专利名称：一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的microRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的microRNA及其应用。
背景技术：
猪繁通与呼吸综合症(porcinereproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又称为猪蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的猪的ー种高发传染病，可引起母猪的繁殖障碍、各年龄猪发生呼吸道症状以及仔猪死亡，此外还可以导致免疫抑制从而诱发继发感染，对全世界的养猪业都造成了巨大的经济损失。该病在1987年首次发现于美国，而后迅速传播到加拿大及欧洲各地，如今这种疾病已经传播到世界各地。尤其是
2006年下半年以来，我国25个省份爆发了由毒力变异的高致病性PRRSV毒株(H-PRRSV)为主要病原的“猪高热病”(HP-PRRS)，本病的传染性极强，一旦感染，会引起妊娠母猪早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎，导致公猪种用性能下降，加剧病情，死亡率升高，给我国的养猪业造成严重的经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,根据病毒抗原的抗原性、基因组及致病性差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(I型，以LV株为代表)和美洲型(II型，以VR2332株为代表)。目前在我国流行的主要是II型毒株。该病毒的基因组大约长15. 4k bp,含有至少10个开放阅读框0RFla/lb，0RF2a/2b, 0RF3-4, 0RF5/5a, 0RF6-7,分别编码病毒的非结构蛋白 nspl-14, Gp2a/E, Gp3, Gp4, Gp5/Gp5a，M 和 N 蛋白。疫苗接种是当前预防PRRS的最普遍方法，国内外已有商业化的PRRS疫苗，包括弱毒疫苗和灭活疫苗。但是，弱毒疫苗在提供免疫保护的同时，还会持续散播疫苗病毒，使得病毒在猪场中循环存在，可能发生重组变异等，存在着毒力返强等不安全性问题，有时甚至引发PRRS爆发。而灭活疫苗存在着免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生周期长，不能对非疫苗株型的病毒侵染提供免疫保护等缺点，不太适合仔猪免疫，而仔猪带毒是猪场PRRSV持续存在的重要原因。所以，研发有效抑制PRRSV感染的方法就显得尤为重要。microRNAs (miRNA)是ー种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工后生成。它通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制，通过抑制靶基因的翻译过程或促使靶基因的mRNA降解。miRNA的合成和作用机制如下在细胞核内编码miRNA的基因转录成pri-microRNA (pri-miRNA) wri-miRNA在一种DroshaRNase的作用下，剪切为约70个核苷酸长度，具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5的作用下,从核内运输到胞质中。在Dicer酶(双链RNA专ー性RNA内切酶)的作用下，miRNA前体被剪切成21-25个核苷酸长度的双链miRNA。起初，成熟miRNA与其互补序列互相结合成所谓miRNA:miRNA*双螺旋结构(miRNA*是miRNA的反向互补序列);随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly),该复合物会结合到目标祀mRNA上。在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3’ UTR不完全互补配对，从而阻断该基因的翻译过程。
发明内容
本发明的目的是提供ー种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)増殖的microRNA及其应用。本发明提供的microRNA为序列表的序列I所示的单链RNA。本发明还保护序列表的序列2所示的DNA分子(编码所述microRNA的DNA分子)。 含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体可为将功能DNA片段导入siSTRIKE U6载体得到的重组质粒；所述功能DNA片段包括如下三个兀件所述DNA分子、与所述DNA分子反向互补的DNA分子以及位于两者之间的间隔序列。所述功能DNA片段具体可为将序列表的序列3自5’末端第4-57位核苷酸所示的单链DNA分子和序列表的序列4自5’末端第10-63位核苷酸所示的单链DNA分子退火形成的双链DNA分子。所述重组载体具体可为将序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子退火形成的双链DNA分子导入siSTRIKE U6载体得到的重组质粒。所述重组质粒中，所述功能DNA片段编码的RNA形成具有茎环结构的miRNA前体。在Dicer酶的作用下，miRNA前体被剪切成双链miRNA。随后，双螺旋解旋，其中一条(microRNA)结合到RNA诱导的基因沉默复合物中，形成非対称RISC复合物，该复合物会结合到目标靶mRNA上，从而阻断该基因的翻译过程，最終抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖。本发明还保护ー种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品，它的活性成分为所述单链RNA、所述DNA分子、所述重组载体、所述表达盒、所述转基因细胞系和所述重组菌中的至少ー种。本发明还保护所述单链RNA、所述DNA分子、所述重组载体、所述表达盒、所述转基因细胞系和所述重组菌中的至少ー种在如下(a)或(b)或(C)或(d)中的应用(a)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品；(b)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖；(C)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的产品；(d)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。以上任一所述抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖具体可体现为如下(I)、(2)和
(3)中的至少ー种(I)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的细胞病变；(2)抑制细胞中猪繁殖与呼吸综合征病毒组成蛋白的表达；(3)抑制细胞中猪繁殖与呼吸综合征病毒粒子的产生(降低细胞培养上清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度，滴度具体可通过TCID5tl体现)。所述组成蛋白具体可为Gp5蛋白和/或N蛋白。所述(I)和/或(2)和/或(3)中，所述细胞具体可为MARC-145细胞。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒可为II型猪繁殖与呼吸综合征病毒，具体可为VR2332毒株。
本发明提供的miCToRNA可以显著降低猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的损伤(即降低细胞病变)，有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的组成蛋白(以Gp5和N蛋白为代表)的合成，并极大地降低子代病毒粒子的产生。本发明为猪繁殖与呼吸综合征的治疗和预防提供了依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物，具有重大的价值。
图I为光学显微镜下观察细胞病变的照片。图2 为 Western-Blot 结果。图3为各个病毒液对于MARC-145细胞的TCID5tl結果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MOI (multiplicity of infection,感染复数)病毒颗粒数/细胞数。ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection),网址为 http://www.atcc. org八siSTRIKE U6载体(自身带有粘性末端；具有氨苄抗性)=Promega公司，C7290。Lipofectamine 2000 (购于 Invitrogen, Cat. No. 11668-027,按说明书操作)。细胞裂解液(购于 Promega, E194A)。MARC-145细胞购于美国模式培养物集存库ATCC，CRL-12231 (编号为CRL-12231TM (LN 14832 MARC145 CELL LINE(MONKEY KIDNEY))) (http://www. atcc.orR/ATCCAdvancedCatalORSearch/ProductDetails/tabid/452/Default. aspx ATCCNum=CRL-12231&Template=patents);公众也可从中国科学院微生物研究所获得；參考文献Yu, Μ. , X. Liu, L. Sun, C. Chen, G. Ma, Y. Kitamura, G. F. Gao and ff. Liu, 2010. Subcellularlocalization and topology of porcine reproductive and respiratory syndromevirus E protein. Virus Res 152,104-114. XPRRSV 病毒 VR2332 毒株购于 ATCC (VR-2332 ) (http://www. atcc. org/ATCCAdvancedCataloRSearch/ProductDetaiIs/tabid/452/Default. aspx ATCCNum=VR-2332&Te即late=animalViroloRy);公众也可从中国科学院微生物研究所获得；參考文献Yu, Μ. , X. Liu, L. Sun, C. Chen, G. Ma, Y. Kitamura, G. F. Gao and ff. Liu, 2010. Subcellularlocalization and topology of porcine reproductive and respiratory syndromevirus E protein. Virus Res 152, 104-114. X实施例I、设计抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的miCToRNA基于对猪繁殖与呼吸综合征病毒全序列的分析，设计并筛选，得到SSC-miR-26a序列，为抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的miciORNA。在Sanger数据库(http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中查阅线虫cel-let-7序列(作为阴性对照)，该阴性对照已经通过BLAST比对所有猪、人、大鼠及小鼠的基因组序列以及microRNA序列。ssc-miR-26a (序列表的序列 I) :5’ -UCGGAUAGGACCUAAUGAACUU-3’。
ssc-miR-26a 的编码序列(序列表的序列 2) :5’ -TCGGATAGGACCTAATGAACTT-3’。cel-let-7 :5’ -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3，。cel-let-7 的编码序列5’ -TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’。实施例2、重组表达载体的构建一、ssc_miR-26a表达载体的构建 I、分别合成序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子。序列表的序列3如下(5，一 3’):ACCTCGGATAGGACCTAATGAACTTCTTCCTGTCAAAGTTCATTAGGTCCTATCCGATTTTC(I)(II)(I)为ssc-miR_26a的编码序列，(II)为(I)的反向互补序列。序列表的序列4如下(5，一 3’)TGCAGAAAATCGGATAGGACCTAATGAACTTTGACAGGAAGAAGTTCATTAGGTCCTATCCGAT2、将序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子退火，形成带有粘末端的双链DNA分子。3、将步骤2得到的带有粘末端的双链DNA分子与siSTRIKE U6载体链接，得到SSC-miR-26a表达载体(重组质粒甲)。根据测序結果，对重组质粒甲进行结构描述如下在siSTRIKE U6载体的粘性末端插入了带有粘末端的双链DNA分子(由序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子退火后形成)。ニ、cel-let-7表达载体的构建I、分别合成序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子。序列表的序列5如下(5，一 3’):ACCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCTTCCTGTCAAACTATACAACCTACTACCTCATTTTC(HI)(IV)(III)为cel-let-7的编码序列，(IV)为(III)的反向互补序列。序列表的序列6如下(5，一 3’):TGCAGAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTGACAGGAAGAACTATACAACCTACTACCTCAT2、将序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子退火，形成带有粘末端的双链DNA分子。3、将步骤2得到的带有粘末端的双链DNA分子与siSTRIKE U6载体链接，得到cel-let-7表达载体(重组质粒こ)。根据测序結果，对重组质粒こ进行结构描述如下在siSTRIKE U6载体的粘性末端插入了带有粘末端的双链DNA分子(由序列表的序列5所示单链DNA分子和序列表的序列6所示单链DNA分子退火后形成)。实施例3、ssc-miR-26a对猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的抑制作用分别进行以下四组处理(平行试验；每个处理进行三次重复)处理ー(PRRSV感染一 miR_26a):用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到80%的时候，通过Lipofectamine 2000转染实施例2构建的重组质粒甲(转染剂量为Iug/孔)，37°C孵育24小时；然后感染PRRSV病毒VR2332毒株(感染剂量为1M0I)，37°C孵育72小时；处理ニ(PRRSV感染一阴性对照)用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到80%的时候，通过Lipofectamine 2000转染实施例2构建的重组质粒こ(转染剂量为I μ g/孔)37°C孵育24小时；然后感染PRRSV病毒VR2332毒株(感染剂量为1M0I)，37°C孵育72小吋。处理三(PRRSV感染一阳性对照)用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到80%的时候，加入与处理一等量的LipofectamineTM2000，37°C孵育24小时；然后感染PRRSV病毒VR2332毒株(感染剂量为1M0I) ，37°C孵育72小时。处理四(空白对照)用MARC-145细胞铺24孔板；当每孔细胞密度达到80%的时候，加入与处理一等量的Lipofectamine 2000，37°C孵育96小时。完成上述处理后，分别取细胞培养上清(病毒液)和细胞。取细胞，先用PBS缓冲液洗3次，然后在光学显微镜下观察细胞病变(Cytopathiceffect，CPE)，拍照存图。见图I。重组质粒甲能显著减轻PRRSV感染造成的MARC-145细胞病变(根据microRNA的作用机理,是ssc_miR-26a发挥作用),而重组质粒こ无此功能。取细胞，先用PBS缓冲液洗3次，然后用100 μ I/孔细胞裂解液裂解细胞，通过Western-Blot方法检测PRRSV的Gp5蛋白和N蛋白表达情况(以β-act in蛋白为内參)。Western-Blot检测Gp5蛋白所用的ー抗为小鼠抗PRRSV的Gp5蛋白多抗(用于制备ー抗的抗原如序列表的序列的序列7所示，；制备方法參见文献孙颖；马艳；李彬；江云波；肖少波；方六荣；陈焕春.“抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定《动物医学进展》
2007年第11期)，所用的ニ抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购于碧云天，A0216)。Western-Blot检测N蛋白所用的一抗为小鼠抗PRRSV的N蛋白多抗(用于制备ー抗的抗原如序列表的序列的序列8所示；制备方法參见文献夏向荣，李玉峰，姜平.“PRRSV重组N蛋白的抗原性分析及其特异性抗体制备”.《畜牧与兽医》2003年第09期)，所用的ニ抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购于碧云天,A0216)。Western-Blot检测β-actin蛋白所用的ー抗为β-actin小鼠单抗(购于碧云天，AA128),所用的ニ抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购于碧云天,A0216)。Western-Blot结果见图2。重组质粒甲能抑制PRRSV的Gp5蛋白和N蛋白的表达水平(根据microRNA的作用机理，是ssc-miR-26a发挥作用),而重组质粒こ无此功能。取病毒液测定对于MARC-145细胞的TCID5tl,通过Reed-Muench法(Reed, L.J. ;Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints. TheAmerican Journal of Hygiene 27:493 - 497.)计算病毒的 TCID5(I。结果见图 3 (三次试验的平均值)。图3中，纵坐标为Ig (每毫升病毒液的TCID5tl值)。重组质粒甲能降低所感染的MARC-145细胞得到的病毒液中PRRSV病毒的滴度(根据microRNA的作用机理，是ssc-miR-26a发挥作用),而重组质粒こ无此功能。
权利要求
1.序列表的序列I所示的单链RNA。
2.序列表的序列2所不的DNA分子。
3.含有权利要求2所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将功能DNA片段导入siSTRIKE U6载体得到的重组质粒；所述功能DNA片段包括如下三个元件权利要求2所述DNA分子、与权利要求2所述DNA分子反向互补的DNA分子以及位于两者之间的间隔序列。
5.ー种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品，它的活性成分为权利要求I所述单链RNA、权利要求2所述DNA分子、权利要求3或4所述重组载体、权利要求3所述表达盒、权利要求3所述转基因细胞系和权利要求3所述重组菌中的至少ー种。
6.权利要求I所述单链RNA在如下(a)或(b)或(c)或(d)中的应用 Ca)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品； (b)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖； (C)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的产品； Cd)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。
7.权利要求2所述DNA分子在如下(a)或(b)或(c)或(d)中的应用 Ca)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品； (b)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖； (C)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的产品； Cd)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。
8.权利要求3或4所述重组载体在如下(a)或(b)或(C)或(d)中的应用 Ca)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品； (b)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖； (C)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的产品； Cd)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。
9.权利要求3所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(a)或(b)或(C)或(d)中的应用 Ca)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖的产品； (b)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒増殖； (C)制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的产品； Cd)抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。
全文摘要
本发明公开了一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的microRNA及其应用。本发明提供了序列表的序列1所示的单链RNA(microRNA)。本发明提供的microRNA可以显著降低猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的损伤(即降低细胞病变)，有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的组成蛋白(以Gp5和N蛋白为代表)的合成，并极大地降低子代病毒粒子的产生。本发明为猪繁殖与呼吸综合征的治疗和预防提供了依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物，具有重大的价值。
文档编号C12N1/19GK102676519SQ20121013897
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者刘亭见, 李晶, 杨利敏, 牟身芸, 陈才伟 申请人:北京诺派生物科技有限公司