专利名称：堆肥发酵复合微生物菌剂及其固态发酵生产方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合微生物菌剂及其发酵生产方法与应用，特别是涉及一种用于污泥、牲畜粪便和农业秸杆等废弃有机物料堆肥使用的复合微生物菌剂及其固态发酵生产方法与应用。
背景技术：
国外关于堆肥菌剂的研究始于半个多世纪前，并在日本、美国、韩国以及我国台湾地区得到广泛应用。堆肥过程是一个微生物生态群落消长演替的过程，在这个过程中，随着温度、pH值等环境条件的变化，微生物种群数量也会发生变化，并在不同的发酵阶段形成各异的优势
菌群，从而对不同的有机物进行降解消化。在整个堆肥中，根据微生物的消长演替分为三个时期糖降解期、纤维素降解期、木质素降解期，而对堆肥接种菌剂而言，关键的是纤维素降解期和木质素降解期。纤维素降解期也可称为一次发酵期(高温堆肥阶段)，该阶段的特点是温度在50 75°C，主要降解纤维素、半纤维素类物质，同时也开始腐殖化过程，MT4-N含量不断增加；发酵过程产碱，引起PH升高、部分氨气逃逸；能适应高温的芽孢杆菌、放线菌成为优势菌群，而对纤维素、木质素等复杂有机物降解能力最强的真菌数量减少，甚至全部消失。木质素降解期也可称为二次发酵期(降温腐熟阶段)，该阶段的特点是温度在50°C以下，中温微生物显著增加，可利用的营养物质减少，主要降解残留下来的纤维素、半纤维素、木质素等物质，MT4-N在硝化菌的作用下，被进一步氧化为N()-3-N。近年来，国内外在堆肥菌剂研究方面取得了较大的进展，国内也出现了不同组合的复合微生物制剂的产品，但普遍的问题是，因缺乏对堆肥过程机理的认识，菌剂的组合缺乏科学性，使堆肥发酵的腐熟度较低，影响产品的质量。另外，目前微生物菌剂的生产大多采用液态发酵，产品为液体，保质期短，运输不便；或有些生产采用固体物质吸附液体后干燥，其固态菌剂的生产过程不连续，造成杂菌率高，活菌率低，影响其应用过程中的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种堆肥发酵复合微生物菌剂及其固态发酵生产方法与应用，该复合微生物菌剂中的各菌种及菌种之间能更好的协同共生，该复合微生物菌剂的固态发酵生产方法发酵周期短，产品活菌总数多，杂菌率低，稳定性好，保质期长，使用该复合微生物菌剂进行堆肥，有利于提高物料腐熟度。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
本发明之堆肥发酵复合微生物菌剂，包含菌剂1#，可选菌剂2#，分别适用于一次发酵和二次发酵；
所述菌剂1#是能耐50 75°C的高温微生物菌群，含14株菌种，包括以下菌种高温纤维素降解菌:嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophiIus)(已于2012年3月5日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCCNo. 5846)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)(保藏编号 CICC2440)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)(保藏编号 ACCC30571)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(保藏编号 CICC2434)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus thermophilus)(保藏编号 ACCC10253)、嗜热液化芽孢杆菌(Bacillus thermo I iquefaciens) (CICC20647)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)(保藏编号ACCC41067);高温淀粉降解菌褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)(保藏编号CCTCC AB93039);高温蛋白质降解菌普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)(保藏编号ACCC41061)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus )(保藏编号ACCC10113);高温木质素降解菌地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)(保藏编号ACCC11080)、高温果胶降解菌炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)(保藏编号CICC41254);高温乳酸菌2株德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(该菌种于2012年3月5日保藏于北京的中国微生物菌、种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5845)、嗜热链球菌(保藏编号CICC20376) (Streptococcus thermophilus)；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophiIus)>德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)系由本发明者选育成功。其余均为现有公知菌种，可通过保藏编号查到相关保藏单位，从该保藏单位购得。所述保藏编号中的“CICC”是中国工业微生物菌种保藏管理中心的简称，“ACCC”是中国农业微生物菌种保藏管理中心的简称；“ CCTCC”是中国典型培养物保藏中心的简称。所述菌剂2#是10 45°C中温微生物菌群，含8株菌种，包括木质素降解菌白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)(保藏编号 ACCC30942)、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)(保藏编号 ACCC11080)、绿色木霉(Trichoderma viride)(保藏编号ACCC30048);纤维素降解菌康宁木霉(Trichoderma koningii )(保藏编号 CICC40505)、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)(保藏编号CICC41254);乳酸菌保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(保藏编号 ACCC10638)、乳酸链球菌(Lactococcus Iactis)(保藏编号ACCC11093);光合细菌沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)(保藏编号 ACCC00309)。本发明之菌剂1#的固态发酵生产方法，包括以下步骤
(I)一级种子发酵为液态混合发酵，将菌剂1#分别扩培的14株菌剂，按无菌接种技术接种入一级种子发酵罐，扩培之后的液体量都同为50 250ml，发酵温度为50 60°C或30 40°C，搅拌速度为120 180r/min，培养时间为I 2天，通入无菌空气，发酵前3 8h气料体积比为I: I. 5 3，之后气料体积比为1:0. 8 I. 2，得到一级种子液；
所述一级种子发酵罐装有液体培养基，液体培养基各组分质量配比为糖蜜或红糖3 10%、淀粉2 5%、硫酸铵O. 5 2%、氯化钠3 6%、磷酸二氢钙O. 2 2%，其余为水；
(2)将相当于固态发酵物料5 20%体积的步骤(I)所得一级种子液接种于发酵罐，进行固态发酵培养，获取菌剂；
所述固态发酵培养用培养基各组分质量配比为秸杆粉3 30%、麦麸5 35%、玉米粉3 20%、糖蜜或红糖I 5%、尿素O. 4 4%、硫酸镁O. 2 1%、磷酸二氢钙O. I O. 5%，其余为水；将各组分按比例混合后装入发酵罐；
具体发酵过程包括1)静态发酵阶段，为接种后O 10h，通入无菌空气，气料体积比I: O. 8 2. 5，通过控制发酵罐出口气体与进口气体中CO2含量的差值，调节通气量气料体积比，通过控制通气温度使发酵温度为50 60°C或30 40°C ；2)间歇膨胀发酵阶段，接种后6 36h，通入无菌空气，间歇通气量气料体积比1:0. 8 2. 5，膨胀通气量气料体积比I: O. I O. 6，间歇时间通过培养基温度高低反馈控制，补水、调pH值，使水分含量为45% 60%，pH为6 8，通过物料含水率、pH值反馈控制，使发酵温度处于50 60°C或30 40°C，与一级种子发酵温度保持一致；
所述气料体积 比，是指所通入的无菌空气与固体物料或液体物料体积的比值。本发明之复合微生物菌剂2#的固态发酵生产方法，除发酵温度为30 40°C之外，其余与菌剂1#的一级种子发酵相同。本发明通过发明者自行分离、筛选得到的德氏乳杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌及选购现有相关微生物菌种，确定了最佳的复合微生物菌剂组合。本发明之复合微生物菌剂1#所包含的各菌种及菌种之间能很好的协同共生，在50 75°C条件下能够很好的降解纤维素、木质素、蛋白质、淀粉、果胶等污泥、牲畜粪便、农业有机废弃物中的常见大分子物质；该复合菌剂独特的引入了乳酸菌，改善发酵过程的PH值，提高一次发酵的保氮效果。其中，由本发明者分离、筛选得到的高温纤维素降解菌嗜热脂肪芽孢杆菌(CGMCC No. 5846)在55°C 65°C的产纤维素酶能力达到800 2000u/ml。由本发明者分离得到的德氏乳杆菌在55°C 65°C仍具有较强的产乳酸能力。而本发明复合菌剂的产纤维素酶能力较嗜热脂肪芽孢杆菌(CGMCC No. 5846)单菌种产纤维素酶能力提
|ρΓ| 80%。本发明之复合微生物菌剂2#所包含的菌种能在10 45°C之间很好的降解木质素、纤维素，加快二次发酵物料腐熟速度；其中有益微生物乳酸菌、光合细菌有助于提高产品品质。本发明所述复合微生物菌剂1#可单独用于有机物料堆肥，但1#菌剂和2#菌剂同时配合使用，可以改善产品品质，缩短二次发酵周期。本发明之堆肥发酵复合微生物菌剂中的各菌种及菌种之间能很好协同共生；复合微生物菌剂的固态发酵生产方法发酵周期短，产品活菌总数多，杂菌率低，稳定性好，保质期长；使用该复合微生物菌剂进行堆肥，有利于提高物料腐熟度。微生物菌种保藏情况说明
德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)于2012年3月5日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5845。嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)于2012年3月5日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5846。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例I :复合微生物菌剂1#固态发酵生产方法 本实施例包括以下步骤(1)一级种子发酵将菌剂1#所含的14株菌种，分别接种入50ml的摇瓶按照各自的特征培养基扩培,按无菌接种技术接种入一级种子发酵罐,发酵温度为55°C，搅拌速度为150r/min,培养时间为I. 5天，通入无菌空气，发酵前6h，气料体积比为1:2. 1，之后气料体积比为1:1. I，得到一级种子液；
所述一级种子发酵罐装有液体培养基，液体培养基各组分质量配比为红糖5%、淀粉2%、硫酸铵1%、氯化钠5%、磷酸二氢钙O. 5%，其余为水；
(2)将相当于固态发酵物料10%体积的步骤(I)所得一级种子液接种于发酵罐，进行固态发酵培养，获取菌剂；
固态发酵的培养基各组分质量配比为秸杆粉6%、麦麸30%、玉米粉5%、糖蜜2%、尿素
I.5%、硫酸镁O. 5%、磷酸二氢钙O. 3%，其余为水；将各组分按比例混合后装入发酵罐；
具体发酵过程包括1.静态发酵阶段，接种后，通气量气料体积比为1:0. 8，发酵时间8h，发酵温度控制在55±2°C，；2.间歇膨胀发酵阶段，发酵时间15h，通入无菌空气，间歇时间通过培养基温度高低反馈控制，间歇通气量气料体积比为I: I. 2，膨胀通气量气料体积比1:0. 3，间歇时间通过培养基温度高低反馈控制，水分含量控制在50% 60%，pH值控制在6 8，通过物料含水率、pH值反馈控制，使发酵为55±2°C，与一级种子发酵温度保持一致。本实施例获得的复合微生物菌剂1#总细菌数为2. OX 101(lcfu/g，杂菌率O. 05%。实施例2复合微生物菌剂2#固态发酵生产方法 本实施例包括以下步骤
(1)一级种子发酵将菌剂2#所含的8株菌种，分别接种入50ml的摇瓶扩培(其中扩培液体培养基高温细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基、高温霉菌采用PDA培养基、高温放线菌采用改良高氏一号培养基、高温乳酸菌采用MRS培养基)，按无菌接种技术接种入一级种子发酵罐，发酵温度为35°C，搅拌速度为150r/min，培养时间为2天，通入无菌空气，发酵前6h，气料体积比为1:2，之后气料体积比为1:1. 1，得到一级种子液；
所述一级种子发酵罐装有液体培养基，液体培养基各组分质量配比为糖蜜4%、淀粉3%、硫酸铵1%、氯化钠5%、磷酸二氢钙O. 5%，其余为水；
(2)将相当于固态发酵物料体积8%的步骤(I)所得一级种子液接种于发酵罐，进行固态发酵培养，获取菌剂；
固态发酵的培养基各组分质量配比为秸杆粉20%、麦麸15%、玉米粉5%、红糖2%、尿素
I.5%、硫酸镁O. 5%、磷酸二氢钙O. 3%，其余为水；将各组分按比例混合后装入发酵罐。具体发酵过程包括1.静态发酵阶段，接种后，通入无菌空气，通气量气料体积比1:1，发酵时间8h后，发酵温度控制在35±2°C ；2.间歇膨胀发酵阶段，发酵时间16h，通入无菌空气，间歇通气量气料体积比1:1. 1，膨胀通气量气料体积比1:0. 2，间歇时间通过培养基温度反馈控制，通过物料含水率、pH值反馈控制，水分控制在50 60%、pH控制在6 8、温度 35 ±2。。。本实施例获得的复合微生物菌剂2#总细菌数为I. OX 101(lCfu/g，杂菌率O. 1%。实施例3以污泥为主要原料的堆肥 本实施例包括以下步骤
堆肥原料组成污泥60%、稻杆15%、堆肥返料(堆肥后的半成品作为回返物料)25% ；
复合微生物菌剂1#、2#占堆肥原料的质量比分别为4%。。
堆肥过程先将复合微生物菌剂1#与20%的质量分数的稻杆混合均匀后，再与其余稻杆、污泥、返料一起混合，之后堆成宽6m、高I. 5m、长度不限的半开放式条垛，冬季物料在16h内升温至50°C，保持发酵温度在75°C以下，每2 3天翻堆一次；
物料在11天内降温至45°C，并保持温度，以覆撒方式接种菌剂2#’直至发酵结束，二次发酵周期25天。本实施例比无菌剂添加的物料，升温缩短I. 5天，一次发酵周期缩短4天，二次发酵周期缩短5天。物料腐熟度效果物料发芽指数为90%，发芽率100%，有机质下降率39. 5%，比无菌剂添加的物料分别高20%、4%、11. 2%。实施例4以牛粪为主要原料的堆肥
堆肥原料组成牛粪75%、稻杆8%、返料(堆肥后的半成品作为回返物料)17% ；
复合微生物菌剂1#、2#分别为堆肥原料总重量的4%。。 堆肥过程先将菌剂1#与稻杆、牛粪、返料一起混合，之后堆成宽6m、高I. 7m、长度不限的半开放式条垛，冬季物料在16h内升温至50°C，保持发酵温度在75°C以下，每2 3天翻堆一次。物料在15天内降温至45°C，并保持温度，以覆撒方式接种菌剂2#，直至发酵结束，二次发酵周期25天。本实施例比无菌剂添加的物料，升温缩短I. 5天，一次发酵周期缩短5天，二次发酵周期缩短5天。物料腐熟度效果物料发芽指数为90%，发芽率100%，有机质下降率42. 5%，比无菌剂添加的物料分别高30%、4%、13. 1%。实施例5以鸡粪为主要原料的堆肥
堆肥原料组成鸡粪60%、稻杆18%、返料(堆肥后的半成品作为回返物料)22% ；
复合微生物菌剂1#为堆肥原料总重量的4%。。堆肥过程先将菌剂1#与稻杆、鸡粪、返料一起混合，之后堆成宽6m、高I. 7m、长度不限的半开放式条垛，冬季物料在16h内升温至50°C，保持发酵温度在75°C以下，每2 3天翻堆一次；
物料在11天内降温至45°C，进入二次发酵，二次发酵周期28天。本实施例比无菌剂添加的物料，升温缩短I. 5天，一次发酵周期缩短6天，二次发酵周期缩短3天。物料腐熟度效果物料发芽指数为80%，发芽率100%，有机质下降率36. 4%，比无菌剂添加的物料分别高15%、0%、10. 8%。实施例6以稻杆为主要原料的堆肥 堆肥原料组成稻杆98%、尿素I. 5%、红糖O. 5% ；
复合微生物菌剂1#为堆肥原料总重量的4%。。堆肥过程先将菌剂1#与红糖、尿素加入与物料同等质量的水中，混合均匀后，再均匀喷洒至已堆成条垛的秸杆上，堆成宽6m、高lm、长度不限的开放式条垛，物料在24h内升温至50°C，保持发酵温度在75°C以下，每2 3天翻堆一次；
物料在25天内降温至45°C，并保持温度，直至发酵结束，二次发酵周期30天。本实施例比无菌剂添加的物料，升温缩短I天，一次发酵周期缩短10天，二次发酵周期缩短11天。物料腐熟度效果物料发芽指数为75%，发芽率100%，有机质下降率43. 2%，比无菌剂添加的物料分别高20%、2%、15. 7%。
权利要求
1.一种堆肥发酵复合微生物菌剂，其特征在于，包含菌剂1#，适用于一次发酵； 所述菌剂1#是能耐50 75°C的高温微生物菌群，由以下14株菌种构成其中高温纤维素降解菌为1)嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),保藏编号为CGMCCNo. 5846,2)嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile), 3)嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila), 4)烟曲霉(Aspergillus fumigatus), 5)嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus thermophilus), 6)嗜热液化芽抱杆菌(Bacillus thermo I iquefaciens),.7)弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata);高温淀粉降解菌为8)褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca);高温蛋白质降解菌9)普通高温放线菌(Thermoactinomycesvulgaris), 10)短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);高温木质素降解菌为11)地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis);高温果胶降解菌为12)炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius);高温乳酸菌为13)德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii),保藏编号为 CGMCC No. 5845,14)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
2.根据权利要求I所述的堆肥发酵复合微生物菌剂，其特征在于，还包括菌剂2#，适用于二次发酵；所述菌剂2#是指能在10 45°C条件下生长的中温微生物菌群，由8株菌种构成，其中木质素降解菌为白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、绿色木霉(Trichoderma viride);纤维素降解菌为康宁木霉(Trichoderma koningii)、炭黑曲霉(Aspergillu carbonarius);乳酸菌保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳酸链球菌(Lactococcus Iactis);光合细菌沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
3.—种如权利要求I所述的堆肥发酵复合微生物菌剂的固态发酵生产方法，其特征在于，所述菌剂1#的固态发酵生产方法，包括以下步骤(I)一级种子发酵为液态混合发酵，将菌剂1#分别扩培的14株菌剂，按无菌接种技术接种入一级种子发酵罐，扩培之后的液体量都同为50 250ml，发酵温度为50 60°C或30 40°C，搅拌速度为120 180r/min，培养时间为I 2天，通入无菌空气，发酵前.3 8h，气料体积比为1:1. 5 3，之后气料体积比为1:0. 8 I. 2，得到一级种子液； 所述一级种子发酵罐装有液体培养基，所述液体培养基各组分质量配比为糖蜜或红糖3 10%、淀粉2 5%、硫酸铵0. 5 2%、氯化钠3 6%、磷酸二氢钙0. 2 2%，其余为水；(2)将相当于固态发酵物料体积5 20%的步骤(I)所得一级种子液接种于发酵罐，进行固态发酵培养，获取菌剂； 所述固态发酵培养用培养基各组分质量配比为秸杆粉3 30%、麦麸5 35%、玉米粉.3 20%、糖蜜或红糖I 5%、尿素0. 4 4%、硫酸镁0. 2 1%、磷酸二氢钙0. I 0. 5%，其余为水；将各组分按比例混合后装入发酵罐； 具体发酵过程包括1)静态发酵阶段，为接种后0 10h，通入无菌空气，气料体积比.1:0. 8 2. 5，通过控制发酵罐出口气体与进口气体中CO2含量的差值，调节通气量气料体积比，通过控制通气温度使发酵温度为50 60°C或30 40°C ；2)间歇膨胀发酵阶段，接种后6 36h，通入无菌空气，间歇通气量气料体积比1:0. 8 2. 5，膨胀通气量气料体积比.1:0. I 0. 6，间歇时间通过培养基温度高低反馈控制，补水、调pH值，使水分含量为45% .60%，pH为6 8，通过物料含水率、pH值反馈控制，使发酵温度处于50 60°C或30 40°C，与一级种子发酵温度保持一致； 所述气料体积比，是指所通入的无菌空气与固体物料或液体物料体积的比值。
4.一种如权利要求2所述的堆肥发酵复合微生物菌剂的固态发酵生产方法，其特征在于，所述的复合微生物菌剂2#固态发酵生产方法，除发酵温度为30 40°C之外，其余与菌剂1#的一级种子发酵相同。
5.一种如权利要求I或2所述的堆肥发酵复合微生物菌剂的应用。
全文摘要
堆肥发酵复合微生物菌剂及其固态发酵生产方法与应用，该堆肥发酵复合微生物菌剂包含菌剂1#，还可包含菌剂2#，分别适用于一次发酵和二次发酵；所述菌剂1#是能耐50～75℃的高温微生物菌群，所述菌剂2#是能耐10～45℃的中温微生物菌群。本发明还包括所述堆肥发酵复合微生物菌剂的固态发酵生产方法与应用。本发明之堆肥发酵复合微生物菌剂中的各菌种及菌种之间能很好协同共生；复合微生物菌剂的固态发酵生产方法,产品活菌总数多，杂菌率低，稳定性好，保质期长；使用该复合微生物菌剂进行堆肥，有利于提高物料腐熟度。
文档编号C12R1/68GK102660479SQ20121014534
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者孙俊荣, 杨云凤, 陈祥国 申请人:娄底市裕德科技有限公司