一种Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法

专利名称：一种Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因打靶动物模型的制备方法，特别涉及一种Prestin基因突变并能较好的模拟人类耳聋疾病的小鼠模型的制备方法。
背景技术：
哺乳动物的耳蜗(Cochlea)是内耳的一个解剖结构，它和前庭迷路一起组成内耳 骨迷路，其核心部分为柯蒂氏器(Organ of Corti)，负责将来自中耳的信号转导送到相应的神经中枢。自耳蜗底端至顶端的全长范围内平行排列着四列毛细胞，他们规则地分布于基底膜上。其中靠近耳蜗中心的一列称为内毛细胞(Inner hair cells)，远离中心的三列称为外毛细胞(Outer hair cells),两类毛细胞的顶部都有若干列静纤毛(Stereocilia)。哺乳动物的听力极为敏感，这是由于耳蜗的一种特殊放大功能，这种放大结构存在于耳蜗外毛细胞中，如果没有这种放大功能，哺乳动物将听不到任何声音。关于哺乳动物耳朵是如何放大声音的，可以追溯到50-60年前。最初人们以为内耳基底膜随着声音振动完全是被动的。直到1948年英国人Tommy Gold用实验证明这种被动振动理论无法成立。他认为被动振动产生的振动幅度不可能使人听到声音，故提出哺乳动物耳中必定有放大器存在[参见Gold T. Hearing. II. The physical basis of theaction of cochlea. Proc. R. Soc. B, 1948. 135 :492-498.]。上世纪五十年代后期，匈牙利人Georg von Bekesy发现了这种生物放大器的具体位置是在基底膜和传入神经之间，S卩外毛细胞的解剖位置[参见Von Bekesy G. Experiments in hearing. McGraw-Hill, I960.]。Georg von Bekesy也因为此项成果获得了 1961年度的Nobel生理学奖。随后的30年间，关于耳蜗外毛细胞是如何放大声音的，存在着两种不同的观点。一种观点以美国西北大学前任校长Peter Dallos教授为代表，认为声音扩增是由外毛细胞胞体来完成的[参见Dallos P. The active cochlea. J. Neurosci.，1992. 12 4575-4585.];另一种观点由美国科学院院士洛克菲勒大学James Hudspeth教授提出，认为声音放大是由外毛细胞顶端静纤毛来完成的[参见Hudspeth J,Putting ion channelsto work mechanoelectrical transduction, adaptation, and amplification by haircells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000. 24 :11765-11772.]。双方各有一定的实验数据支持。1985年瑞士日内瓦大学的William Brownell教授发现了耳蜗基底膜上的外毛细胞胞体有电动现象，即随着细胞内外膜电位的变化，外毛细胞胞体会发生振荡(伸长和缩短)，这种电动现象只在哺乳动物的外毛细胞中存在[参见=Brownell WE, Bader CR，Bertrand D, et al. Evoked mechanical responses of isolated cochlear outer haircells. Science, 1985. 227 :194-196.]。由于后来发现外来声音振动会首先引起外毛细胞内外膜电位的变化，从而声音放大的电动学说被提出外来声音引起耳蜗基底膜的轻微振动，改变了外毛细胞的内外膜电位，这种电位差作用于外毛细胞胞体上某种电动蛋白，这种电动蛋白可使外毛细胞产生振荡(伸长和缩短)，外毛细胞的这种振荡可将基底膜的振动放大 100 倍[参见Geisler CD. A cochlear model using feedback from motile outerhair cells. Hear Res. , 1991. 54 :105-117.及 Geisler CD, Sang C. A cochlear modelusing feed-forward outer-hair-cell forces. Hear Res, 1995. 86 :132-146.和 RuggeroMA,Rich NC. Furosemide alters organ of corti mechanics evidence for feedback ofouter hair cells upon the basilar membrane. J. Neurosci,1991. 11 :1057-1067.]。从1985年后的15-20年间，科 学界一直在寻找这种能引起声音放大的电动蛋白，并提出了不同的候选基因。2000年，一种叫Prestin的基因被克隆，它的各种体外实验结果最符合外毛细胞电动蛋白的特征[参见Zheng J, Shen ff, He DZ, et al. Prestin is themotor protein of cochlear outer hair cells. Nature,2000. 405 :149-155.]。但Prestin到底是不是外毛细胞中放大振动的电动蛋白，需要体内实验来验证。为此Science专门发表一篇评论文章，认为通过基因敲除可以证实Prestin是否为科学界寻找多年的放大蛋白[SM=ChoA-What' s Shakin' in the Ear Science，2000. 288 :1954-1955.]。随后，世界各国多个实验室同时开展了对Prestin基因敲除的工作。Gao等人率先完成了 Prestin基因敲除工作,然后与哈佛大学Charles Liberman教授实验室合作，对Prestin基因敲除小鼠进行了一系列分析，证明了 Prestin就是科学界寻找了多年的电动蛋白。该成果发表于2002年的Nature上，并作为该期重点文章刊登[参见=LibermanMO, Gao J*, He DZ, et al. Prestin is required for electromotility of the outerhair cell and for the cochlear amplifier. Nature,2002.419 :300-304. *Eaqualfirst authors.]。此项研究成果解决了科学界探索了 50-60年的关于声音是如何被放大的难题。这篇Prestin基因敲除的文章，受到科学界的广泛认可[参见G6l6oc G, HoltJ. Auditory amplification outer hair cells pres the issue.Trends Neurosci.,2003.26 :115-117.]。然而，另一种声音放大学说的代表美国科学院院士洛克菲勒大学James Hudspeth教授等持不同的观点，他们认为耳蜗外毛细胞顶端上的静纤毛在声音振动后也能运动，在声音放大中，静纤毛除了能帮助打开离子通道，产生膜电位外，肯定也有放大振动的作用；并且提出静纤毛运动在放大振动中起关键作用，外毛细胞胞体运动只不过是将静纤毛调整到最佳运动位置[参见Ricci AJ, Crawford AC, FettiplaceR.Active hair bundle motion linked to fast transducer adaptation in auditoryhair cells. J. Neurosci. ,2000.20 :7131-7142.及 Choe Y, Magnasco MO, Hudspeth AJ. Amodel for amplification of hair—bundle motion by cyclical binding of Ca2+tomechanoelectrical-transduction channels.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 95 15321-15326.和 Fettiplace R. Active hair bundle movements in auditory haircells. J. Physiol.，2006. 576 :29-36.]。为了解决外毛细胞胞体振荡与其顶端静纤毛运动在声音放大中的关系，Gao等人根据前人体外实验的结果，设计了一组共3个关键氨基酸(Cluster 1，Cl)的点突变，用基因敲入的方法，制成了一种遗传工程小鼠，从这种小鼠的实验数据得出结论是Prestin主导的胞体振荡在声音放大中起决定的作用，并不是JamesHudspeth教授等认为的那样只是调整静纤毛的位置。该成果发表于2007年的PNAS上[参见Gao J, Wang X, Wu X, et al. Prestin-based outer hair cell electromotility inknockin mice does not appear to adjust the operating point of a cilia—basedamplifier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2007. 104 :12542-12547.]，从而使外毛细胞胞体电动放大学说和顶端静纤毛运动放大学说30年的争论划上了句号。到目前为止，耳蜗外毛细胞声音放大及Prestin功能的基础研究已取得了很大进展，下一步的研究重点转向了 Prestin与人类疾病的关系，因为基因功能研究工作的最终目的是为了服务于人类的健康。Prestin作为听力放大的核心基因，与人类耳聋疾病密切相关。关于Prestin在人类中的突变致聋已有文献报道。2003年在第2内含子和第3外显子(ATG)交汇处一种点突变(IVS2-2A/G)被发现，它处于Prestin mRNA剪切有关的区域[参见Liu X, Ouyang X, Chen Z. Prestin, a cochlear motor protein, is defective innon-syndromic hearing loss. Hum. Mol. Genet. , 2003. 12 :1155-1162. ] ;2007 年在第 6 夕卜显子中另一种点突变(R150Q)也被发现[参见Toth T, Deak L, Fazakas F, et al. A newmutation in the human pres gene and its effect on prestin function. Int. J. Mol.Med. 2007. 20 :545-550.];以上两种点突变均能引起人的耳聋。虽然两种导致人类耳聋的Prestin点突变已被发现，但由于实验材料的限制，以及实验技术在人体内的不可操作性等因素，目前在人体中Prestin突变致聋的分子病理机制仍不清楚。鉴于人类耳聋是发病率较高的一种疾病，Prestin突变致聋的分子机制研究价值很高，因而建立一种Prestin基因突变致聋的小鼠模型势在必行。经检索此类动物模型未见报道。

发明内容
针对目前Prestin基因研究存在的问题，为弥补Prestin基因敲除模型的缺点，本发明目的是构建一种Prestin点突变(IVS2-2A/G)的基因敲入载体。本发明的再一个目的是利用基因打靶技术，将筛选正确的ES细胞注入C57BL/6小鼠囊胚，模拟Prestin点突变(IVS2-2A/G)提供一种人耳聋疾病小鼠模型。本发明所述Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法，步骤是(I)构建Prestin突变基因打靶载体pLP-KI :先将含有小鼠Prestin基因的细菌人工染色体和质粒pBluescript KS(+)同时用BamH I内切酶单酶切，酶切出一个8. 58kb的包含exon3的Prestin片段和一个线性化的质粒pBluescript KS (+),将两者进行连接构建出重组质粒P1B161 ;再将含有小鼠Prestin基因的细菌人工染色体和质粒pBluescriptKS (+)同时用Pst I内切酶单酶切，酶切出一个约2. 97kb的包含exon3和exon4的Prestin片段和一个线性化的质粒pBluescript KS (+);将两者进行连接构建出重组质粒p77 ;在质粒plB161中，利用定向诱变试剂盒将一个A — G的Prestin点突变导入Prestin基因的exon3前面的剪切区域，得到引入突变位点的质粒plB161 ;最后将p77用BamH I单酶切出一个2. 49kb的短臂片段和引入突变位点的质粒P1B161用EcoR I单酶切出一个5. 6kb的长臂片段依次连入质粒PL452，构建出Prestin突变基因打靶载体pLP_KI，所述pLP_KI质粒的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；其中，上述引入突变的引物序列是primer#l GATTTTTTATTTTCTCCCTTGGTGGCCATCCAGAAATGCTTG,primer#2 CAAGCATTTCTGGATGGCCACCAAGGGAGAAAATAAAAAATC ；(2)转染Prestin突变基因打靶载体将构建好的Prestin突变基因打靶载体pLP-KI，用Not I酶切线性化，然后将线性化基因打靶载体利用电击法导入来源于129/S6、小鼠的ES细胞中；然后加入G418筛选出发生同源重组的ES细胞克隆^fES细胞提取DNA，再利用PCR法扩增并测序鉴定ES克隆是否发生突变，筛选出发生正确同源重组的ES细胞克隆； 其中，上述PCR扩增引物序列是mnL CAGTTCCCGAGAAATCCTCA,mnR GGGGAACTTCCTGACTAGGG ；(3)显微注射和PCR筛选制作Prestin点突变(IVS2-2A/G)致聋小鼠模型将筛选鉴定正确的ES细胞通过显微注射技术注入C57BL/6小鼠的囊胚中，经注射的囊胚转移至假孕母鼠的子宫着床，生出嵌合体小鼠；将嵌合体小鼠再与C57BL/6小鼠交配，产生出棕色和黑色后代小鼠；将其中的棕色小鼠用Long PCR方法筛选出阳性小鼠，再将阳性小鼠与EIIa-Cre小鼠交配，通过PCR筛选得到杂合型Fl代小鼠；最后将杂合型Fl代小鼠自交得到F2代小鼠,用筛选Fl代小鼠相同的PCR方法筛选出纯合F2代小鼠，即为Prestin点突变致聋小鼠模型；其中，上述LongPCR扩增引物序列是Long-left GGGAGGATTGGGAAGACAAT,Long-right GGTCAGAGGCCA GTAAGCTG ；其中，上述PCR扩增引物序列是EPL ATGAGATCCACAGCCAGGAG,EPR :CTGTGGGAAGTGGCTTGACT。上述Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法中，所述质粒pBluescriptKS(+)的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述质粒plB161的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述质粒p77的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述引入A —G突变后的质粒plB161的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述质粒pL452的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。所述的定向诱变试剂盒是 Stratagene 的 QuikChange II-E Site-Directed MutagenesisKit。本发明成功构建出Prestin突变基因打靶载体pLP_KI并实现了 Prestin点突变(IVS2-2A/G)致聋小鼠的制备。本发明的突出效果是(I)利用基因打靶先进技术获得了 Prestin点突变(IVS2-2A/G)基因敲入小鼠。(2)利用本发明方法制成的Prestin点突变(IVS2-2A/G)基因敲入小鼠能够了解Prestin突变致聋的机理。(3)利用本发明方法制成的Prestin点突变(IVS2-2A/G)基因敲入小鼠是进一步研究Prestin功能的理想模型，因为这些突变鼠Prestin失去了功能，但耳蜗和外毛细胞保持完好，能更好的进行机理研究等实验；此外，这种小鼠还能解答Prestin是否兼有结构蛋白的作用。


图I重组质粒plB161构建图示。图2重组质粒p77构建图示。图3基因打靶质粒pLP-KI构建图示。
图4PCR扩增产物测序验证ES细胞引入突变图示。图5Long PCR扩增验证携带有Neo和Prestin基因点突变小鼠的阳性筛选结果图
/Jn ο 图6PCR扩增验证Prestin点突变(IVS2-2A/G)致聋小鼠的筛选结果图示。
具体实施例方式本发明的Prestin点突变(IVS2-2A/G)致聋小鼠模型的制备方法，具体由以下步骤组成实施例I :Prestin突变基因打靶载体pLP_KI的构建I.构建重组质粒plB161 (连入长臂)将含有小鼠Prestin基因细菌人工染色体(BAC)和质粒pBluescript KS (+)同时用BamH I内切酶单酶切，酶切出一个8. 58kb的Prestin片段(包含exon3)和一个线性化的质粒pBluescriptKS(+);将两者进行连接构建出重组质粒plB161 (见附图I)。步骤如下LI BamH I 酶切 BAC 和质粒 pBluescript KS (+)酶切反应条件37°C水浴2h酶切反应体系50 μ I
ddH2029 μ
IOx Buffer K5 μ
BAC/pBluescript KS(+)15 μ
BamHII μ I · 2凝胶电泳及胶回收纯化I)酶切产物O. 7%琼脂糖凝胶电泳100V，100mA, 20min2)紫外灯下切取含有目的酶切片段的凝胶，放入I. 5ml离心管，称净重3)加入等体积(凝胶每IOOmg折算为100 μ I) Buffer XP4) 55°C水浴7min，其间颠倒混匀3次，至凝胶完全溶化5)离心管内液体混匀后移入吸附柱内6)室温离心IOOOOXg, Imin,弃收集液7)加入 300 μ I Buffer XP,室温离心 10000 X g, Imin,弃收集液8)加入 700 μ I DNA Wash Buffer，室温离心 10000 Xg, lmin，弃收集液9)重复 8)10)室温离心 13000Xg，2min11)吸附柱移入新的I. 5ml离心管，吸附柱开盖静置Imin12)吸附柱内加入30 μ I ddH20，静置2min13)室温离心 13000 X g，Imin14)收集液4°C保存I. 3 连接
反应条件22°C，3h反应体系10 μ I
Τ4 LigaseI μ
IOx Τ4 BufferI μ
Vector FragmentI μ
Insert Fragment7 μ I. 4转化到感受态细胞I)取5 μ I连接产物加入50 μ I感受态细胞，冰浴30min2)42°C^KS45sec3)冰浴 3min4)加入500 μ I无抗性LB培养基5)恒温摇床 37 °C，200rpm 培养 60min6)离心5000rpm,60sec,弃上清并保留ΙΟΟμΙ,重新悬浮沉淀7)菌液均匀涂于氨苄抗性LB培养基平板8)37。〇培养12-1611I. 5 培养I)挑取单菌落,加入5ml氨节霉素抗性LB培养基2)恒温摇床 37°C，200rpm 培养 8_12hI. 6质粒提取I)取菌液I. 5ml加入I. 5ml离心管,室温离心8000rpm, 60秒,弃上清2)重复 I) 2 次3)加入250 μ I Buffer Pl，悬浮沉淀并混匀4)加入250 μ I Buffer P2，颠倒混匀至液体变清亮粘稠5)加入350 μ I Buffer P3,颠倒混勻并出现白色沉淀6)室温离心 13000 X g，IOmin7)上清约750 μ I移入吸附柱内8)室温离心IOOOOXg, lmin,弃收集液9)吸附柱内加入500 μ I Buffer HB，室温离心10000 X g，lmin，弃收集液10)吸附柱内加入700 μ I DNA Wash Buffer，室温离心10000 X g，lmin，弃收集液11)重复 10)12)室温离心 13000Xg，2min13)吸附柱移入新的I. 5ml离心管，吸附柱开盖静置Imin14)吸附柱内加入50 μ I ddH20，静置2min15)室温离心 13000 X g，lmin16)收集液所含质粒即为构建得到的重组质粒plB161，质粒plB161的核苷酸序列如 SEQID No. 3 所示。2.构建重组质粒p77 (连入短臂
将含有小鼠Prestin基因 细菌人工染色体(BAC)和质粒pBluescript KS (+)同时用Pst I内切酶单酶切，酶切出一个2. 97kb的Prestin片段(包含exon3和exon4)和一个线性化的质粒pBluescript KS (+);将两者进行连接构建出重组质粒p77 (见附图2)。步骤如下(I)Pst I 酶切 BAC 和质粒 pBluescript KS (+)酶切反应条件37°C水浴2h酶切反应体系50 μ I
ddH2029 μ
IOx BufFerH5 μ
BAC15 μ
Pst II μ (2)酶切片段回收、连接、转化及质粒提取步骤同I. I中(2)-(6)。所得质粒即为重组质粒p77,质粒p77的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。3.将 Prestin 点突变(IVS2-2A/G)引入 plB161在质粒plB161中，我们通过定向诱变试剂盒QuikChange II-E Site-DirectedMutagenesis Kit (Stratagene)将一个Prestin 点突变(A — G)导入 Prestin 基因的 exon3前面的剪切区域。PCR 体系50 μ I(引物序列primer#I GATTTTTTATTTTCTCCCTTGGTGGCCATCCAGAAATGCTTG,primer#2 CAAGCATTTCTGGATGGCCACCAAGGGAGA AAATAAAAAATC)
IOx reaction buffer5 μ
plB161 (5 ng/μ )2 μ (IOng)
primer #11.25 μ (125 ng)
primer #21.25 μ (125 ng)
dNTP mixI μ
PfuUltra HF DNA polymerase (2.5 U/μΙ)I μ
ddH2038.5 μ 反应条件95 °C30s
95 °C30s
55°CImin12cycles
68 °C11.5min之后将其放置冰上2min，以冷却反应到< 37°C。 将I μ I Dpn I限制性内切酶(lOU/μ I)加入PCR体系中，使用移液枪上下轻轻混合几次，使用离心机离心lmin，立即放置37°C消化lh。重悬StrataClean resin,吸7 μ I到上面的PCR突变反应体系中，润旋混合物15s,然后室温放置lmin，离心Imin ( > 2000 Xg)。吸取上清液(包含DNA)转移到一个新离心管中。先将电转杯和I. 5ml离心管冰预冷，将灭菌的SOC培养基预热到37°C。然后将电转感受态细胞在冰上溶解，取2 μ I resin纯化的突变反应产物加入40 μ I感受态细胞中，轻轻混合后放置在冰上，之后将混合物转移到冰预冷的电转杯中，电转仪设置1700V，17kv/cm, 200 Ω, 25 μ F0电转后立即加入960 μ I的灭菌的SOC培养基重悬细胞，混合后转入灭菌的14ml圆底离心管中，37°C，225-250rpm培养lh。取100 μ I培养后的转化产物涂平板，37°C培养> 16h。细菌的培养和质粒的提取步骤同上I. I中(5)-(6)。所得质粒即为含有点突变的质粒P1B161，引入A —G突变后的质粒plB161的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所
/Jn ο4.构建基因打靶质粒pLP-KI(I)用 BamH I 将 p77 和 pL452 单酶切酶切反应条件37°C水浴a酶切反应体系50 μ I
ddH2029 μ
IOx Buffer K5 μ
p77/pL45215 μ
BamH II μ (2)酶切片段回收、连接、转化及质粒提取(已连入短臂片段)步骤同I. I中(2)-(6)0(3)用EcoR I将plB161和上面所提质粒(已连入短臂)单酶切酶切反应条件37°C水浴a酶切反应体系50 μ IddH2029 μ
IOx BufFerH5 μ
ρ1Β161/质粒(已连短臂)15 μ
BamH II μ (4)酶切片段回收、连接、转化及质粒提取(长臂+短臂片段)步骤同I. I中
(2)-(6).构建出基因打靶质粒pLP-KI(见附图3)，所述pLP-KI质粒的核苷酸序列如SEQID No. I 所示。 实施例2 Prestin突变基因打靶载体的转染将构建好的Prestin突变基因打靶载体——pLP_KI，用Not I酶切线性化，然后将线性化基因打靶载体利用电击法导入来源于129/S6小鼠的ES细胞中。然后加入G418筛选出发生同源重组的ES细胞克隆。将ES细胞提取DNA，再利用PCR法扩增并测序鉴定ES克隆是否发生突变，筛选出发生正确同源重组的ES细胞克隆。酶切反应条件37°C水浴2h酶切反应体系20 μ I
ddH208 μ
IOx BufFerH2 μ
0.1%BSA2μ1
0.1%TritonX-1002μ1
pLP-KI5 μ
Not II μ DNA提取步骤如下I、剪取O. 3-0. 5cm长的鼠尾，放入一个EP管中。剪碎后，用生理盐水或者PBS漂洗,离心去掉血污。2、力卩 Λ 250ul Lysis buffer I (IOOmM Tris-HCl pH8. 0,50mM EDTA pH8. 0，IOOmMNaCl 0. 1% SDS)。3、加入 13ul 20mg/ml 的蛋白酶 K。4、在55°C水浴孵育至少4h以上(最好过夜处理)，直到组织完全解体(期间可摇晃几次)。5、加入 Iul 25mg/mL 的 Trans 的无 DNase 活性的 RNaseA,放入 37°C水浴 30min。6、8000g离心IOmin,室温即可。取上清,移至新的EP管中。7、补无菌去离子水300ul体积，颠倒混匀(不要涡旋)。8、加等体积Tris饱和酹抽提,颠倒混勻，IOOOOg离心15min取上清,室温即可。9、加等体积酚氯仿异戊醇(25 24 I)抽提，待分层后IOOOOg离心15min，室温即可。取水相转移至一个新的EP管中(不要吸到中间相及下层水相。)
10、加等体积氯仿抽提，颠倒混匀后，IOOOOg离心15min去除痕迹酚。11、转移上层水相至新的EP管中，加入1/10体积3M NaAc (pH5. 2)，及2. 5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置IOmin后，放入_20°C沉淀DNA Ih以上。12、12000g离心15min。弃上清，沉淀加入70 %乙醇(现用现配)500ul洗漆，IOOOOg 离心 lOmin，两次。
13、室温干燥DNA沉淀5 IOmin (超净台内吹风)，避免DNA太干，难溶。14、加30-50ul TE Buffer或去离子水，溶解DNA。可以在50°C水浴孵育lOmin。(_20°C长期保存)使用分光光度计测OD值计算DNA量，以及A260/280测DNA质量。PCR 体系30 μ I(mnL CAGTTCCCGAGAAATCCTCA, mnR GGGGAACTTCCTGACTAGGG)反应体系20 μ I
ddH2014.4 μ
IOx Buffer2 μ
dNTPs (IOmM)0.4 μ
mnL (IOpM)I μ
mnR(lOpM)I μ
DNAI μ
TaqPolymerase(5U^l)0.2 μ 反应条件
94 °C4min
94 °C3Osec3Ocycles59.2 °C30sec
72 °Clmin
72 °C5minPCR产物测序结果见附图4。实施例3利用显微注射技术制作Prestin点突变(IVS2-2A/G)致聋小鼠模型将筛选鉴定正确的ES细胞通过显微注射技术注入C57BL/6小鼠的囊胚中，经注射的囊胚转移至假孕母鼠的子宫着床，生出嵌合体小鼠，嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配，产生出棕色和黑色后代小鼠。将其中的棕色小鼠剪尾提DNA，Long PCR扩增筛选出阳性小鼠(携带有Neo和Prestin基因点突变)。再将筛选得到的阳性小鼠与EIIa-Cre小鼠交配得到后代，剪尾提DNA，用PCR扩增获得杂合型Fl代小鼠；最后将杂合型Fl代小鼠自交得到F2代小鼠，用筛选Fl代小鼠相同的PCR方法筛选出纯合F2代小鼠，即为Prestin点突变致聋小鼠模型。具体试验步骤如下
I.鼠尾DNA提取同实施例2中DNA提取步骤2. Long PCR扩增筛选阳性小鼠Long PCR 体系30μ I (Long-left GGGAGGATTGGGAAGACAAT, Long-right GGTCAGAGGCCA GTAAGCTG)反应体系30 μ I
ddH2023.1 μ
IOxLABuffer3 μ
dNTPs (IOmM)0.6 μ
Long-left (IOpM)I μ Long-right( I OpM)I μ
DNAI μ
LATaqPolymerase(5U/μ )0.3 μ 反应条件Touchdown
94 °C4min
94 °Clmin
63°C*lmin IOcycles
72 °C2.5min
94 °Clmin
58 °Clmin 20cycles
72 °C2.5min
72 °C7min*每个循环降0.5°CLong PCR结果见附图5。3. PCR扩增鉴定突变小鼠PCR 体系(引物序列EPL :ATGAGATCCACAGCCAGGAG，EPR CTGTGGGAAGTGGCTTGACT)反应体系20 μ I
权利要求
1.一种Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法，步骤是(1)构建Prestin突变基因打靶载体pLP-KI:先将含有小鼠Prestin基因的细菌人工染色体和质粒pBluescript KS(+)同时用BamH I内切酶单酶切，酶切出一个8. 58kb的包含exon3的Prestin片段和一个线性化的质粒pBluescript KS (+),将两者进行连接构建出重组质粒P1B161 ;再将含有小鼠Prestin基因的细菌人工染色体和质粒pBluescript KS (+)同时用Pst I内切酶单酶切，酶切出一个约2. 97kb的包含exon3和exon4的Prestin片段和一个线性化的质粒pBluescript KS (+);将两者进行连接构建出重组质粒p77 ;在质粒P1B161中，利用定向诱变试剂盒将一个A — G的Prestin点突变导入Prestin基因的exon3前面的剪切区域，得到引入突变位点的质粒P1B161 ;最后将p77用BamH I单酶切出一个2.49kb的短臂片段和引入突变位点的质粒plB161用EcoR I单酶切出一个5. 6kb的长臂片段依次连入质粒PL452，构建出Prestin突变基因打靶载体pLP_KI，所述pLP_KI质粒的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示； 其中，上述引入突变的引物序列是primer#l GATTTTTTATTTTCTCCCTTGGTGGCCATCCAGAAATGCTTG,primer#2 CAAGCATTTCTGGATGGCCACCAAGGGAGA AAATAAAAAATC ；(2)转染Prestin突变基因打靶载体将构建好的Prestin突变基因打靶载体pLP_KI，用Not I酶切线性化，然后将线性化基因打靶载体利用电击法导入来源于129/S6小鼠的ES细胞中；然后加入G418筛选出发生同源重组的ES细胞克隆^fES细胞提取DNA，再利用PCR法扩增并测序鉴定ES克隆是否发生突变，筛选出发生正确同源重组的ES细胞克隆；其中，上述PCR扩增引物序列是mnL CAGTTCCCGAGAAATCCTCA,mnR GGGGAACTTCCTGACTAGGG ；(3)显微注射和PCR筛选制作Prestin点突变(IVS2-2A/G)致聋小鼠模型将筛选鉴定正确的ES细胞通过显微注射技术注入C57BL/6小鼠的囊胚中，经注射的囊胚转移至假孕母鼠的子宫着床，生出嵌合体小鼠；将嵌合体小鼠再与C57BL/6小鼠交配，产生出棕色和黑色后代小鼠；将其中的棕色小鼠用Long PCR方法筛选出阳性小鼠,再将阳性小鼠与EIIa-Cre小鼠交配，通过PCR筛选得到杂合型Fl代小鼠；最后将杂合型Fl代小鼠自交得到F2代小鼠，用筛选Fl代小鼠相同的PCR方法筛选出纯合F2代小鼠，即为Prestin点突变致聋小鼠模型；其中，上述LongPCR扩增引物序列是Long-left GGGAGGATTGGGAAGACAAT,Long-right GGTCAGAGGCCA GTAAGCTG ；其中，上述PCR扩增引物序列是EPL ATGAGATCCACAGCCAGGAG,EPR :CTGTGGGAAGTGGCTTGACT。
2.如权利要求I所述Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法，其特征是所述质粒pBluescript KS (+)的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述质粒plB161的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述质粒p77的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述引入A — G突变后的质粒P1B161的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述质粒pL452的核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示。
3.如权利要求I所述Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法，其特征是所述的定向诱变试剂盒是 Stratagene 的 QuikChange II-E Site-Directed Mutagenesis Kit。
全文摘要
本发明公开了一种Prestin基因突变致聋小鼠模型的制备方法，是构建出Prestin突变基因打靶载体pLP-KI；然后将其线性化后转染129/S6的ES细胞，利用PCR法扩增并测序鉴定ES克隆是否发生突变，筛选出发生正确同源重组的ES细胞克隆；再利用显微注射技术将鉴定正确的ES细胞注入C57BL/6小鼠的囊胚中，获得嵌合体小鼠，再将其与C57BL/6小鼠交配，产生出棕色和黑色后代小鼠；对棕色小鼠用Long PCR方法筛选出阳性小鼠，再将阳性小鼠与EIIa-Cre小鼠交配，通过PCR筛选得到杂合型F1代小鼠；将杂合型F1代小鼠自交得到F2代小鼠，再筛选出纯合F2代小鼠，即为Prestin点突变致聋小鼠模型；本发明的Prestin基因突变致聋小鼠模型可用于研究Prestin突变致聋的分子病理机制，解答尚待解决的Prestin功能的基础问题。
文档编号C12N15/63GK102634536SQ201210116788
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者刘学忠, 左坚, 张剑, 高建刚 申请人:山东大学