专利名称：一种快速提取dna的方法
技术领域：
本发明涉及生物 技术领域，具体涉及ー种快速提取DNA的方法。
背景技术：
在生命体内，核酸和蛋白质是生命最重要的物质。核酸携帯遗传信息，指导蛋白质的合成。它们的关系紧密相联。在为进行核酸水平上的遗传研究或临床检測，从ー些生物样本，例如动物细胞、血清、血液等，提取核酸时，却常常遇到的主要问题是如何去除含量丰富的蛋白质。本领域技术人员所熟知的一种有效方法是酚/氯仿抽提，但这种方法是非常耗费时间和劳动力。一种可选方法是利用SDS、蛋白质和K离子形成不溶于水的复合物，通过离心去除含蛋白质的沉淀。这种方法普遍用于提取质粒，即所称的碱裂法。申请号为201010153890. 1，名称为血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法中国发明采用该方法提取全血DNA。事实上，该方法并不能彻底去除蛋白质，常常可见带颜色的上清液。另ー种可选的方法是盐析法，利用了蛋白质在高浓度盐的溶液溶解度低而析出的物理特性，通常使用单价金属盐如钠盐、铵盐、钾盐等。如Miller S. A.,等人NucleicAcidsRes.，16(1988)3中报道的方法，其过程是先通过低渗溶液裂解去除占据99%全血细胞不含DNA的红细胞，再裂解含DNA的白细胞，然后加入饱和的氯化钠析出蛋白沉淀，离心沉淀后含有DNA的上清液再通过こ醇沉淀分离出DNA。在操作中，技术人员发现，血红蛋白残留过多时往往无法彻底清除，如果直接裂解全血，则无法用该方法实现去除蛋白的目的。蛋白质去除后，接着是从含DNA的上清液中分离出DNA，这个过程称为纯化。本领域技术人员熟知的ー种方法是添加こ醇或异丙醇纯化DNA，并且熟知这是ー种耗时费カ的方法。另外，本领域技术人员同样熟知在离液盐的存在下核酸吸附于玻璃粒子或ニ氧化硅粒子(Vogelstein, B.,和 Gillespie, D.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(1979)615-619)，并为核酸的色谱纯化和分离过程奠定了基础。令人惊奇的是，ニ氧化硅材质能特异性吸附核酸，且不吸附蛋白，糖类、脂类和常用的盐类，基本原理还未见相关文献叙述。本领域还已知使用高浓度的离液盐如碘化钠、高氯酸钠和硫氰酸胍从胞溶产物中分离和纯化DNA的方法。例如，在Boom, R.等人，J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503中，描述了使用异硫氰酸胍和玻璃颗粒提纯人体样本如全血、血清和尿液等的方法。该方法是用异硫氰酸胍裂解人体样本，并作为结合剂使DNA吸附至玻璃颗粒表面，同样的描述也可见US5234809。然而，采用玻璃颗粒形式的纯化方法需要多次重悬操作并在溶解DNA之前为为了彻底去除干扰下游应用的こ醇，通常需要较长时间的干燥。另ー种可选的方式是磁珠法。磁珠表面包被硅胶或标记功能基团，例如氨基、羧基等,磁珠吸附DNA后，在磁场的作用下，DNA-磁珠复合体吸附至管底或管壁，除去不含DNA的上清液，洗涤和洗脱DNA-磁珠复合体，获得纯化的DNA溶液。这种方法有效地实现了 DNA提取的自动化，但手工操作时，与玻璃颗粒的纯化方式同样需要多次的重悬步骤并也需长时间干燥。如上所述的方法，在需检测大量样本及迅速发报结果的疾病临床诊断中是受限的。ー种快速提取DNA的可选方法，如Jakobi, R.等人，Anal.Biochem. 175(1988) 196-201中的描述，使用玻璃纤维过滤器纯化M13噬菌体DNA的方法。该方法通过聚ニこ醇/氯化钠使噬菌体粒子沉淀并用高氯酸盐使噬菌体粒子胞溶而分离DNA,洗涤与DNA结合的玻璃纤维过滤器，然后用TE溶液洗脱。玻璃纤维过滤器是ー种快速纯化DNA的方法，无需添加特别的去除蛋白质的步骤，仅通过短时间离心过滤含非DNA的其它生物样本释放的组分诸如蛋白质、脂类等和盐等污染物，并使DNA迅速结合于纤维膜上，且用短时间高速离心干燥纤维膜。这种方法被市售示例性产品如Qiagen公司的全血小量提取试剂盒所采用。此类产品用于提取全血的过程较简单，先在盐酸胍和蛋白酶共同的作用通过55摄氏度温育10分钟以裂解生物样本并释放DNA，再通过加入こ醇调节结合条件， 将含DNA的混合液转移至硅胶柱，离心使DNA吸附至硅胶膜上，然后洗涤和洗脱DNA。因其简便性，成为现有纯化DNA技术中的主要方法，但技术人员在使用时注意到，不加蛋白酶降解蛋白质会导致裂解液无法通过硅胶柱。因此，蛋白酶酶解过程是该方法所必需。但蛋白酶通常比较昂贵，这使得成本居高不下。一种基于硅胶柱技木，无需蛋白酶酶解的提取DNA的试剂盒，来自市售产品AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号AP-MN-BL-GDNA-50)。该试剂盒的提取过程是先裂解全血细胞，然后加入沉淀剂沉淀蛋白质，转移上清液，再利用硅胶柱结合DNA，洗涤杂质并最终洗脱DNA。常规的方法认为，提取DNA时，需先裂解细胞，释放细胞内容物，再加入试剂去除蛋白质，才能得到较高产量的DNA，因此上述试剂盒的方法将裂解和沉淀分为两个独立的步骤。现有的技术方法，成本过高，操作复杂，均不能满足需检测大量样本的试验要求，尤其在临床应用中。因此，迫切需要一种廉价、操作更便捷的提取DNA的方法。
发明内容
基于以上现有技木，本发明的目的是提供ー种快速提取DNA的方法，使用了多价金属盐作为高效的蛋白质沉淀试剂，并将裂解和沉淀两个步骤合并成ー步进行，是ー种廉价、操作更便捷的提取DNA的方法。本发明的技术方案为提供ー种快速提取DNA的方法，由以下步骤组成a、将蛋白沉淀试剂、裂解试剂和含有DNA的生物样本依次加入容器混合均匀，使细胞内容物得以释放，蛋白质发生凝聚，得到含从生物样本释放的DNA组分和非DNA组分的裂解液，所述的蛋白沉淀试剂为多价金属盐溶液；b、将步骤a中得到的裂解液中的DNA与非DNA组分分离，得到纯化的DNA溶液。优选的，上述步骤b为b、将步骤a中得到的裂解液通过离心分离得到含DNA组分的上清液，上清液转移至硅胶柱过滤后，DNA结合到硅胶柱内，洗涤和洗脱后，获得分离的纯化的DNA溶液。
优选的，上述的快速提取DNA的方法，由以下步骤组成a、将IOOul的O. 5M的硫酸锌溶液、500ul的裂解试剂，所述裂解试剂为BufferAPI、200uI全血加入I. 5ml离心管，剧烈振荡30秒，得到含DNA组分和非DNA组分的
裂解液；b、将将步骤a中得到的裂解液12000rpm离心10分钟；上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心30秒；加入700ul Buffer W1A，12000rpm离心30秒；加入800ul Buffer W2,12000rpm离心30秒；再次加入500ul Buffer W2,12000rpm离心3分钟；加入 150ul BufferTE，放置I分钟，12000rpm离心I分钟，收集滤液为分离的纯化的DNA溶液。 优选的，上述步骤中的多价金属盐为钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、铜盐中的ー种。优选的，上述步骤中的多价金属盐溶液的溶质浓度为O. 5-2M。优选的，上述步骤中的裂解试剂包括离液盐，所述离液盐选自胍盐、尿酸、碘化钠或高氯酸钠中的ー种。优选的，上述步骤中的离液盐的溶质浓度为3-6M。优选的，上述步骤中的生物样本选于全血、尿液、血清、白膜层、骨髓、淋巴细胞、血小板、体液或脱落细胞。优选的，上述步骤中的非DNA组分包括蛋白质、脂类、RNA和糖类。本发明的有益效果区别于现有的添加蛋白酶降解蛋白质的提取DNA的方法，本发明快速提取DNA的方法不使用蛋白酶降解蛋白质，不需要温育操作，而是采用高效蛋白沉淀试剂去除蛋白质污染，细胞裂解和蛋白沉淀同步进行，该方法尤其适用于蛋白质含量丰富的生物样本，故比现有技术步骤更简単，高效，也进ー步降低了使用成本。
具体实施例方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。多价金属盐比单价金属盐更有效地沉淀蛋白质。所述的多价金属盐包括钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、锰盐、亚铁盐、铜盐、铝盐或铁盐。但同吋，多价金属盐在低浓度的情况下也能沉淀 DNA, (Kejnovsky. E, · and Kypr. J. , Nucleic Acids Res.，25 (1997) 1870-1871 ；Ke jnovsky. E,. and Kypr. J. , Nucleic Acids Res.，26 (1998) 5295-5299)。用含多价金属盐试剂沉淀从生物样本释放的含DNA的内容物时，获得的DNA产量与市售产品(例如AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号AP-MN-BL-GDNA-50 )相当。基于以上原因，本发明将多价金属盐作为高效的蛋白沉淀试剂应用于DNA的分离纯化，并进ー步简化了步骤。多价金属盐选自钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、亚铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、和铜盐。本发明的蛋白沉淀试剂，尤其适用于蛋白含量丰富的生物样本的核酸提取过程，用于去除蛋白污染。进ー步地，本发明提供ー种快速提取DNA的方法，所述方法无需使用蛋白酶消化蛋白质，而是采用高效蛋白沉淀试剂去除蛋白质污染，并且使细胞裂解和蛋白沉淀同步进行。该方法尤其适用于蛋白质含量丰富的生物样本，包括但不限于全血、尿液、血清、白膜层、骨髄、淋巴细胞、血小板、体液、脱落细胞，优选全血。本发明是通过以下的技术方案达到本发明目的的在离心管依次加入蛋白沉淀试剂、裂解试剂和生物样本，剧烈振荡均匀，使细胞内容物得以释放，并且蛋白质发生凝聚，形成ー种含有生物样本的DNA组分和非DNA组分的裂解液，通过离心分离得到含DNA组分的上清液，上清液转移至硅胶柱过滤后，DNA结合到硅胶柱内，洗涤和洗脱后，获得分离的DNA溶液。上述的生物样本含有DNA，选自但不限于全血、尿液、血清、白膜层、骨髄、淋巴细胞、血小板、体液和脱落细胞，优选全血。本文涉及的“全血”是指采集于含有抗凝剂溶液中的血液，包括血细胞和血浆的所有成分。生物样本通常也含有蛋白质、脂类、糖类和RNA。本文所述的DNA是指总DNA，包含基因组DNA、线粒体DNA和质粒DNA。所述的非DNA组分来源于生物样本，从生物样本释放，包括蛋白质、脂类、糖类、RNA。
本发明的蛋白沉淀试剂是多价金属盐溶液。多价金属盐选自钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、亚铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、和铜盐，浓度为O. 5-2M。现有的蛋白沉淀试剂一般是AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒(中BufferAP20本发明的裂解试剂，含有离液盐，离液盐选自胍盐、尿酸、碘化钠、和高氯酸钠的ー种，溶质浓度为3-6M。所述的裂解试剂优选于AxyPr印血基因组DNA小量制备试剂盒中的Buffer API，或自行配置为A溶液IOOmMTris-HCl, 50mM EDTA, 5M异硫氰酸胍，IOOmMこ酸钠，PH6.4。本发明洗涤所用的试剂通常含有こ醇，浓度60%_80%之间。优选的洗涤试剂是AxyPr印血基因组DNA小量制备试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号AP-MN-BL-GDNA-50)中的 Buffer W2。所述的洗脱所用的试剂选自水、Tris溶液(IOmM Tris-HCl, pH8. 5)。优选地，洗脱试剂是AxyPr印血基因组DNA小量制备试剂盒中的Buffer TE。Buffer WlA concentrate (AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒)洗漆液。使用前，根据瓶上数量加入こ醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%こ醇或95%こ醇。Buffer W2concentrate (AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒)去盐液。使用前，根据瓶上数量加入こ醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%こ醇或95%こ醇。Buffer TE (AxyPrep 血基因组 DNA 小量制备试剂盒):5mM Tris-HCl, O. ImM EDTA,pH 8. 5ο室温密闭贮存。本发明使用的AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒为爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号AP-MN-BL-GDNA-50。实例I使用多价金属盐硫酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂与市售蛋白质沉淀剂采用现有方法提取DNA的比较本发明的蛋白质沉淀剂将硫酸锌(Sigma-Aldrich中国，分类号Z4750)加入去离子水，充分溶解后配制成溶质溶度为O. 5M、1M、2M的溶液备用。市售蛋白质沉淀剂是AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号AP-MN-BL-GDNA-50)中的Buffer AP2。
现有方法提取全血DNA 全血样本收集后，保存于4°C,96小时内使用。对各样本编号分别为Y465、Y466、Υ467、2039、2041、2045。按AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号AP-MN-BL-GDNA-50)的方法提取DNA。试剂盒的组分包括Buffer APUBuffer AP2、Buffer WlA, Buf feff2. Buffer TE和硅胶柱。提取方法如下在含有500ul Buffer API的I. 5ml离心管内加入200ul全血样本，剧烈振荡30秒；加入IOOul Buffer AP2或硫酸锌溶液，剧烈振荡30秒；12000rpm离心10分钟；收集上清液转移至娃胶柱，12000rpm离心30秒；在娃胶柱内加入700ulBufferWlA, 12000rpm 离心 30 秒；加入 800ul Buffer W2,12000rpm 离心 30 秒；再次加入 500ulBuffer W2,12000rpm离心3分钟；加入IOOul Buffer TE,室温放置I分钟，12000离心I分钟，收集滤液。如下表I为各个样本使用Buffer AP2和硫酸锌溶液采用现有方法提取的DNA紫外測定結果。按以上方法，各样本加入硫酸锌溶液的溶度分别为Y465加入O. 5Μ的硫酸锌溶液，Υ466加入O. 5Μ的硫酸锌溶液，Υ467加入IM的硫酸锌溶液，2039加入IM的硫酸锌溶液，2041加入2Μ的硫酸锌溶液，2045加入2Μ的硫酸锌溶液。表I
权利要求
1.一种快速提取DNA的方法，其特征在于，由以下步骤组成 a、将蛋白沉淀试剂、裂解试剂和含有DNA的生物样本依次加入容器混合均匀，使细胞内容物得以释放，蛋白质发生凝聚，得到含从生物样本释放的DNA组分和非DNA组分的裂解液，所述蛋白沉淀试剂为多价金属盐溶液； b、将步骤a中得到的裂解液中的DNA与非DNA组分分离，得到纯化的DNA溶液。
2.根据权利要求I所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述步骤b为 b、将步骤a中得到的裂解液通过离心分离得到含DNA组分的上清液，上清液转移至硅胶柱过滤后，DNA结合到硅胶柱内，洗涤和洗脱后，获得分离的纯化的DNA溶液。
3.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，由以下具体步骤组成 a、将IOOul的0.5M的硫酸锌溶液、500ul的裂解试剂，所述裂解试剂为BufferAPl、200ul全血加入I. 5ml离心管，剧烈振荡30秒，得到含DNA组分和非DNA组分的裂解液； b、将步骤a中得到的裂解液12000rpm离心10分钟；上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心 30 秒；加入 700ul Buffer WlA, 12000rpm 离心 30 秒；加入 800ulBuffer W2,12000rpm离心30秒；再次加入500ul Buffer W2,12000rpm离心3分钟；加入150ul Buffer TE,放置I分钟，12000rpm离心I分钟，收集滤液为分离的纯化的DNA溶液。
4.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述多价金属盐为钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、铜盐中的一种。
5.根据权利要求4所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述多价金属盐溶液的溶质浓度为0. 5-2M。
6.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的裂解试剂包括离液盐，所述离液盐选自胍盐、尿酸、碘化钠或高氯酸钠中的一种。
7.根据权利要求6所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述离液盐的溶质浓度为3-6M。
8.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的生物样本选于全血、尿液、血清、白膜层、骨髓、淋巴细胞、血小板、体液或脱落细胞。
9.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的非DNA组分包括蛋白质、脂类、RNA和糖类。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取DNA的方法。本发明的目的是提供一种廉价、操作更便捷的提取DNA的方法。其由以下步骤组成a、将蛋白沉淀试剂、裂解试剂和含有DNA的生物样本依次加入容器混合均匀，使细胞内容物得以释放，蛋白质发生凝聚，得到含从生物样本释放的DNA组分和非DNA组分的裂解液，所述的蛋白沉淀试剂为多价金属盐溶液；b、将步骤a中得到的裂解液中的DNA与非DNA组分分离，得到纯化的DNA溶液。本发明的有益效果为本发明采用高效蛋白沉淀试剂去除蛋白质污染，细胞裂解和蛋白沉淀同步进行，比现有技术步骤更简单，高效，也进一步降低了使用成本。
文档编号C12N15/10GK102676503SQ20121015177
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者任维, 梁少明, 龚敬文 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司