专利名称：一种人角膜基质细胞系的构建方法
技术领域：
本发明属于角膜细胞培养技术领域，具体涉及一种人角膜基质细胞系的构建方法。
背景技术：
人角膜基质层(corneal stroma)由人角膜基质细胞和胶原纤维构成,厚约50_60微米，约占整个角膜厚度的90%，胶原纤维形成200-250个板层，各板层之间相互平行重叠并具有一定的曲率半径，且与角膜表面平行，保证了角膜的透明性。目前研究显示，临床上很多严重的角膜疾病如深度热烧伤、机械或手术创伤和化学灼伤以及多种病原微生物感染等，均可引起人角膜基质细胞受损，通常会导致角膜水肿和瘢痕形成从而使视力受损，严重 者将导致角膜不透明，即引发角膜基质病盲疾病。角膜移植手术是目前角膜基质病盲患者得以治愈的唯一有效手段，但由于捐献的角膜数量极其有限，绝大部分角膜基质病盲患者得不到可用的捐献角膜而无法复明。近一个世纪以来，角膜组织工程技术的快速发展，使组织工程人角膜基质的体外重建及其作为捐献角膜的等效替代物用于临床角膜移植成为可能，也为角膜基质病盲患者通过移植组织工程人角膜基质重见光明创造了条件。但如何在体外获得形态结构和功能正常的大量人角膜基质细胞，一直是组织工程人角膜基质体外重建研究领域的热点和主攻方向。对人角膜基质细胞的体外培养研究开始于20世纪70年代，Stoesser TR等首次对人角膜基质细胞进行了体外培养。随后，学者们先后对人角膜基质细胞的培养液和体外培养条件进行了研究，发现一些生长因子(Borderie V等，1998)、胎盘聚脱氧核苷酸(Muratore 0等,2003)、肝素(Denk PO and Knorr M, 1999)等对角膜基质细胞具有一定的促分裂作用，但离细胞系的建立还相距甚远。20世纪90年代，许多学者纷纷利用人乳突淋 瘤病毒(Peters DM等，1996)、端粒酶(Jester JV等,2003)、猿猴红疱疫病毒(Manzer AK等，2009)、腺病毒(Yoshiko K等，2010)等对人角膜基质细胞进行了转染研究，获得了可传代培养的角膜基质细胞，甚至获得了几个永生化的细胞系，但由于细胞携带肿瘤病毒癌基因而具有潜在的致瘤性，而无法用于组织工程人角膜基质的体外重建及其临床应用。因此，尽早建立起一种不经过肿瘤病毒癌基因转染的无潜在致瘤性的人角膜基质细胞系，已成为全世界角膜组织工程学家的主攻目标，也是组织工程人角膜基质体外重建成功以及全世界角膜基质病盲患者通过临床移植重见光明的关键。2005年，樊廷俊等利用眼库捐献角膜成功启动了人角膜内皮细胞的体外培养，并通过改变培养基配方和培养条件成功构出非转染、无致瘤性的人角膜内皮细胞系和人角膜上皮细胞系。2011年，樊廷俊等利用眼库捐献角膜成功启动了人角膜上皮细胞的体外培养，并通过改变培养基配方和培养条件成功构出非转染、无致瘤性的人角膜上皮细胞系。但目前为止，未见有利用人角膜基质组织成功构建出非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种人角膜基质细胞系的构建方法，从而有效的建立起非转染、无致瘤性的人角膜基质细胞系，为组织工程人角膜基质以及组织工程全层人角膜的规模化体外重建提供足量的人角膜基质细胞。本发明的构建方法从眼库中取出人角膜，用0. 9%生理盐水清洗后放入超净工作台中，用庆大霉素消毒后用0. 9%生理盐水清洗后用眼科镊先后撕下带后弹力层的角膜内皮和带前弹力层的角膜上皮，用无血清DMEM/F12培养液冲洗后用眼科剪把角膜平均剪成8片，用胰蛋白酶浸泡消化后用含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，用无血清DMEM/F12培养液冲洗遍后，以每个角膜片朝向后弹力层的面朝下平铺于24孔板的孔底，力口A 0. ro. 2毫升含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5% 二氧化碳培养箱中、37°C下、进行贴板培养12 16小时，将培养液更换为人角膜基质细胞专用培养液继续培养，每3飞天更换新培养液I次，待迁出的细胞长满孔底后去除角膜基质片，用玻璃吸管吸出培养孔中的旧培养液，每孔加入0. ro. 2毫升胰蛋白酶静置消化后吸出酶液，每培养孔中加入I毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底制成人角膜基质细胞悬液；从每培养孔中分别取出0. 5毫升细胞悬液，分别加入到2个新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0. 5毫升，使之最终体积至I毫升；待人角膜基质细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。所用人角膜基质细胞专用培养液的配方为DMEM/F12培养液，20%胎牛血清，0. 4%0 I. 0%。羧甲基壳寡糖，0. 01%。^0. 02%。的人碱性成纤维细胞生长因子。为了促进人角膜基质细胞的迁出，本发明又添加了 0. 1%0 ^0. 2%。的I型胶原蛋白和0. 05%。 0. 1%。的II型胶原蛋白。为了促进人角膜基质细胞的快速增殖，本发明又添加了 0. 01%。^0. 02%。的人基质细胞衍生因子I。本发明方法在启动人角膜基质细胞的原代培养时将带有前弹力层的角膜上皮和带有后弹力层的角膜内皮撕下，以保证所获得的细胞不掺杂上皮和内皮细胞而仅为纯净的人角膜基质细胞。人角膜基质细胞自原代培养启动第3天开始从组织块迁出，细胞为成纤维样，生长分裂旺盛，10天后可长成细胞单层，经过连续的继代培养后已传至126代，完成了人角膜基质细胞系的构建，细胞形态仍为成纤维样，生长分裂依然十分旺盛。本发明的构建方法利用人角膜基质组织可成功建立未经任何转染的人角膜基质细胞系，经这种方法所获得的传代细胞可传60代以上，本发明所构建的角膜基质细胞系现已传至第126代。该细胞建系技术的主要特点是细胞系可以连续传代，能提供出大量的人角膜基质细胞；细胞系细胞未经任何转染，没有致瘤性，可直接应用于人工角膜基质及全层角膜的研制和临床应用；应用于人工角膜基质及全层生产和临床治疗的成本低。
具体实施例方式I、角膜片贴板培养的启动从眼库中取出2个完整的人角膜，放入直径35毫米的玻璃培养皿中，加入5^10毫升0. 9%生理盐水，清洗3飞分钟；于超净工作台中吸出生理盐水后，加入3飞毫升的浓度为209^70%的庆大霉素，浸泡1(T20分钟进行消毒处理，以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均为无菌；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜平放于含有5 10毫升0. 9%生理盐水的新玻璃培养皿中，用尖头眼科镊先后撕下带后弹力层的角膜内皮和带前弹力层的角膜上皮，用无血清DMEM/F12培养液冲洗f 2遍后，用眼科剪沿角膜中心点把角膜平均剪成8片，把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下的方向平放于培养皿底部，轻轻加入3飞毫升0. 29TO. 5%的胰蛋白酶浸泡消化2 3分钟，吸出胰蛋白酶后加A 5^10毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸出终止用的培养液后再加A 5^10毫升无血清DMEM/F12培养液冲洗f 2遍，用眼科镊把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下贴入24孔板的孔底，每孔加入0. ro. 2毫升含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5% 二氧化碳培养箱中、37°C下进行贴板培养。2、人角膜基质细胞原代培养的启动角膜基质片贴板培养12 16小时后，吸出旧培养液每孔加入I毫升人角膜基质细胞专用培养液，于5% 二氧化碳培养箱中、37°C启动人角膜基质细胞的原代培养，每3飞天更换人角膜基质细胞专用培养液I次，待迁出的细胞长满孔底后，进行继代培养。
3、人角膜基质细胞专用培养液的配制取常规配制的DMEM/F12培养液3. 0毫升，然后依次加入羧甲基壳寡糖I. 6^4. 0毫克和人碱性成纤维细胞生长因子0. 04、. 08毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，即为本发明的人角膜基质细胞专用培养液。为了促进人角膜基质细胞的迁出，本发明在上述专用培养液的基础上又添加了0. 4^0. 8毫克的I型胶原蛋白和0. 2^0. 4毫克的II型胶原蛋白。为了促进人角膜基质细胞的快速增殖，本发明在上述专用培养液的基础上又添加了 0. 04、. 08毫克的人基质细胞衍生因子I。4、人角膜基质细胞的继代培养待迁出的细胞长满孔底后去除角膜基质片，用玻璃吸管吸出培养孔中的旧培养液，每孔加入0. fo. 2毫升0. 29TO. 5%胰蛋白酶静置消化广2分钟，倾斜培养板孔轻轻吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入I毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3飞分钟制成人角膜基质细胞悬液；从每培养孔中分别取出0. 5毫升细胞悬液，分别加入到2个新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0. 5毫升，使之最终体积至I毫升；待人角膜基质细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。实施例I从眼库中取出2个完整的人角膜,放入直径35晕米的玻璃培养皿中，加入5晕升0. 9%生理盐水，清洗5分钟；于超净工作台中吸出生理盐水后，加入5毫升的浓度为70%的庆大霉素，浸泡10分钟进行消毒处理，以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均为无菌；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜平放于含有10毫升0. 9%生理盐水的新玻璃培养皿中，用尖头眼科镊先后撕下带后弹力层的角膜内皮和带前弹力层的角膜上皮，用无血清DMEM/F12培养液冲洗2遍后，用眼科剪沿角膜中心点把角膜平均剪成8片，把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下的方向平放于培养皿底部，轻轻加入3毫升0. 25%的胰蛋白酶浸泡消化3分钟，吸出胰蛋白酶后加入5毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸出终止用的培养液后再加入5毫升无血清DMEM/F12培养液冲洗2遍，用眼科镊把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下贴入24孔板的孔底，每孔加入0. I毫升含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5% 二氧化碳培养箱中、37°C下进行贴板培养。取常规配制的DMEM/F12培养液3. O毫升，然后依次加入羧甲基壳寡糖I. 6^4. O毫克和人碱性成纤维细胞生长因子0. 04、. 08毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，即为本发明的人角膜基质细胞专用培养液。培养12小时后吸出旧培养液每孔加入I毫升人角膜基质细胞专用培养液，于5% 二氧化碳培养箱中、37°C启动人角膜基质细胞的原代培养，每3天更换人角膜基质细胞专用培养液I次。待迁出的细胞长满孔底后去除角膜基质片，用玻璃吸管吸出培养孔中的旧培养液，每孔加入0. I毫升0. 25%胰蛋白酶静置消化I分钟，倾斜培养板孔轻轻吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入I毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底5分钟制成人角膜基质细胞悬液；从每培养孔中分别取出0. 5毫升细胞悬液，分别加入到2个新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0. 5毫升，使之最终体积至I毫升；待人角膜基质细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。
实施例2从眼库中取出2个完整的人角膜，放入直径35毫米的玻璃培养皿中，加入10毫升0. 9%生理盐水，清洗3分钟；于超净工作台中吸出生理盐水后，加入3毫升的浓度为20%的庆大霉素，浸泡20分钟进行消毒处理，以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均为无菌；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜平放于含有8毫升0. 9%生理盐水的新玻璃培养皿中，用尖头眼科镊先后撕下带后弹力层的角膜内皮和带前弹力层的角膜上皮，用无血清DMEM/F12培养液冲洗I遍后，用眼科剪沿角膜中心点把角膜平均剪成8片，把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下的方向平放于培养皿底部，轻轻加入4毫升0. 5%的胰蛋白酶浸泡消化I分钟，吸出胰蛋白酶后加入2毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸出终止用的培养液后再加入10毫升无血清DMEM/F12培养液冲洗I遍，用眼科镊把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下贴入24孔板的孔底，每孔加入0. 2毫升含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5% 二氧化碳培养箱中、37°C下进行贴板培养。取常规配制的DMEM/F12培养液3. 0毫升，然后依次加入羧甲基壳寡糖I. 6^4. 0毫克和人碱性成纤维细胞生长因子0. 04、. 08毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，即为本发明的人角膜基质细胞专用培养液。培养18小时后吸出旧培养液每孔加入I毫升人角膜基质细胞专用培养液，于5% 二氧化碳培养箱中、37°C启动人角膜基质细胞的原代培养，每4天更换人角膜基质细胞专用培养液I次。待迁出的细胞长满孔底后去除角膜基质片，用玻璃吸管吸出培养孔中的旧培养液，每孔加入0.2毫升0. 2%胰蛋白酶静置消化2分钟，倾斜培养板孔轻轻吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入I毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底4分钟制成人角膜基质细胞悬液；从每培养孔中分别取出0. 5毫升细胞悬液，分别加入到2个新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0. 5毫升，使之最终体积至I毫升；待人角膜基质细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。实施例3从眼库中取出2个完整的人角膜，放入直径35毫米的玻璃培养皿中，加入8毫升
0.9%生理盐水，清洗4分钟；于超净工作台中吸出生理盐水后，加入4毫升的浓度为50%的庆大霉素，浸泡15分钟进行消毒处理，以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均为无菌；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜平放于含有5毫升0. 9%生理盐水的新玻璃培养皿中，用尖头眼科镊先后撕下带后弹力层的角膜内皮和带前弹力层的角膜上皮，用无血清DMEM/F12培养液冲洗2遍后，用眼科剪沿角膜中心点把角膜平均剪成8片，把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下的方向平放于培养皿底部，轻轻加入5毫升0. 2%的胰蛋白酶浸泡消化2分钟，吸出胰蛋白酶后加入10毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸出终止用的培养液后再加入8毫升无血清DMEM/F12培养液冲洗2遍，用眼科镊把每个角膜片按照朝向后弹力层的面朝下贴入24孔板的孔底，每孔加入0. 15毫升含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5% 二氧化碳培养箱中、37°C下进行贴板培养。取常规配制的DMEM/F12培养液3. 0毫升，然后依次加入羧甲基壳寡糖4. 0毫克和人碱性成纤维细胞生长因子0. 08毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，即为本发明的人角膜基质细胞专用培养液。培养24小时后吸出旧培养液每孔加入I毫升人角膜基质细胞专用培养液，于5% 二氧化碳培养箱中、37°C启动人角膜基质细胞的原代培养，每5天更换人角膜基质细胞专用培养液I次。待迁出的细胞长满孔底后去除角膜基质片，用玻璃吸管吸出培养孔中的旧培养液，每孔加入0. I毫 升0. 5%胰蛋白酶静置消化I分钟，倾斜培养板孔轻轻吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入I毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3分钟制成人角膜基质细胞悬液；从每培养孔中分别取出0. 5毫升细胞悬液，分别加入到2个新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0. 5毫升，使之最终体积至I毫升；待人角膜基质细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。目前实施例I建立的人角膜基质细胞系已传至126代。已利用该细胞系细胞进行了组织工程人角膜基质的体外构建研究，并将重建的角膜基质进行了动物移植实验，实验结果证明，本发明构建的人角膜基质细胞系可以用于组织工程人角膜基质体外构建的种子细胞，所构建的组织工程人角膜基质能够很好的在移植动物上起到修复作用，具有广阔的开发前景。
权利要求
1.一种人角膜基质细胞系的构建方法，其特征在于所述的构建方法是先将角膜取出后用庆大霉素消毒，再撕除带有后弹力层的角膜内皮和带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜基质组织块后进行消化处理，将角膜基质组织块按近后弹力层面向下平贴于培养孔的底部，然后先加入无血清培养液在二氧化碳培养箱中、37°C下进行贴板培养，后将培养液更换为人角膜基质细胞专用培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，培养至第60代完成了人角膜基质细胞系的构建；其中，人角膜基质细胞专用培养液为含有20%胎牛血清、0. 4% I. 0%。羧甲基壳寡糖和0. 01%。^0. 02%。人碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/Fl2培养液。
2.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于上述的培养液中还添加有0.1%0 "0. 2%0的I型胶原蛋白和0. 05%。^0. 1%。的II型胶原蛋白。
3.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于上述的培养液中还添加有·0.01%。 0. 02%。的人基质细胞衍生因子I。
4.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于上述的贴壁培养是先将贴有人角膜基质组织块的培养孔中加入0.广0. 3毫升的无血清DMEM/F12培养液，在二氧化碳培养箱中37°C下进行贴板培养12-16小时后，再将每个培养孔中的无血清培养液更换为I毫升人角膜基质细胞专用培养液。
全文摘要
一种人角膜基质细胞系的构建方法，具体涉及一种利用海水鱼类胶原蛋白制备组织工程人角膜基质载体支架的方法，是采用非酶解鳕鱼皮胶原蛋白冻干粉充分溶解于盐酸中，离心去除沉淀后将上清液分装入培养板孔中冻干，加入含硫酸软骨素的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联剂进行交联，用碱性Na2HPO4溶液稳定后，用2M NaCl、1M NaCl和蒸馏水清洗，冻干后完成制备。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可用于批量生产，满足组织工程人工角膜基质规模化重建对载体支架的大量需求，为人角膜基质病盲通过临床角膜移植和重见光明创造条件，且此载体支架制备以及应用于组织工程人工角膜基质体外重建和临床治疗的成本低。
文档编号C12N5/071GK102703375SQ20121016324
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者徐晓辉, 杜玉堂, 樊廷俊, 王宝泉, 苗莹, 赵君 申请人:中国海洋大学, 青岛中皓生物工程限公司