专利名称：一种筛查alk融合基因的方法
技术领域：
本发明属于医药和生物技术领域，涉及ALK融合基因的筛查方法，尤其是ALK融合基因筛查的多片段引物及其应用。
背景技术：
据研究报道，对于非小细胞肺癌(NSCLC)，针对特定的靶点开展个体化治疗已成为现实，例如通过检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变，筛选适合EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗的患者亚群。据美国麻省总医院研究人员发表研究论文称，检测一种间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因如(EML4-ALK)，可对NSCLC患者作进一步细分。ALK融合基因于2007年开始见诸NSCLC相关研究报告。在此之前，研究者已经在多种肿瘤中识别了涉及ALK的基因变异，例如间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤 和成神经细胞瘤等，但不包括肺癌。现有技术公开了 ALK融合基因迄今已发现多种变异类型。分析这些融合基因的结构发现，其ALK部分均包括开始于第20外显子的编码细胞内酪氨酸激酶结构域的基因片段。经检测，所有这些融合基因均有生物学功能，其表达产物为一种嵌合酪氨酸激酶。传统上对ALK融合基因的筛查包括两种主要形式1、普通PCR，通过设计引物，对某一种具体的融合形式进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳判断结果；2、荧光原位杂交(FISH)，通过荧光标记的DNA探针特异性地与肿瘤组织DNA中ALK基因5’端和3’端进行杂交，结果在突光显微镜下判读。对于普通PCR筛查方法，实践显示其具有以下明显缺陷由于ALK融合基因的具体形式众多，所以至少需要设计多对PCR引物，分别进行多次PCR反应，费时费力；并且如果样本是一种新的ALK融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，则使用此方法则无法有效地进行检测，而出现假阴性的结果。对于荧光原位杂交(FISH)，虽然目前被认为是诊断融合基因的金标准，但是其价格高昂，实验步骤复杂，对操作人员的技术水平要求极高，致使其亦无法进行推广。因此，目前临床实践中需要提出更加简单、方便、灵敏的ALK融合基因的筛查工具和筛查方法。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种新的筛查ALK融合基因的方法，尤其涉及ALK融合基因的real-time PCR联合引物及其应用。本发明提供了筛选ALK融合基因的real-time PCR联合引物。本发明的进一步目的是提供上述real-time PCR联合引物在筛查ALK融合基因方法中的应用，本发明方法能准确、简捷、经济、直观地判断ALK融合基因存在与否。本发明的筛查ALK融合基因方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。具体而言，本发明提供的一种筛选ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步骤(I)设计筛查ALK融合基因的7对real-time PCR联合引物或探针；(2)提取样本中的总RNA ；(3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA ；(4)在7个real-timePCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(I)中设计的7对引物或探针，以及包括荧光染料在内的反应预混液；
(5)在real-time PCR反应仪上进行real-time PCR反应,并分别记录每个样本的7个反应单位的荧光阈值(Ct值)；(6)分别计算引物或探针I IV所在反应体系的Ct值的均值Ctiffip，和引物或探针V VII所在反应体系的CT值的均值CtBBP ；(7)计算相对表达量值2_'CT，其中-ACT = -(Ct^p-CtBBp);如2_'CT大于12，则认为该样本具有ALK融合基因。本发明中，筛选ALK融合基因的real-time PCR联合引物或探针由7对上游引物、下游引物组成，所述7对引物其核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1-14所示，其中第I对SEQID NO 1-2，第 II 对 SEQ ID N03-4，第 III 对 SEQ ID N05-6，第 IV 对 SEQ ID N07-8，第 V 对SEQ ID N09-10，第 VI 对 SEQ ID N011-12，第 VII 对 SEQ ID N013-14。上述引物和探针可以从特定组织中克隆，也可以用化学合成的方法人工合成。本发明中，real-time PCR即实时荧光定量聚合酶链反应。聚合酶链反应简称为PCR,其基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸=DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，将待扩目的基因不断扩增放大。实时荧光定量PCR，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。real-time PCR以Ct值为重要的计量单位，反应每个反应单位内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。本发明中，反应单位指一个real-time PCR反应单位,例如384孔板或96孔板的一个孔。反应一起可以使用如ABI公司的7900HT Fast、Roche公司的Lightcycler480等。本发明中，包括突光染料在内的反应预混液,可以使用商品化产品如Invitrogen公司的 PowerSYBR Green PCR Master Mix、TaKaRa 公司的SYBR Premix DimerEraser 、BIOTIUM公司的Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix ;也可以使用含有类似荧光染料的具有想尽功能的自制预混物。本发明中，未及详述的操作均参考冷泉港实验室的《分子克隆》，10-50bp的寡聚核苷酸序列采用人工合成方法，也可以从上海生工公司购买；生物试剂从美国Invitrogen公司或北京天根公司的生物制剂公司购买。本发明进行了非小细胞肺癌体外样本的ALK融合基因筛检并验证，结果显示，本发明方法的准确性达到100%，敏感性高于普通PCR方法，特异性与金标准FISH相同，通过本方法检测的结果未出现假阳性或假阴性本发明的筛查ALK融合基因方法，法以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物对，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本方法与现有技术比较，具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。而现有技术中，需经PCR反应、琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下观察目标片段情况；或者需要经石蜡切片、脱蜡、杂交、封片再通过荧光显微镜观察等繁杂的人工分析等过程才能得到结果，操作步骤繁多，对人员技术要求高，需要使用较多的仪器设备和实验耗材，成本高，耗时多。而且在操作过程中容易造成实验室污染。 本发明的突出优点在于本方法设计了 real-time PCR联合引物，以引物对的联合分析进行识别，仅通过一次real-time PCR反应，即可快捷地完成实验全过程，并且实验结果可以快速、直观的判读，能够方便地得到准确明晰的结果。本发明方法既适合于大规模的体外样本筛查，又适合于对临床对可疑具有ALK融合基因肿瘤的初步检测，因此具有较高的科研和临床使用价值。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
具体实施例方式实施例I实时荧光定量双标记探针PCR法I、提取样本中的总RNA，并反转为cDNA。2、引物及探针设计引物对I上游引物TCTGTGCTGGGCATCTTCAAC(SEQID NO I)下游引物CATGCACGCTTCTGTTCACAC(SEQID NO 2)引物对II上游引物TGTGAACAGAAGCGTGCATGA(SEQID NO 3)下游引物TCTCTCTGGGTGGAACGTGT(SEQID NO 4)引物对III上游引物CAGACACGTTCCACCCAGAGA(SEQID NO 5)下游引物GTGGCACCCTCCTGCAAAGAT(SEQID NO 6)引物对IV上游引物CCGAAATGGATGGGGAAGATGG(SEQID NO 7)
下游引物TCAGGGTCCATGTGACATTCGTC(SEQID NO 8)引物对V上游引物TGTGCTCTGAACAGGACGAACT(SEQID NO 9)下游引物TGAGCTCCAGCAGGATGAACC(SEQID NO 10)引物对VI上游引物TGCCTGTGGCTGTCAGTATTTGG(SEQID NO 11)下游引物GGCACAGCCTCCCTTTCTATAGTAG(SEQID NO 12)引物对VII上游引物CCAGAGGCCTTCATGGAAGGA(SEQID NO 13)下游引物GCCTCCACTGGTGACAAACTC(SEQID NO 14)3、反应体系(IOul)
权利要求
1.一种筛查ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步骤 (1)设计筛查ALK融合基因的7对real-timePCR联合引物或探针； (2)提取样本中的总RNA； (3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA； (4)在7个real-timePCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(I)中设计的7对引物，以及包括荧光染料在内的反应预混液； (5)在real-timePCR反应仪上进行real-time PCR反应,并分别记录每个样本的7个反应单位的荧光阈值Ct值； (6)分别计算引物I IV所在反应体系的Ct值的均值CtABP，和引物V VII所在反应体系的CT值的均值CtBBP ； (7)计算f，判定样本中是否具有ALK融合基因。
2.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的联合引物对或探针的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1-14所示。
3.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步骤(7)中，结果的判定标准为 相对表达量值 2_Δα，其中- ACT = -(CtABP-CtBBP)； 有ALK融合基因2_Δα彡12 ； 无ALK融合基因2_Δετ < 12。
4.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的ALK融合基因是非小细胞肺癌相关的ALK融合基因。
5.SEQ ID NO 1-14的real-time PCR联合引物对或探针在制备筛查ALK融合基因突变的制剂中的用途。
全文摘要
本发明属于医药和生物技术领域，涉及筛查ALK融合基因的方法，尤其是ALK融合基因筛查的多片段引物及其应用。本发明的筛查ALK融合基因的方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入加入核苷酸编码序列如SEQ IDNO 1-14所示的real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本发明方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。
文档编号C12N15/11GK102888452SQ20121015841
公开日2013年1月23日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者陈海泉, 孙艺华, 王瑞, 潘云建, 胡海川, 李晨光, 王磊, 叶挺, 罗晓阳, 李航, 张扬 申请人:复旦大学附属肿瘤医院