专利名称：人精氨酸酶和定点聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种精氨酸酶，以及其制备方法和在治疗与精氨酸酶相关的疾病中的应用。具体的，本发明提供了一种点突变的精氨酸酶及其制备方法和在治疗与精氨酸酶相关的疾病中的应用。本发明还提供了一种位点特异性聚乙二醇化的精氨酸酶及其制备方法和应用。
背景技术：
精氨酸是一种哺乳动物包括人的重要氨基酸，参与各种生理过程，包括细胞增殖和生长。例如，精氨酸可作为潜在信号分子氧化氮(NO)合成的直接前体。NO作为一种精神递质，平滑肌松弛剂和血管扩张剂而起作用。NO的生物合成涉及由氧化氮合酶催化的Ca++及NADPH-依赖性反应。精氨酸的另一个作用是作为多胺、亚精胺或精胺的前体，参与不同的生理过程。有研究发现，精氨酸低于8μ M水平时，癌细胞发生不可回复的细胞死亡(Srorr&Burton,1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30，50)。通过研究对细胞生长的影响发现，将精氨酸移除后正常细胞系会由细胞周期的GO期进入静止状态，且能在这种环境下存活几周而无明显损伤；当精氨酸浓度恢复正常时，细胞又能开始恢复正常的生理周期；而对于肿瘤细胞来说，精氨酸的匮乏会导致其经过细胞周期Gl期的‘R’点进入S期，并很快凋亡。这种由于精氨酸匮乏而导致肿瘤细胞的凋亡是不可逆的。因此，科学家们开始考虑通过控制机体中精氨酸的水平来对肿瘤，尤其是营养缺陷型肿瘤如肝癌和黑素瘤进行治疗。现今这种方式已被用来研究各种肿瘤细胞的抑制。精氨酸酶是催化水解L-精氨酸生成鸟氨酸与尿素的反应的酶，一般含于产生尿素的动物(哺乳类、板鳃鱼类、两栖类、海龟类)的肝脏、肾脏、精巢中，作为尿素循环的一个环节而起作用。精氨酸酶是 催化哺乳动物尿素循环途径中尿素形成最终步骤的酶，将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。在大多数哺乳动物中，人精氨酸酶家族包括精氨酸酶I和精氨酸酶II。精氨酸酶I主要在肝脏细胞表达，精胺酸酶II在肾脏和红细胞表达为主。通过两种方法可以得到精氨酸酶，一是从产生它的生物体中分离出来，另一种是通过基因工程技术重组得到。通过基因工程技术重组生产精氨酸酶存在其优越性。例如，实验证明，大肠杆菌可以生产大量的精氨酸酶。然而，通过基因工程技术重组生产精氨酸酶有时会存在技术难题，例如，酶活性较低，或在体内的稳定性差及半衰期短，无法应用于实际临床。US7951366B2公开了一种利用精氨酸剥夺来治疗人恶性肿瘤的药物组合物及方法。其中使用了带有his-tag的重组人精氨酸酶I，通过分子量为5，000 (MW5，000)的聚乙二醇对精氨酸酶N-端或表面氨基酸中带有氨基的基团共价偶联聚乙二醇修饰，修饰后的人精氨酸酶的稳定性增加，在人血清中的半衰期为3天。US20100247508A1中对带有his_tag的人精氨酸酶进行了改造，将168和303位半胱氨酸替换为丝氨酸，并利用分子量为20KDa的聚乙二醇对人精氨酸酶进行修饰。但是，与US7951366B2公开的重组人精氨酸酶I相同，该精氨酸酶带有额外的多肽片段如His_tag。而大部分国家的药物管理机构不建议使用这些多肽片段，例如中国国家食品药品监督管理局在“人用重组DNA制品质量控制技术指导原则”中提出以简化生产工艺为目的在产品中引入额外的多肽片段如His-tag，在最终产品中应尽可能去除。WO 2011/008495A2公开了在保留人精氨酸酶本身所带有的三个半胱氨酸的基础上，在N端第三个氨基酸的位置加入了一个半胱氨酸残基，然后利用分子量为20KDa的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺对加入一个半胱氨酸残基的人精氨酸酶进行修饰。但该人精氨酸酶本身所带有的三个半胱氨酸仍然存在，形成的PEG化人精氨酸酶的产物不均一且产率低，难于分离纯化。因此，本领域需要一种更好的精氨酸酶或其衍生物，用于治疗与精氨酸相关的疾病或异常。
发明内容
本发明提供一种分离和基本纯化的精氨酸酶。精氨酸酶是催化哺乳动物尿素循环途径中尿素形成最终步骤的酶，将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。在大多数哺乳动物中，精氨酸酶家族包括精氨酸酶I和精氨酸酶II。对各种来源的精氨酸酶I进行了测序和活性研究发现，不同来源的精氨酸酶I的序列可能有所区别，但也具有很多保守的区域和活性位点。如 Haraguchi, Y.等，1987,Proc.Natl.Acad.Sc1.84,412-415 中报道的，野生型人精氨酸酶I具有SEQ ID N0.1的氨基酸序列，其中具有三个半胱氨酸，分别位于SEQ ID N0.1氨基酸序列的第45，168和303位，其基因具有如SEQ ID N0.2的核酸序列。本发明中，术语“分离”是指非天然的形式。术语“基本上纯化”是指可能存在用于生产和/或修饰蛋白质的其它成分，但所述其它成分占整个产物基本不存在或比例较小。本发明中对氨基酸序列位点的描述是本领域技术人员常用的。例如，“在序列为SEQ ID SEQ X上的第45位”或“在序列为SEQ ID SEQ x上的第45位Cys (即半胱氨酸)”或表述“ Cys45”具有相同或相近的含义，都是表示在氨基酸序列上第45位氨基酸，或第45位的半胱氨酸。在本发明的一个方面，本发明提供了一种突变的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶为人精氨酸酶I，其具有(I)对应于SEQ ID NO I的氨基酸序列，并且其中第45，168和303位的半胱氨酸中的一个、两个或三个发生突变，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有精氨酸酶的活性。在本发明的一个方面，本发明的精氨酸酶中所述半胱氨酸突变为非极性氨基酸。氨基酸根据侧链基团的性质可分为极性氨基酸和非极性氨基酸。氨基酸的侧链基团不带电荷或极性极微弱的属于非极性氨基酸，如:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。在本发明的其中一个方面，本发明的精氨酸酶中所述半胱氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸。优选的，本发明的精氨酸酶中所述半胱氨酸突变为丙氨酸。在本发明中，出乎意料地发现，人精氨酸酶I序列中属于非电离极性氨基酸的半胱氨酸突变成属于非极性氨基酸性质的氨基酸(例如丙氨酸)后，酶活性明显增加。其中一种可能是突变的精氨酸酶与底物之间的结合能力增强。在本发明的一个方面，本发明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第45，168和303位的半胱氨酸中的一个发生突变。在本发明的其中一个方面，本发明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第303位半胱氨酸突变，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更优选的，突变为丙氨酸。在本发明的一个方面，本发明的精氨酸酶在所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的任意两个发生突变。在本发明的其中一个方面，本发明的精氨酸酶在SEQ IDN0.1的氨基酸序列上的第45位和第303位半胱氨酸突变，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更优选的，突变为丙氨酸。在本发明的其 中一个方面，本发明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第168位和第303位半胱氨酸突变，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更优选的，突变为丙氨酸。在本发明的其中一个方面，本发明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第45位和第168位半胱氨酸突变，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更优选的，突变为丙氨酸。在本发明的其中一个方面，本发明的精氨酸酶在SEQ ID N0.1的氨基酸序列上的第45位、第168位和第303位半胱氨酸突变，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，更优选的，突变为丙氨酸。 本发明的精氨酸酶具有比野生型精氨酸酶更强的活性。本发明的精氨酸酶的特异性活性一般为至少大约500U/mg,优选至少大约700U/mg,最优选至少大约800U/mg。本发明的精氨酸酶一般具有比野生型精氨酸酶更强的活性。在本发明的一个方面，本发明的精氨酸酶具有SEQ ID N0.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中至少一个编码对应于SEQ ID N0.1氨基酸序列第45，168和303位的半胱氨酸的碱基序列发生替换。优选的，其中的一个、两个或三个编码半胱氨酸的碱基序列发生替换。氨基酸是由多核苷酸编码的。多核苷酸中的信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基叫做一个“密码子”，亦称三联体密码。在本发明的一个方面，所述碱基的替换是由TGT替换为编码甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的碱基序列，优选的，替换为编码丙氨酸的碱基序列。在本发明的其中一个方面，编码丙氨酸的碱基序列为GCT，GCC, GCA, GCG，优选为GCT。在本发明的一个方面，本发明提供了制备上述精氨酸酶的方法，其包括将精氨酸酶基因或突变后的精氨酸酶基因在可表达蛋白的宿主中进行表达。本发明的制备精氨酸酶的方法通常包括以下主要步骤。通过PCR或合成的方法获得目的基因或目的核苷酸片段。将带有目的基因的DNA片段连接到能够独立复制并具有选择标记的载体上，如质粒、噬菌体和病毒等，以形成重组DNA分子。DNA片断与载体的连接方式主要有同聚末端连接、粘性末端连接、平齐末端连接及人工接头分子连接。重组DNA必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达。根据载体的性质不同，可采用转染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。合适的基因工程宿主是本领域公知的，可以是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。本发明还提供一种分离和基本纯化的聚乙二醇化(Pegylation)的精氨酸酶,其特征在于，所述聚乙二醇化是位点特异性的。本发明聚乙二醇化的精氨酸酶中聚乙二醇分子与精氨酸酶分子上的特定氨基酸残基发生共价结合，达到位点特异性聚乙二醇化的目的。在本发明的聚乙二醇化的精氨酸酶中，每个精氨酸酶分子与至少一个聚乙二醇分子结合，形成聚乙二醇化的精氨酸酶。在本发明的一个方面，本发明聚乙二醇化的精氨酸酶中的精氨酸酶是前文描述的突变的精氨酸酶。在本发明的一个方面，本发明提供了一种聚乙二醇化的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶为人精氨酸酶I，其具有(I)对应于SEQ ID NO I的氨基酸序列，并且其中第45，168和303位的一个或两个半胱氨酸发生突变，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有精氨酸酶的活性。在本发明的一个方面，本发明的聚乙二醇化的精氨酸酶中所述半胱氨酸点突变为非极性氨基酸。20种蛋白质氨基酸在结构上的差别取决于侧链基团的不同。氨基酸的侧链基团不带电荷或极性极微弱的属于非极性氨基酸，如:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。在本发明的其中一个方面，所述聚乙二醇化的人精氨酸酶I的序列不具有用于纯化此蛋白的标签序列， 例如在其C末端或N末端加入His-tag序列。HiS-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，它的优点是纯化方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱纯化。但是由于其潜在的免疫原性，中国国家食品药品监督管理局在“人用重组DNA制品质量控制技术指导原则”中提出以简化生产工艺为目的在产品中引入额外的多肽片段如His-tag，在最终产品中应尽可能去除。在本发明中，对精氨酸酶的聚乙二醇化可以通过化学修饰的方法实现，所述化学修饰可以通过带有偶联剂的聚乙二醇衍生物(也称为聚乙二醇修饰剂)，将聚乙二醇分子与精氨酸酶上的基团共价结合。所述化学修饰可以是特异性的，即通过使用与特定基团结合的偶联剂，令PEG只能与精氨酸酶上的特定氨基酸结合。定点PEG化修饰需遵循以下原则:(1)尽量避免蛋白质活性部位的修饰，以防对蛋白质活性发生影响；(2)尽量简化整个过程，是其具有可控性。普通的聚乙二醇分子两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基的聚乙二醇(mPEG)。在多肽和蛋白质的聚乙二醇修饰中研究最多的聚乙二醇修饰剂是mPEG的衍生物。其中一种常见的聚乙二醇修饰方式是将聚乙二醇分子/聚乙二醇修饰剂与蛋白表面赖氨酸或蛋白N-端的ε -ΝΗ2或α -ΝΗ2结合，例如mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)，mPEG_丙酸琥珀酰亚胺酯(mPEG_SPA)，mPEG_琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG_SS)，mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)，mPEG-戊二酸单酯-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG_SG)，mPEG-酰胺-琥珀酸亚胺酯(mPEG-NHS)，mPEG-三氟乙基磺酸酯(mPEG tresylate)和mPEG-醛(mPEG aldehyde)。另外常见的PEG修饰方式是利用巯基的高亲核性，选取能够特异性与蛋白质的巯基偶联的聚乙二醇分子/聚乙二醇修饰剂，如mPEG-马来酰亚胺，mPEG-邻-卩比唳-二硫醚，mPEG-乙烯基砜，mPEG-碘乙酰胺等来修饰蛋白质或多肽的巯基基团。由于蛋白质或多肽的巯基比较少，较易形成均一性产物。人精氨酸酶I单体有三个半胱氨酸残基，分别位于氨基酸序列当中的45，168和303位。在本发明的一个方面，所述聚乙二醇化的精氨酸酶在其第45，168和303位的一个或两个半胱氨酸位点发生定点聚乙二醇化。在本发明的一个方面，所述定点聚乙二醇化通过对精氨酸酶的半胱氨酸进行基因工程定点突变，然后进行半胱氨酸特异性聚乙二醇化修饰实现。在本发明的又一个方面，所述半胱氨酸特异性聚乙二醇化修饰是通过使用甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺偶联剂将PEG与精氨酸酶上的半胱氨酸的巯基基团共价结合。在本发明的一个方面，把本发明的精氨酸酶中不需要PEG化的一个或两个半胱氨酸点突变，优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更优选突变为丙氨酸。PEG分子量的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。已有的研究发现，修饰的蛋白药物在体内的作用时间与偶联的PEG数量和分子量有一定关系。用于本发明的PEG，其分子量范围可以在5K-40K道尔顿之间，可能是线性的或者含支链的分子，以及可能是本领域述及的PEG衍生物。本发明中共价结合至精氨酸酶分子的PEG分子并非限定于特定类型。在本发明的一个方面，对精氨酸酶进行PEG化的PEG分子的平均分子量为20K、30K或40K。PEG化蛋白通过静脉注射的方式进入体内，聚乙二醇的平均分子量大小会影响其在血清的半衰期。研究发现，肾脏对PEG分子的清除取决于肾小球的滤过速率。对于蛋白质，肾小球可以滤过分子量小于70KDa的蛋白质分子；对于PEG来说，肾小球可以滤过分子量小于30KDa的PEG分子。PEG的分子量其对要结合的蛋白的半衰期和活性的影响通常是不可预测的，与蛋白的分子量、作用方式、活性部位、PEG结合位点等密切相关。在本发明的其中一 个方面，所述聚乙二醇化的精氨酸酶在SEQ ID N0.1定义的氨基酸序列第45位和第168位两个位点发生定点聚乙二醇化，优选的，其中所述定点聚乙二醇化通过将所述精氨酸酶的第303位半胱氨酸突变实现，其中所述PEG的平均分子量为20K或30K。其中，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更优选突变为丙氨酸。在本发明的一个方面，所述的聚乙二醇化的精氨酸酶在SEQ ID N0.1定义的氨基酸序列第168位发生定点聚乙二醇化，其中所述定点聚乙二醇化通过将所述精氨酸酶的第45位和第303位半胱氨酸突变实现，其中所述PEG的平均分子量为40K。其中，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更优选突变为丙氨酸。在本发明的一个方面，所述聚乙二醇化的精氨酸酶在SEQ ID N0.1定义的氨基酸序列第45位发生定点聚乙二醇化，其中所述定点聚乙二醇化是通过将精氨酸酶的第168位和第303位半胱氨酸突变实现，其中所述PEG的平均分子量为40K。其中，所述半胱氨酸优选突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更优选突变为丙氨酸。
本发明提供的聚乙二醇化的精氨酸酶的纯度通常超过超过70%，优选超过80%，最优选为90%。本发明中所述“聚乙二醇化的精氨酸酶的纯度”是指在对精氨酸酶进行聚乙二醇化的化学修饰生产中，产物里PEG化精氨酸酶(即共价结合PEG的精氨酸酶)占总的精氨酸酶(共价结合PEG的精氨酸酶，未共价结合PEG的精氨酸酶和多聚的PEG化精氨酸酶)的比例。通常，由于PEG化反应后产物中还含有未共价结合PEG的精氨酸酶和多聚的PEG化精氨酸酶，因此需要对产物进行纯化。常用的纯化手段是本领域公知的技术，包括阳离子交换柱等。本发明提供的聚乙二醇化的精氨酸酶在血液或血清中的半衰期为至少0.5天，优选至少2.5天，最优选至少3.5天。精氨酸酶的半衰期可以通过本领域公知和常用的方法进行测量。精氨酸酶在血液或血清中的半衰期的测量数据与采用的动物模型有一定关系。在代谢速率较快的动物模型(例如大鼠)中获得的半衰期数据通常比在代谢速率较快的动物模型(例如人体)中获得的数据短。本发明还提供了制备聚乙二醇化(Pegylation)的精氨酸酶的方法。所述聚乙二醇化是位点特异性的。本发明聚乙二醇化的精氨酸酶中聚乙二醇分子与精氨酸酶分子上的特定氨基酸残基结合，达到位点特异性聚乙二醇化的目的。在本发明的聚乙二醇化的精氨酸酶中，每个精氨酸酶分子与至少一个聚乙二醇分子结合，形成聚乙二醇化的精氨酸酶。在本发明中，对精氨酸酶的定点聚乙二醇化可以通过化学修饰的方法实现，所述化学修饰是通过使用偶联剂将PEG与精氨酸酶上的基团共价结合。所述化学修饰可以是特异性的，即通过使用与特定基团结合的偶联剂，令PEG只能与精氨酸酶上的特定氨基酸结
八
口 ο本发明还提供了 利用上述本发明的任意一种精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶或其药物组合物在治疗与精氨酸酶有关的疾病的药物中的应用/用途。本领域已知所述与精氨酸酶有关的疾病包括，例如哺乳动物中与体内精氨酸相关的病症/疾病/紊乱。此类病症/疾病/紊乱包括:高精氨酸血症。由于精氨酸酶活性的缺乏，患者体内的精氨酸不能裂解为尿素并加入鸟氨酸代谢循环，血中精氨酸含量可高出正常7 10倍，同时脑脊液和尿中精氨酸也增多，尿中肌酐排出量增高。另外，此类病症/疾病/紊乱还包括精氨酸依赖性的细胞增生或肿瘤，例如肝癌，黑色素细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌和白血病。。通过研究对细胞生长的影响发现，将精氨酸移除后正常细胞系会由细胞周期的GO期进入静止状态，且能在这种环境下存活几周而无明显损伤，当精氨酸浓度恢复正常时，细胞又能开始恢复正常的生理周期；而对于增生的细胞或肿瘤来说，精氨酸的匮乏会导致其经过细胞周期Gl期的‘R’点进入S期，并很快凋亡。这种由于精氨酸匮乏而导致增生的细胞或肿瘤是不可逆的。因此，科学家们开始考虑通过控制机体中精氨酸的水平来治疗细胞增生或肿瘤。本发明还提供了一种药物组合物，此药物组合物的活性成分是上述本发明的精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶。所述药物组合物的配方可以以固体、溶液、乳剂、分散体、胶束、脂质体等形式应用，其中所得配方含有一或多种本发明的人精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶作为活性成分，并与适于肠道或胃肠外应用的有机或无机物载体或赋形剂混合。另外，可以使用佐剂、稳定剂、增稠剂、着色剂及香料。一或多种分离的并基本上纯化的人精氨酸酶或聚乙二醇化的精氨酸酶的活性成分也包括在足够量的药物配方中以对目的过程、条件或疾病产生所希望的作用。上述药物组合物可以制成适于口服的药剂形式，例如，片齐IJ、药片、止咳糖、水化或油化悬液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软的胶囊、或糖浆。口服的配方可以按照本领域已知技术进行包囊化以减缓分解以及在胃肠道的吸收，因而提供了较长时间的持续作用。所述配方还可以是无菌的可注射溶液或悬液的形式。所述悬液可以是按照已知方法使用分散或润湿剂及悬浮剂进行配制。本发明的药物组合物可进一步被制备成固体、液体、悬浮液、微胶粒、或微脂体的形式。在本发明的一个方面，所述药物组合物的配方是适用于口服或注射的形式。
图1示出野生型人精氨酸酶I的核酸序列。图2示出人精氨酸酶表达的还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。图3示出人精氨 酸酶表达的液相色谱图。图4示出野生型精氨酸酶I经还原及非还原处理后凝胶电泳检测结果。图5示出纯化后的精氨酸酶I突变体(rhArg1-A303, rhArgI_A168/303,及rhArg1-A45/303)经还原及非还原处理后凝胶电泳检测结果。图6示出纯化后的精氨酸酶I突变体(rhArg1-A45/168，及rhArg1-A45/168/303)经还原及非还原处理后凝胶电泳检测结果。其中6a为rhArgI_A45/303,及rhArgI_A45/168/303经非还原处理后凝胶电泳检
测结果。其中6b为rhArgI_A45/168,及rhArgI_A45/168/303经还原处理后凝胶电泳检测
结果图7示出聚乙二醇化人精氨酸酶的非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。
具体实施例方式本发明将在下面的实施例中进一步说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于所附权利要求书的范围内。实施例一:不含His-tag的人精氨酸酶I重组质粒pET30a (+)-rharginase-V的构建及表达人精氨酸酶I的基因序列公布于1987年(Haraguchi, Y.等，1987, Proc.Natl.Acad.Sc1.84,412-415)。以人肝脏 5’stretch plus cDNA 文库(clontech)为模板，基于上述人精氨酸酶I的基因序列设计引物进行聚合酶链式反应(PCR)获得人精氨酸酶I核酸片段。引物ARG-V(+)含有一个Ndel限制性内切酶位点，引物ARG-V㈠含有一个Xhol限制性内切酶位点，按照分子生物学领域普通实验技术进行聚合酶链式反应(PCR)得到核酸片段，并以琼脂糖凝胶电泳确认。将上述扩增所得片断和市购获得的pET30a(+)表达载体分另1J用含有限制性内切酶Ndel和Xhol (购自promega)的反应介质中于37°C处理1.5小时，已酶解的片断与T4DNA连接酶在16°C反应过夜。然后将所述已连接的质粒转化入感受态细胞DH5ci大肠杆菌细胞内。在含有30 μ g/ml卡那霉素的LB营养琼脂平板上进行筛选。通过限制性内切酶分析获得具有正确插入片断的质粒，称为pET30a(+) -rharginase-V,所述质粒进行测序确认其插入片段。插入片段包含969个碱基，如图1所示，其核酸序列为SEQID N0.2。ARG-V (+):5' GGAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG3/NdelARG-V (-):5' CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAGG3'Xhol实施例二:不含His-tag的人精氨酸酶I重组质粒pET30a (+)-rharginase-V的表达和目的蛋白纯化将100 μ I BL21 (DE3)感受态细胞置于冰上融化，向感受态细胞悬液中加入I μ I所述已构建的pET30a(+)-rharginase-V质粒，混勻后冰浴放置30分钟,然后将混合物于42°C水浴放置90秒，再快速转移至冰浴中放置2分钟。加入500 μ I LB液体培养基，于37°C，150rpm震荡培养I小时。取200 μ I涂布含有卡那霉素的LB营养琼脂平板，37°C倒置培养16小时。挑选所述转化细胞培养平板单一菌落并转移到25mL LB培养基。所述细胞在370C，150rpm震荡培养至0D600nm达到0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM IPTG诱导表达3小时。SDS-PAGE电泳检测所挑选克隆是否有目的蛋白的表达。挑选表达量较高的克隆制备甘油菌保存作为工程菌。将上述大肠杆菌工程菌在15L发酵罐中以分批补料的方式培养，当0D600nm达到12-13时，加入终浓度为0.2mM IPTG诱导表达3_4小时。将所获得的菌体进行破菌离心，取上清液进行下一步的分离纯化。蛋白的纯化采用CM阳离子交换层析。先用Tris-HCl平衡液平衡层析柱，然后将所述离心得到的上清液上样，上样完毕后继续用3倍柱体积的平衡液冲洗弱结合的杂质。待UV280nm检测值稳定后，用含有Tris-HCl及NaCl的洗脱液进行洗脱，收集目的峰。对收集的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高压液相色谱分析纯度。实验结果如图2，3所示。图2是人精氨酸酶表达的凝胶电泳检测结果。其中各泳道的样品为:1:蛋白分子量标准；2.破菌上清液；3.纯化的不含His-tag的人精氨酸酶I ;4.CM阳离子交换柱流出液。
图3是人精氨酸酶表达的液相色谱图。根据图2和图3可见，经上述层析方法所获得的精氨酸酶的纯度为90%以上。实施例三:人精氨酸酶I (rhArgl)的定点突变以野生型人精氨酸酶质粒pET30a-rharginasel_V为模板,利用Stratagene公司的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit 对人精氨酸酶 I 序列中 45,168,和 303 位编码半胱氨酸的密码子分别进行单点，双点或三点定点突变，将45，168，和303位编码半胱氨酸的密码子(TGT)替换成编码丙氨酸的密码子(GCT)。引入45，168，和303位替代酸密码子(GCT)的引物分别为:ARG-m45 (+):5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGATTATGGGG3'ARG-m45 (-):5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTAAGTTTCTC3'ARG-ml68 (+):5' GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAGGATATTG3'ARG-ml68 (-):5' CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAGGAGAATC3'ARG-m303 (+):5' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCGGACTTGCTCGGG3'ARG-m303 (-):5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCAAC3'按照试剂盒说明书所提供的方法进行聚合酶链式反应(PCR)，然后以限制性内切酶Dpn I消化模板质粒，及转化感受态细胞。将获得的重组突变质粒测序确认。测序结果经比对后选择半胱氨酸的密码子(TGT)成功突变成丙氨酸的密码子(GCT)的克隆，接种于LB液态培养基扩增。以Wizard Plus Minipreps试剂盒,抽提突变重组质粒。突变的人精氨酸酶I (rhArgl)序列中303位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A303;168位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A168 ;45位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A45 ; 168和303位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A168/303 ；45和303位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A45/303 ；45和168位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A45/168 ;45，168和303位半胱氨酸替换为丙氨酸的重组人精氨酸酶I表示为rhArg1-A45/168/303 ;含有上述突变的人精氨酸酶I (rhArgl)序列的重组突变质粒分别称为 pET30a (+)-rhArg1-A303, pET30a(+)-rhArg1-A168, pET30a(+)-rhArg1-A45,pET30a(+)-rhArg1-A168/303, pET30a(+)-rhArg1-A45/303, pET30a(+)-rhArg1-A45/168,或pET30a(+)-rhArg1-A45/168/303。将100 U I BL21 (DE3)感受态细胞置于冰上融化，向感受态细胞悬液中加入I U I所述已构建的突变重组质粒，混匀后冰浴放置30分钟，然后将混合物于42°C水浴放置90秒，再快速转移至冰浴中放 置2分钟。加入500 u I LB液体培养基，于37°C，150rpm震荡培养I小时。取200iil涂布含有卡那霉素的LB营养琼脂平板，37°C倒置培养16小时。挑选所述转化细胞培养平板单一菌落并转移到25mL LB培养基。所述细胞在370C，150rpm震荡培养至0D600nm达到0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM IPTG诱导表达3小时。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测所挑选克隆是否有目的蛋白的表达。挑选表达量较高的克隆制备甘油菌保存作为工程菌。实施例四:含定点突变精氨酸酶I (rhArgl)质粒的表达和纯化将上述转化了突变人精氨酸酶I(rhArgl)质粒的大肠杆菌工程菌(包括pET30a(+)-rhArg1-A303, pET30a(+)-rhArg1-A168/303, pET30a(+)-rhArg1-A45/303,pET30a (+) -rhArg1-A45/168,或 pET30a (+)-rhArgI_A45/168/303)在 15L 发酵罐中以分批补料的方式培养，当0D600nm达到12-13时，加入终浓度为0.2mM IPTG诱导表达3_4小时。将所获得的菌体进行破菌离心，取上清液进行下一步的分离纯化。目的蛋白的纯化采用CM阳离子交换层析。先用Tris-HCl平衡液平衡层析柱，然后将所述离心得到的上清液上样，上样完毕后继续用3倍柱体积的平衡液冲洗弱结合的杂质。待UV280nm检测值稳定后，用含有Tris-HCl及NaCl的洗脱液进行洗脱，收集目的峰，由此获得定点突变的精氨酸酶 I rhArgI_A303, rhArgI_A168/303, rhArgI_A45/303,rhArg1-A45/168,或 rhArgI_A45/168/303。对收集的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高压液相色谱分析纯度。经上述层析方法所获得的精氨酸酶的纯度为90%以上。实施例五:定点突变精氨酸酶I (rhArgl)的活性通过测定与尿素酶和谷氨酸脱氢酶相偶联的NADPH的吸光度值测定精氨酸酶的活性，其原理如下所示，NADPH被氧化成NADP+，前者在340nm处有最大吸收峰，测定在该波长下吸光率的降低，再根据NADPH的摩尔消光系数ΛΕ340 = 622(^1^1,即可计算出精氨
酸酶的活性。
权利要求
1.一种精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶为人精氨酸酶I，其由SEQID N0.1定义的氨基酸序列中第45，168和303位的半胱氨酸中的一个、两个或三个突变为非极性氨基酸。
2.权利要求1所述的精氨酸酶，其中所述第45，168和303位的半胱氨酸独立优选的，突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，最优选的，突变为丙氨酸。
3.权利要求1或2所述的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的一个发生突变，优选的，第303位半胱氨酸突变，更优选的，突变为丙氨酸。
4.权利要求1-3中任一项所述的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的任意两个发生突变，例如第45位和第303位半胱氨酸突变，第168位和第303位突变，或第168位和第45位突变，优选突变为丙氨酸。
5.权利要求1-3中任一项所述的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的第45位、第168位和第303位半胱氨酸突变，优选突变为丙氨酸。
6.一种聚乙二醇化的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶为人精氨酸酶I，所述聚乙二醇化是位点特异性的，在由SEQ ID N0.1定义的氨基酸序列中的第45，168和303位的一个或两个半胱氨酸位点发生聚乙二醇化。
7.权利要求6所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述定点聚乙二醇化是通过对精氨酸酶上不进行聚乙二醇化的一个或两个半胱氨酸位点对半胱氨酸进行基因工程定点突变为其它氨基酸，然后对突变后的精氨酸酶进行半胱氨酸特异性聚乙二醇化修饰实现。
8.权利要求7所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述点突变是将精氨酸酶的半胱氨酸突变为非极性 氨基酸，优选的，突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，最优选的，突变为丙氨酸。
9.权利要求6-8中任一项所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述PEG的平均分子量为 20K、30K 或 40K。
10.权利要求6-9中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述精氨酸酶在血液或血清中的半衰期为至少0.5天，优选至少2.5天，最优选至少3.5天。
11.制备权利要求1-5中任一项的精氨酸酶或权利要求6-10中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶的方法。
12.权利要求1-5中任一项的精氨酸酶或权利要求6-10中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶在治疗与精氨酸酶有关的疾病的药物中的用途，优选的，所述疾病选自高精氨酸血症和精氨酸依赖性的细胞增生或肿瘤，例如肝癌，黑色素细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌或白血病。
13.一种治疗与精氨酸酶有关的疾病的药物组合物，其中含有权利要求1-7中任一项的精氨酸酶或权利要求6-10中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述疾病选自高精氨酸血症和精氨酸依赖性的细胞增生或肿瘤，例如肝癌，黑色素细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌或白血病。
全文摘要
本发明提供了一种点突变的精氨酸酶及其制备方法，以及所述点突变的精氨酸酶在制备治疗与精氨酸酶相关的疾病的药物中的用途。本发明还提供了一种位点特异性聚乙二醇化的精氨酸酶及其制备方法，以及所述聚乙二醇化的精氨酸酶在制备治疗与精氨酸酶相关的疾病的药物中的用途。
文档编号C12N11/08GK103184208SQ20121006960
公开日2013年7月3日 申请日期2012年3月16日 优先权日2011年12月27日
发明者郑宁民, 陈丽 申请人:拜奥生物科技(上海)有限公司