包括可操作连接启动子序列的一种或多种克隆的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶基因(或cDNA)以及可选择标志物。这些转化载体通常也包括转录启动起始位点；对其表达控制为所期望的异源性核酸；核糖体结合位点；RNA加工信号；转录终止位点；和/或聚腺苷酸化信号。
[0092](1)调控元件
除产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列或其衍生物之外，如所公开制备的表达构建体可包含另外的元件。在示例性实施方案中，包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的表达构建体也包含增强子序列，使得可增强异源性蛋白的表达。如本领域所已知，通常在5’至转录的起始处发现增强子，通常可向前或向后定向将它们由5’或3’插入编码序列。
[0093](ii)标志物基因
如上所示，转化/表达载体通常包括可选择和/或可筛选的标志物基因以使得容易识别转化体。示例性可选择的标志物基因包括但不限于编码抗菌素抗性(例如，对卡那霉素、氨苄青霉素等抗性)的那些。示例性可筛选标志物包括例如在重组蛋白的C末端处引入的六个氨基酸组氨酸标签。
[0094]在示例性实施方案中，将可选择或可筛选的标志物基因采用作为、或者另外为目标特定基因以提供或增强识别转化体的能力。如本领域所知，“标志物基因”是赋予不同表现型至表达标志物基因的细胞的基因，使得转化的细胞可区别于不具有标志物的细胞。在一示例性实施方案中，标志物基因编码可选择标志物，其可通过例如经使用选择剂(例如，抗生素等)的化学方式来“选择”。另一示例性实施方案中，标志物基因编码可筛选标志物，其通过观察或测试来识别，例如通过“筛选”(例如，在重组蛋白的C末端处使用弓I入的六个氨基酸组氨酸标签)。
[0095]多种可选择的标志物基因是本领域中已知的(参见例如，Sambrook等人，同上)。
[0096](iv)其他载体组分
在一些不例性实施方案中，表达载体进一步包含接合表达的异源性核酸的编码序列的序列，将其由初始翻译产物中翻译后移除。在一示例性实施方案中，翻译后移除的序列便于蛋白转运至或通过细胞内或细胞外膜，从而便于蛋白转运至区室内和/或细胞外。在示例性实施方案中，翻译后移除的序列保护初生蛋白免于细胞内蛋白质降解。在一不例性实施方案中，将编码前导肽序列上游 以及在具有选择的编码序列的阅读框架中核酸片段用在宿主细胞中编码序列的重组体表达。
[0097]在另一示例性实施方案中，表达构建体包含细菌复制起点，例如ColEl起点。在又一示例性实施方案中，表达构建体/载体包含细菌可选择的标志物，例如，氨苄青霉素、四环素、潮霉素、新霉素或氯霉素抗性基因。
[0098]如本领域众所周知，表达构建体通常包含限制性核酸内切酶位点以便于载体构建。示例性限制性核酸内切酶识别位点包括但不限于限制性核酸内切酶No11、AatI1、SacII, PmeI HindII1、Pst1、EcoRI 和 BamHI 的识别位点。
[0099]宿主细胞、转化和选择技术
可将含有可操作连接诸如启动子序列的异源性DNA序列的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的DNA构建体用于转化细胞和产生分离的溶素肽。
[0100]使用包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶序列的表达构建体转化的示例性宿主细胞包括但不限于例如大肠杆菌。
[0101]通过本领域技术人员容易地选择合适的转化技术。本领域技术人员可获得的示例性转化/转染方法包括但不限于:电穿孔、氯化钙转化等，这些方法均是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook,同上)。
[0102]工业规模生产:批和连续发酵在不例性实施方案中，用于产气荚膜梭状芽孢杆菌曬菌体裂解酶的生产方法以工业规模进行。
[0103]通常，为了按比例增加培养能够产生用于工业规模生产的可分离量的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶微生物方法，首先将微生物的培养物按比例增加至中试规模(例如，0.07、0.8、19 m3)，以及然后至生产规模(例如，57 m3)。在一示例性实施方案中，能够产生在工业生产中按比例增加的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的微生物是大肠杆菌。
[0104]如技术人员理解，在不同环境和营养条件下需要大量发酵以找到特定生物过程按比例增加的最佳条件。
[0105]最佳化通常由摇瓶实验开始，然后按比例配在I至100升实验室规格生物反应器中(参见例如，Hebbar, K.P.等人(1997) Appl.Microbiol.Biotechnol.48\ 714-719;Tholudur, A.等人，Biotechnol.Bioeng.66:1 16 (1999))。为了减少最佳化所需实验次数，可使用数学模型(参见例如，Alvarez-Ramirez, J.等人，J.Chem.Technol.Biotechnol.74: 78 84 (1999) ；Βοοη, Μ.Α.等人，Biotechnol Bioeng.64: 558 567(1999) ；Cooney, M.J.等人，Biotechnol.Prog.15: 898 910 (1999) ；Tholudur A.等人，Biotechnol.Bioeng.66:1 16 (1999))。
[0106]通常基于维持在液体(肉汤)中恒定溶解的氧气浓度、而不取决于反应器尺寸来按比例增加微生物生长。此外，必须将温度、压力、PH和流速保持在非常特异的水平以确保最佳培养生长，因而最佳化诸如苯乙烯的产物的产生(参见例如，T.J.Bailey和 D.0llis, Biochemical Engineering,第 2 版，McGraw-Hill, New York, 1987 ；D.ff.Hubbard, L.R.Harris,和 M.K.ffierenga, Chem.Eng.Prog., 84 (8)，p.55(1988) ；D.C.WangFermentation and Enzyme Technology, Wiley, New York,(1979) ；H.Scott Fogler, Elements of Chemical Kinetics and Reactor Calculations,Prentice-HalI, New Jersey, (1974) !Encyclopedia of Bioprocess Technology,Flickinger, M.C.,和 Drew, S.ff.编辑 John Wiley & Sons (2008))。
[0107]如本领域众所周知，可将在发酵中混合工序的按比例增加分解为单独的、相关的步骤(参见例如，Oldshue, J.Y.(1966) Biotechnol.Bioeng.8: 3-24)。从而使得可单独考虑待评估的在气液吸收中混合、流体切变速率、共混和热转移的作用。因为生物反应器是三维的，所以本领域技术人员理解记住当线性尺寸增加时作为线性尺寸立方的体系容量增加的重要性。随着该按比例增加，其他变量以不同指数在线性比例上增加，该指数可由负数至零、至三和更高变化。
[0108]待考虑的其他 因素包括但不限于:对剪切应力的控制,如果它太大,可导致在培养物中细胞裂解。因此，需要仔细平衡细胞、营养素和氧气的按比例增加和彻底混合。此外，细胞可聚集，其造成维持营养物供应和废物移除的问题。
[0109]可获知该公开以及本领域中知识的熟练技术人员能够测定和最佳化本文所公开方法使用的大规模发酵工序。在示例性实施方案中，本工序采用发酵的批方法(参见例如，Cinar, A.等人(2003) Batch Fermentation: Modeling, Monitoring, and ControlCRC Press) 0在另一示例性实施方案中，本工序采用连续发酵方法(参见例如，美国专利
4,748, 123 ；Karkare, S.B 等人(1985)沿o/7fecA/?o7oF3，247 - 251)。
[0110]控制产气荚膜梭状芽孢杆菌的方法在一些示例性实施方案中，本文所公开的噬菌体裂解酶用于治疗被产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的包括人的动物。可使用任何合适的施用途径来施用噬菌体裂解酶，包括但不限于:口服、气溶胶或递送至肺的其他装置、鼻腔喷雾剂、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、阴道、直肠、局部、腰椎穿刺、鞘内以及直接施用至脑和/或脑脊膜。以下本文公开一些示例性用途。
[0111]O表面消毒剂:
在一些示例性实施方案中，使本文所公开的噬菌体裂解酶与以下已知表面消毒剂联合，例如:(i)各类防腐剂，例如但不限于苯甲酸和BHT;以及(ii)与噬菌体相容的各种消毒剂，例如但不限于季铵化合物。
[0112]抗生素
在示例性实施方案中，与已知抗微生物剂(包括抗生素和化疗剂)联合使用本文所公开的噬菌体裂解酶，包括但不限于例如万古霉素、乳链菌肽、达氟沙星和新霉素。
[0113]表面活性剂
在示例性实施方案中，本文所公开的噬菌体裂解酶与已知表面活性剂联合使用以及将其用于处理食物加工设备。表面活性剂有助于润湿表面，使得将噬菌体裂解酶分布在各表面上；以及有助于增溶和去除脏污。示例性表面活性剂包括例如吐温80、20和81以及Dobanol ο
[0114](iv)包含噬菌体裂解酶的家畜饲料的配制
在示例性实施方案中，制备包含作为添加剂的噬菌体裂解酶的动物饲料配制物。 [0115]在一些示例性实施方案中，通过例如将本文所公开的噬菌体裂解酶包含在饲料产品中将它们用于治疗动物。用作递送噬菌体裂解酶的媒介物的特定饲料产品对于本领域技术人员显而易见。
[0116]在一些示例性实施方案中，噬菌体裂解酶是冻干的形式，随后将其添加至饲料配制物。据估计曬菌体裂解酶的施用剂量为约40mg/kg/天至约100 mg/每kg/每天的范围。在其他示例性实施方案中，据估计噬菌体裂解酶的施用剂量为约50 mg/每kg/每天。在其他示例性实施方案中，据估计噬菌体裂解酶的施用剂量为约60 mg/每kg/每天。在其他示例性实施方案中，据估计噬菌体裂解酶的施用剂量为约70 mg/每kg/每天。在其他示例性实施方案中，据估计噬菌体裂解酶的施用剂量为约80 mg/每kg/每天。在其他示例性实施方案中，据估计噬菌体裂解酶的施用剂量为约90 mg/每kg/每天。施用噬菌体裂解酶直至达到成功控制产气荚膜梭状芽孢杆菌，例如直至产气荚膜梭状芽孢杆菌的量基本上降低。
[0117]尽管对于不同家畜品种配制不同配制物，但在示例性实施方案中，将饲料配制物配制为适合向家禽喂食。
[0118]术语饲料或饲料组合物意思是适合于、或旨在由诸如家禽的动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。在示例性实施方案中，将本文所公开的噬菌体裂解酶直接添加至饲料中。在其他示例性实施方案中，将本文所公开的噬菌体裂解酶用于生产基本上添加至饲料(或在处理工序中使用)的诸如饲料添加剂或预混物的一种或多种中间体组合物。
[0119]提供以下例子以说明、但不限制本发明。
实施例
[0120]实施例1:以下例子示出产气荚膜梭状芽孢杆菌的噬菌体裂解分离。
[0121]细菌宿主、噬菌体分离和增殖
将产气荚膜梭状芽孢杆菌分离菌39和26用作由在雅典当地，GA鸡加工设施处0.45 Mm经过滤的内脏洗涤物(offal wash) (O)或鸡粪便(F)中获得的噬菌体增殖的宿主。宿主菌株的特征在于标准方法和16S序列分析(Collins等人，1994 ;Wise和Siragusa, 2005)。在由家禽(肠物质)、土壤、污水和家禽加工排放水中获得的过滤样品上进行产气荚膜梭状芽孢杆菌的噬菌体裂解的初始筛选。通过易受分离的噬菌体影响的菌株的抽样试验和滴定来识别能够裂解产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌株的细菌病毒。使用经厌氧箱培养的产气荚膜梭状芽孢杆菌分离菌39和26宿主细菌(Wise和Siragusa, 2005)，通过标准工序(Ackermann和Nguyen，1983)来增殖产气荚膜梭状芽孢杆菌特异性噬菌体CP390和CP26F。使噬菌体经过三次噬斑纯化的循环以及使其一直悬浮在TMGS (IOmM Tris，pH 8，IOmM Mg++, 0.55%NaCl, 0.1%明胶)中。随后，在用于病毒纯化和DNA提取的厌氧条件下利用平板裂解方法(Helms等人，1985)来增殖噬菌体CP390和CP26F。
[0122]噬菌体的纯化，基因组DNA纯化和电子显微镜术。通过两种方法来纯化依照布达佩斯条约的规定于2010年6月23日保存在美国模式培养物保藏所(ATCC)以及指定保藏名称PTA-11081的噬菌体CP390以及依照布达佩斯条约的规定于2010年6月23日保存在美国模式培养物保藏所(ATCC)以及指定保藏名称PTA-11080的噬菌体CP26F的基因组DNA。在进行厌氧箱中平板裂解之后(参见例如，Helms等人，(1985) DNA.4:39-49)，使用Qiagen? λ噬菌体DNA分离材料来纯化噬菌体基因组DNA。此外，通过以4190 x g离心20分钟来从平板裂解物纯化噬菌体以去除细菌碎片以及低熔点琼脂糖。通过以103，800 X g离心90分钟、随后在 I ml TBS(在pH 7.5下20 mM Tris, 500 mM NaCl)中悬浮，将澄清的上清液用于沉淀病毒。在15至55%蔗糖-TBS梯度内分层噬菌体混悬物以及在Beckman?JS 24.38转子中以103,800 x g离心90分钟。收集噬菌体带；通过离心浓缩；以及将混悬的沉淀置于20%至50%连续酒石酸钾梯度(Misra等人，1981)以及在Beckman? JS 24.15转子中以105，000 X g离心90分钟。将噬菌体带由梯度中提取；稀释在TBS中，并且在Beckman? JS 24.15转子中以105，000 x g离心90分钟，随后在TBS中混悬。通过本领域已知方法的电子显微镜术来检查噬菌体的纯度。在0.1%十二烷基肌氨酸钠和0.2 M EDTA的存在下使曬菌体沉淀经过蛋白酶K (20mg/ml)消化，随后经苯酹-氯仿提取(Sambrook等人，同上)以获得通过乙醇沉淀的基因组DNA。
[0123]实施例2:
以下例子示出分子克隆、测序、基因组DNA的注解和系统发生分析。
[0124]在进行噬菌体基因组DNA的纯化之后，在260/280 nm下对核酸进行分光光度计读数以及限制性内切酶消化，随后为琼脂糖凝胶电泳以评估纯度(Sambix)Ok等人，同上)。通过MWG Biotech, Inc High Point, NC USA来完成噬菌体基因组的全长基因组测序。简而言之，使用喷雾器将噬菌体基因组DNA剪切，使其钝端修补和脱去磷酸(Sambrook等人，1989)。在转化之后将所需尺寸(I至4 kb)的DNA片段钝端连接至pSmart (Lucigen?)以用于大肠杆菌的增殖。测序克隆物，使得为基因组获得约14倍冗余，该基因组包括引物步移以填充缺口(Fouts等人，2006)。也使用限制酶历fldllIjcoRljcoRVdJwI和Clal完成分子克隆以切割噬菌体基因组DNA，随后使用Taq聚合酶处理(Lewis等人，1992)，并且克隆(Mead等人，1991)至TOPO TA载体(Invitrogen?)内。此外，为了克隆限制酶片段至pSmart载体(Lucigen?)内以用于核苷酸测序而完成端修复和G-加尾。完成使用荧光标记的双脱氧法核苷酸终止剂的双链核苷酸测序反应，以及使用自动化的序列分析仪来测定序列(Smith 等人，1986; Applied Biosystems Inc.)。
[0125]使用IntelliGenetics Genefforks 2.5.1? (IntelliGenetics, Mountain View,CA)、MacVector 7.2? (Accelrys, San Diego, CA)和 DNASTAR? (Madison, WI)软件来进行核苷酸序列编辑、分析、氨基酸序列的预测以及比对。使用原核生物(http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark; Lukashin 和 Borodovsky.1998)的 GeneMark.hmm 以及ORF Finder (http://ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)软件来预测在最终基因组序列的开放阅读框(ORF)。通过使用BLAST (Altschul等人，1990)和PS1-BLAST或BLASTP(Altschul 等人，1997; Schaffer, 2001)以及保留的结构域数据库(Marchler-Bauer,2007)算法针对蛋白数据库来检索预测的蛋白氨基酸序列。经使用Parsimony (PAUP*4.0b;Swofford, 2001)软件的系统发生分析来构建在蛋白序列之间的系统发生关系。通过2000引导程序复制(Hedges，1992)来评估所有系统发生关系。利用大末端酶蛋白以预测DNA包装机制和病毒粒子端的结构(Casjens等人,2005)。
[0126]实施例3:
以下例子示出分离的CP390 (PTA-11081)和CP26F (PTA-11080)噬菌体的病毒粒子纯化、二维电泳和蛋白质组分析。
[0127]二维(2D)凝胶电泳的纯化的病毒粒子样品制备。通过添加四体积的冷(_20°C )丙酮至少一小时至离心的噬菌体沉淀来完成噬菌体蛋白纯化。在4°C下以16，000 X g离心在丙酮中的可溶性蛋白馏分10分钟。在冷丙酮/水(4:1)中将沉淀洗涤三次，随后离心，并且真空下干燥(Champion等人,2001; Lee和Lee, 2003)。为了确保可再生凝胶电泳,在37°C下根据生厂商说明书(New England BioLab?)使用N-糖苷酶F (PNGase F)将纯化的病毒粒子蛋白馏分消化Ihr以在使用丙酮萃取之前从N连接的糖蛋白(Maley等人，1989)中切割低聚糖。此外，按照“2-D凝胶提纯”进一步纯化在初始提取之后获得的水丙酮沉淀以去除干扰物质，例如盐、 清洁剂、脂质或酚醛树脂(Amersham?)。
[0128]将蛋白样品混悬在电泳缓冲剂(5M脲，2M硫脲，2% CHAPS, 2% SB3-10,具有40 mMTris的0.2% 3/10两性电解质，pH 7.4)。使样品涡旋，随后在22°C下以16，000 x g离心10 mirio通过如施用至细菌的二维(2-D)凝胶电泳(O’ Farrell, 1975)来完成蛋白质组学分析(Champion等人，2001; Lee和Lee, 2003)。将蛋白混悬在裂解物缓冲剂中，随后等电聚焦(pH 3-10)在第一维度中，随后为 SDS-PAGE (O’Farrell, 1975; Bjellqvist 等人，1993)。使用PDQuest版本7.3.0 (Bio-Rad, Hercules, CA)以一式三份由各分离菌在Bio-Rad VersaDoc 4000成像器分析凝胶上定性完成斑点测定和图案匹配。由肽质谱分析指纹识别提取的2-D凝胶和蛋白取芯目标蛋白斑点。使用BioRad EXQuest斑点切割器来切割斑点以及使用 Genomic Solutions Proprep 来消化(Finhout 和 Lee, 2003)。
[0129]通过质谱分析对纯化的噬菌体蛋白的识别。利用通过MALD1-T0F-T0F MS(Aebersold等人，1987; Lahm和Langen, 2000)获得的胰蛋白酶肽分子质量以通过检索在国家生物技术信息中心，具有ProFound的PIR和Swiss-Prot (Proteomics, NY, NY)处蛋白序列Mascot数据库以及来自噬菌体基因组的预测氨基酸序列来识别蛋白。具体而言，准备样品以及使用来自Millipore的ZipTipu_C18点样在MALDI (激光解析电离(MatrixAssisted Laser Desorption 1nization))革巴上。抽吸样品并且分散于 ZipTipu_C18,并且使用含有5mg/ml MALDI基质(α -氰基-4-羟基肉桂酸)的调节溶液(70% ACN, 0.2%甲酸)来洗脱，将0.5μ1点样至MALDI靶上。
[0130]使用具有T0F/T0F光学器件的Applied Biosystems 4700蛋白质组学分析器来分析样品。使用842.51和2211.10的m/z的胰蛋白酶自溶产物作为内标物在700至4000的m/z范围中收集MALD1-MS数据。使用Applied Biosystems GPS探测器软件来分析数据。使用ABI 4700 MALDI T0F/T0F (Applied Biosystems)来收集所有质谱数据。收集在反射器模式中700 - 4000道尔顿的质量范围的数据以及平均各质谱的1250激光发射。如果存在胰蛋白酶自溶的842.51和2211.10离子，则将各样品进行内部校准。如果均未发现两离子，则仪器使用默认校准。将不在排除列表上来自MS分析的八种最强离子进行MS/MS。对于MS/MS分析，使用各光谱平均5000激光发射，质量范围为70至具有-1至3道尔顿的先驱窗的先驱离子。将数据保存在Oracle数据库。
[0131]由Oracle数据库选出肽数据以及通过GPS探测器软件(Applied Biosystems)从由ABI 4700生成的原始数据来产生峰列表。该峰列表基于信噪比过滤以及排除列表，并且包括去同位素。然后通过Mascot (Matrix Science)检索结果文件。如果将样品内部校准则使用20 ppm的公差以及如果应用默认校准则为200 ppm公差。通过以下标准来验证蛋白识别:在所有MS离子上以及在至少两种MS/MS光谱中所有离子上大于20 ppm质量准确度，其未被修改，必须进行说明。数据库检索参数包括I缺失的切割、蛋氨酸的氧化和半胱氨酸的脲基甲基化。
[0132]实施例4
以下例子示出噬菌体溶素基因的PCR克隆。通过本领域已知方法设计扩增引物以扩增噬菌体CP26F溶素和噬菌体CP390溶素基因，同时引入用于亚克隆的限制酶位点至测序和表达载体内(参见例如，Pritchard, D.G等人(2004) Microbiology150:2079-2087.;Donovan, D.Μ.等人，(2006) Appl.Environ.Microbiol.72:2988-96)。对于克隆基因至pet2Id内，将纯化的phiCP26F DNA用作模板以及使用引物plyCP26F卿Y (5，TAC CAT GGT GAT AAT TGG AAG TAG ATA T 3，[SEQ ID NO:5])和plyCP26F-plyCP390en (5，GTG GTG CTC GAG TAT CTT TTC GGC AAA GCA AT 3，[SEQID N0:6])扩增。在正向和反向引物中分别对AfcoI和通ol限制位点划下划线。对于克隆plyCP390基因至pet2Ia内，将纯化的phiCP390 DNA用作模板以及使用引物plyCP390expF (5，GCA CTA CAT ATG AAA ATA GCT TTA AGA GGT GGA 3’ [SEQ ID NO:7])取plyCP26F-plyCP390ejR (5，GTG GTG CTC GAG TAT CTT TTC GGC AAA GCA AT 3’[SEQID N0:8])来扩增。在正向和反向引物中分别对#而1和通ol限制位点划下划线。使用旋转柱(Qiagen ? )来纯化PCR产物以及使用AfcoI和ZAoI iplyCP26F)或者和ZAoI(plyCP390)来消化。将消化的PCR产物经旋转柱纯化以及分别使用类似消化的载体pet21d和pet21a分别来连接。然后使用大肠杆菌Top 10细胞(Invitrogen ? )来转化所得构建体。通过直接核苷酸测序使用各限制酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的分离的质粒消化来筛选转化体。然后将在表达的正确定向中含有基因的质粒转化至大肠杆菌Rosetta 2 (DE3)菌株内。[0133]因此，使用具有寡核苷酸引物的纯化噬菌体基因组DNA作为模板来PCR扩增编码噬菌体内溶素PlyCP390和PlyCP26F的基因，该寡核苷酸引物包括Met起始和终止位点以包括C末端His-标签。
[0134]将扩增产物克隆至测序和表达质粒内以及转化至大肠杆菌内。因为产气荚膜梭状芽孢杆菌是革兰氏阳性生物体，利用Rosetta菌株来基因表达，如本领域所知，这些细菌也含有提供合适tRNA基因的质粒以减轻当在大肠杆菌中表达异源性蛋白时密码子偏倚(参见，例如，Kane, (1995) Curr.0pin.Biotechnol.6:494-500)。对于Met 起始点完整，而将ATG并入起始位点引物，由于在初始基因中N末端氨基酸编码预测蛋白中Val。
[0135]克隆的噬菌体DNA的初始核苷酸测序证实编码具有各噬菌体内溶素的预定氨基酸序列的蛋白的内溶素基因的存在。然后将基因表达为C末端、His-标签的蛋白，然后通过N1-柱层析来纯化。通过凝胶电泳来分析纯化的蛋白，其导致两种蛋白可检测，该两种蛋白各自具有对应接近25，000的分子尺寸的相对流动性。在进行斑点试验之后含有表达的溶素和纯化的蛋白的大肠杆菌裂解物能够在汇合的产气荚膜梭状芽孢杆菌的板上产生清楚的“斑块”。
[0136]实施例5
以下例子示出噬菌体溶素的表达、提取制备和蛋白纯化。
[0137]将以上实施例4所述具有质粒构建体的大肠杆菌Rosetta 2 (DE3)细胞在37C下振荡条件下补充以100Pg/ml氨节青霉素和34 Pg/ml氯霉素的200ml Lurea Bertani (LB)肉汤中增殖。将对数中期(0.4至0.6的0D_J培养物置于冰上30分钟，随后使用ImM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)孵育，然后在20C下振荡条件下孵育18小时。在4C下以5000 X g将培养物离心20分钟。将细胞沉淀在_80°C下冷冻。使沉淀在冰上解冻以及悬浮在4ml的裂解缓冲剂中(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，IOmM咪唑，10%甘油，pH 8)。然后将混悬物声波处理(15 X 5秒脉冲以及在脉冲之间置于冰上15秒)以及在4C下以5000 X g离心30分钟。将所得上清液 用作澄清的裂解物。根据生产商说明书(Qiagen, Valencia,CA)将I ml的N1-NTA (镍基质)浆料加入澄清的裂解物，伴随在4C下轻微振荡I小时。然后将浆料填充至柱中，以及使得经重力流动通过。使用4ml的洗涤缓冲剂(在pH 8.0下50mM NaH2P04,300mM NaCl，20mM咪唑，10%甘油)将柱子洗涤两次以及使用2ml样品缓冲剂(在 pH 8.0 下 50mM NaH2P04, 300mM NaCl,250mM 咪唑，10% 甘油)洗脱。
[0138]实施例6
以下例子示出噬菌体溶素蛋白的生物化学特征。
[0139]使用Qubit突光仪(Invitrogen, Carlsbad, CA)来测定如以上实施例5中所述制备的样品中蛋白浓度。根据生厂商的说明书，使用在120V下在Tris-1fepes-SDS缓冲剂中在BioRad Min1-PROTEAN三种凝胶装置中4-20%精确蛋白凝胶(Pierce, Rockford,IL)试验I小时来分析洗脱的蛋白和Kaleidoscope?蛋白标准品(Invitrogen, Carlsbad,CA)(参见例如，Hames, B.D.(1981) An introduction to polyacrylamide gelelectrophoresis.在:B.D.Hames 和 D.Rickwood (编辑)，Gel Electrophoresis ofproteins: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.第 1-91 页)。使用 CoomassieBrilliant Blue R-250 (BioRad, Hercules, CA)染色凝胶I h,在蒸懼水中洗漆过夜,并且拍照。
[0140]通过Edman降解直接氨基酸测序纯化的重组体噬菌体溶素。通过过滤通过ProSorb装置(ABI)来将样品施加至PVDF。通过本领域已知方法在ABI Procise 492 HT序列分析仪上使用标准脉冲液体循环来进行测序(参见例如，Niall, H.D.(1973) Meth.Enzymol.27: 942 - 1010)。此外，使用如本领域已知一些修订形式通过质谱分析来测定蛋白序列(参见例如，Hunt 等人，(1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.83:6233-7;Rosenfeld, J.等人，(1992) Anal.Biochem.203: 173-179)。使用 ABI 4700 蛋白质组学分析器 MALDI T0F/T0F 质谱仪(Applied Biosystems, CA)、使用 4000 Series 探测器软件V.3.6来收集所有质谱数据。将数据由Oracle数据库提取以及通过GPS探测器软件V3.6 (Applied Biosystems)由ABI 4700生成的原始数据来产生峰列表。如组合MS + MS/MS来进行分析。
[0141]抽取SDS-PAGE的单频带以及使其接触N末端氨基酸序列，并且通过如上所讨论的质谱分析来分析。两种技术均证实蛋白的初始氨基酸序列如所预测为各克隆基因的核苷酸序列。噬菌体溶素的BLAST分析产生预测为N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶或MurNAc-LAA (也称为肽聚糖氨基水解酶，NAMLA酰胺酶，NAMLAA，酰胺酶3，以及肽聚糖酰胺酶；EC 3.5.1.28)的各蛋白，其为水解在细菌细胞壁糖肽中介于N-乙酰胞壁酰基和L-氨基酸之间的酰胺键的自溶素(参见例如，Vollmer等人(2008) FEMS Microbiol Rev.32:259-86)。
[0142]溶素基因由两种噬菌体克隆，该两种噬菌体具有限制产气荚膜梭状芽孢杆菌的单种分离菌的宿主范围。总之，该两种噬菌体的基因组共享大于95%序列相似性。如之前所示，尽管在C末端细胞壁结合结构域处在两基因组、溶素的预测蛋白氨基酸序列之间高整体序列相似性相同，但在N末端催化结构域处仅55%彼此类似(图5)。尤其，PlyCP390的残基164至213与PlyCP26F的残基163至212相同。蛋白的可变N末端残基至位置162预测为N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。而且，PlyCP390和PlyCP26F与报道的艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile) 而不是产气荚膜梭状芽孢杆菌的公开的噬菌体酰胺酶类型溶素更加紧密相关。然而，因为说明种属特异性的蛋白的细胞壁结合结构域不同于艰难梭状芽胞杆菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌，所以预期艰难梭状芽胞杆菌的酰胺酶类型溶素不会裂解产气荚膜梭状芽孢杆菌。
[0143]但是，BLAST分析揭示在各种其他革兰氏阳性细菌的基因组中编码的紧密相关预测蛋白的存在。
[0144]实施例7
以下例子示出使用斑点和混浊度试验来测试分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体溶素活性能力。
[0145]使用本领域已知方法将表达噬菌体溶素的纯化的重组蛋白或大肠杆菌裂解物用于测定分离的溶素在细菌平板上裂解产气荚膜梭状芽孢杆菌的能力(参见，例如，Zimmer等人，2002 ;DonoVan等人，(2006)同上)。通过在时间内监控光密度(OD6ciciJ的变化来测定由于源于噬菌体的溶素活性所致靶细胞裂解的混浊度降低(Zimmer等人，2002 ；Donovan等人，2006)。使祀细胞在脑心浸液(BHI)肉汤(Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ)中生长至对数中期(OD6tltlnm 0.4-0.6)以及在赖氨酸缓冲剂A(LBA 50mM乙酸铵，IOmM CaCl2,ImM DTT, pH 6.2)中浓缩至OD6tltlnm-1.0。在各孔中使用344 μ I的靶细胞混悬物和处理样品中10 μ I的纯化肽2.5 μ g)以及对照样品的10 μ I缓冲剂，在96孔微量滴定板中完成测试。在37C下孵育I小时之后记录OD6tltlnm的改变。在计算活性之前，仅将在细胞样品中变化值从具有溶素的样品中减去(在OD6tltol mg蛋白―1 HiirT1中变化值)。
[0146]对源于噬菌体的溶素活性的作用。如在混浊度测试中所述，但使用冰醋酸或氢氧化铵来调节LBA的pH来测定源于噬菌体的溶素对pH应答的活性(Yoong等人，2004)。将具有最高活性的PH任意设置为100%，并且在其他pH值下活性相对该最佳活性来表示。
[0147]混浊度测试和重组体溶素的pH范围。将重组体裂解酶用于测定在混浊度测试中产气荚膜梭状芽孢杆菌的裂解(图2)。在混浊度降低测试中重组体噬菌体裂解酶能够裂解产气荚膜梭状芽孢杆菌的胃肠外噬菌体宿主菌株以及十三种细菌的其他分离菌。即，PlyCP390能够裂解依照布达佩斯条约的规定于2010年8月13日保存于美国模式培养物保藏所(ATCC)以及指定保藏名称PTA-11265的宿主Cp39以及依照布达佩斯条约的规定于2010年8月13日保存于美国模式培养物保藏所(ATCC)以及指定保藏名称PTA-11264的宿主Cp26，同时如果利用分离菌Cp26或Cp39则PlyCP26F可降低混浊度。尽管在它们的氨基酸序列中预测N末端酶区域55%不同是事实。在一小时孵育时间段之后通过在BHI (脑心浸液)琼脂平板上在可变产气荚膜梭状芽孢杆菌中至多3 log cfu/ml降低来完成混浊度的降低。尽管经过裂解测定所有产气荚膜梭状芽孢杆菌分离菌，但没有酶能够裂解梭状芽胞杆菌的其他成员。PlyCP26F的最佳pH范围为5.5至9.9，而PlyCP390的pH最大值为8.2。
[0148]应理解，本文所述例子和实施方案仅为说明目的，以及鉴于其的各种修订形式和变化均由本领域技术人员建议，并且这些修订形式和变化均涵盖在该申请的精神和范围内以及在所附权利要求的范围内。
【权利要求】
1.一种分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶， 其特征在于， 所述噬菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及 其中， 所述噬菌体裂解酶活性导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。
2.权利要求1所述的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述噬菌体裂解酶包含具有与SEQ ID NO:1有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。
3.权利要求2所述的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述噬菌体裂解酶具有根据SEQ ID NO:1的序列。
4.权利要求1所述的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述噬菌体裂解酶包含具有与SEQ ID NO:3有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。
5.权利要求4所述的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述噬菌体裂解酶具有根据SEQ ID NO:3的序列。
6.权利要求1所述的分离的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述噬菌体裂解酶由产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体分离，所述产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体是选自具有ATCC保藏名称PTA-11081的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP390以及具有ATCC保藏名称PTA-11080的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP26F的成员。
7.—种编码产气荚膜梭状芽孢杆菌曬菌体裂解酶的分离的核酸分子， 其特征在于，所述噬 菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及 其中， 所述噬菌体裂解酶活性导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。
8.权利要求7所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子是选自编码具有与SEQ ID NO:1有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽的分离的核酸以及编码具有与SEQ ID NO:3有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽的分离的核酸的成员。
9.权利要求8所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽。
10.权利要求8所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽。
11.一种有效针对产气荚膜梭状芽孢杆菌的抗微生物组合物，其包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶， 其特征在于， 所述噬菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及 其中， 所述噬菌体裂解酶活性导致产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌细胞的裂解。
12.权利要求11所述的抗微生物组合物，其特征在于，所述噬菌体裂解酶包含具有与SEQ ID NO:1有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。
13.权利要求12所述的抗微生物组合物，其特征在于，所述噬菌体裂解酶是SEQIDNO:1。
14.权利要求11所述的抗微生物组合物，其特征在于，所述噬菌体裂解酶包含具有与SEQ ID NO:3有至少约90%同一性的氨基酸序列的肽。
15.权利要求14所述的抗微生物组合物，其特征在于，所述噬菌体裂解酶是SEQIDNO:3。
16.权利要求11所述的抗微生物组合物，其特征在于，所述噬菌体裂解酶由产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体分离，所述产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体是选自具有ATCC保藏名称PTA-11081的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP390以及具有ATCC保藏名称PTA-11080的产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体CP26F的成员。
17.—种包含产气荚膜梭状芽孢杆菌噬菌体裂解酶的动物饲料， 其特征在于， 所述噬菌体裂解酶是选自CP26F溶素和CP390溶素的成员，以及 其中 所述噬菌体裂解酶在家畜中以有效地控制产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的量存在。
18.权利要求 17所述的动物饲料，其特征在于，所述家畜是鸡。
【文档编号】C12N15/56GK103443269SQ201180041872
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2011年8月17日 优先权日:2010年9月1日
【发明者】布鲁斯·S·希尔, 格雷戈里·R·希拉古萨, 伊本·穆斯塔法·A·西蒙斯, 乔娜·K·加利什, 大卫·M·多诺万 申请人:美利坚合众国，由农业部长代表