专利名称：一种用海藻酸钠-壳聚糖固定磷脂酶A<sub>2</sub>的方法
技术领域：
本发明涉及一种固定磷脂酶A2的方法。
背景技术：
磷脂酶A2 (PLA2)是一类能够在磷脂甘油部分的Sn-2位点选择性断裂酯键的酶，其可将磷脂水解成一系列生物活性介质；由于PLA2酶源来自猪胰腺，相对短缺，未推广开。最早将酶法脱胶用于工业生产的是德国Lurgi公司，国内也有不少相关报道，现今用于脱胶的酶主要是 Novo 公司推出的 Lecitase IOL (PLA2), Lecitase Novo (PLA1)和 LecitaseUltra(PLA1)0其中，猪胰脏来源的磷脂酶LecitaselOL已不用于油脂脱胶，而被更具优势的微生物Rohalase MPL(PLA2)所代替。但是，游离的Rohalase MPL (PLA2)价格昂贵，不易回收，而且对条件要求较高，不 能够适应苛刻的水解条件。而对于固定化磷脂酶A2来讲，其有以下优势(a)易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化；(b)酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低；(C)可以增加产物的收率，提高产物质量；(d)可以在较长时间内连续生产；(e)酶反应条件容易控制；(f)较水溶性酶更适合于多酶反应；(g)酶的使用效率高，使用成本低；(h)适于产业化、连续化、自动化生广等。制备固定化酶的方法主要有吸附、包埋、共价键结合和交联法等，其中包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，具有反应条件温和、很少改变酶分子结构、酶活力损失小等优点。海藻酸钠、壳聚糖是最为常见的包埋材料，因此可用其来作为固定化酶的载体。二价金属离子如Ca2+与可溶性海藻酸钠反应生成海藻酸钙微凝胶，而海藻酸钠、壳聚糖可与戊二醛基形成SchifT氏碱，在胶囊表面形成一层致密的保护膜，可增加微胶囊球的强度。以海藻酸钠-壳聚糖为包埋材料，戊二醛为交联剂，固定化PLA2，最终选择出最优的固定化条件。
发明内容
本发明是为了解决酶法脱胶过程中，游离磷脂酶A2易失活变性且不易回收、但是现今磷脂酶A2的固定化未见报道的问题，而提出的用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法。用海藻酸钠-壳聚糖复合载体固定化磷脂酶A2的方法通过以下步骤实现一、磷脂酶A2的固定化。二、固定化酶酶活力的测定。三、海藻酸钠-壳聚糖固定化条件的优化。四、通过固定化酶微球的SEM图像进一步解释利用海藻酸钠-壳聚糖复合载体固定化磷脂酶的优势。采用海藻酸钠-壳聚糖作为载体固定化磷脂酶A2,海藻酸钠-壳聚糖作为载体，不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，具有反应条件温和、很少改变酶分子结构、酶活力损失小等优点；此外，海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2最终得到的固定化酶微球机械强度好，酶活回收率可以达到74. 8%，对于油脂精炼中的酶法脱胶工艺具有重要指导意义。
具体实施例方式具体实施方式
一用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法通过以下步骤实现一、固定化磷脂酶A2的制备称取一定量的海藻酸钠在40°C水浴中保温溶解，同时称取一定量的壳聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保温溶解，再向完全溶解的壳聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混匀。用移液枪准确移取Iml稀释10倍的酶液于一定浓度的IOmL海藻酸钠溶液中，搅拌均匀。静止一段时间后，用灭菌后的IOmL注射器吸入上述混合液，以约5滴/s注入一定浓度的IOmL壳聚糖醋酸溶液、CaCl2混合溶液中，以转速180r/min搅拌，形成光滑的微胶囊球，再加入一定浓度戊二醛，同时快速搅拌，将其置于4°C环境固定化一定时间。将微胶囊以 pH8. ONaHCO3^O. lmol/L NaCl、0. lmol/L pH5. 5NaAc、pH8. 0 Tris-HCl顺序洗涤后，然后进行冷冻干燥；二、固定化酶酶活力的测定；三、测定酶活力进而计算酶活回收率；四、固定化条件的优化分别在海藻酸钠浓度O. 5% 3.0%，壳聚糖浓度为I. 0% 3. 5%，氯化钙浓度为O. lmol/L O. 35mol/L，戊二醛浓度为O. 2%
0.45%,交联时间为3. 5h 8. 5h的条件下,通过测定固定化酶活力回收率得到最佳的固定 化条件；五、采用响应面法进行分析讨论最终确定最佳固定化条件；六、通过固定化酶微球的SEM图像进一步解释利用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的优势。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中将将浓度为I. 5% 2. 5%的海藻酸钠在40°C水浴中保温溶解的条件下进行磷脂酶A2的固定化。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中将浓度为
1.5% 2. 5%的壳聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保温溶解的条件下进行磷脂酶A2的固定化。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中向完全溶解的壳聚糖醋酸溶液中加入浓度为O. 2mol/L O. 3mol/L的CaCl2溶液，对磷脂酶A2进行固定化。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中向形成的光滑微胶囊球的混合溶液中加入浓度为O. 25% O. 35%的戊二醛，对磷脂酶A2进行固定化。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中交联时间6. 5h 7. 5h，对磷脂酶A2进行固定化。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤五中采用响应面分析法进一步分析最佳固定化条件。其它步骤与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.ー种用海藻酸钠-壳聚糖固定磷脂酶A2的方法，其特征在于用海藻酸钠-壳聚糖复合载体固定磷脂酶A2通过以下步骤实现 步骤ー在40°C水浴中分别保温溶解浓度为0. 5% 3. 0%的海藻酸钠，同时称取一定量的壳聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保温溶解，再向完全溶解的壳聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混匀。用移液枪准确移取Iml稀释10倍的酶液于一定浓度的IOmL海藻酸钠溶液中，搅拌均匀。静止一段时间后，用灭菌后的IOmL注射器吸入上述混合液，以约5滴/s注入一定浓度的IOmL壳聚糖醋酸溶液、CaCl2混合溶液中，以转速180r/min搅拌，形成光滑的微胶囊球，再加入一定浓度戊ニ醛，同时快速搅拌，将其置于4°C环境固定化一定时间。将微胶囊以 pH8. ONaHCO3>0. lmol/L NaCl、0. lmol/L pH5. 5NaAc、PH8. OTris-HCl顺序洗涤后，然后进行冷冻干燥，制得的固定化酶进行酶活力測定分析，确定海藻酸钠浓度； 步骤ニ 选择壳聚糖浓度分别为I. 0% 3. 5%，过程同步骤一，确定壳聚糖浓度； 步骤三选择氯化钙浓度分别为0. lmol/L 0. 35mol/L,过程同步骤一，确定氯化钙浓度； 步骤四选择戊ニ醛浓度分别为0.2% 0. 45%，过程同步骤一，确定戊ニ醛浓度； 步骤五选择交联时间分别为3. 5h 8. 5h，过程同步骤一，确定交联时间。
2.根据权利要求I所述的ー种用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步骤一中将浓度为I. 5% 2. 5%的海藻酸钠在40°C水浴中保温溶解。
3.根据权利要求I所述的ー种用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步骤ニ中将浓度为I. 5% 2. 5%的壳聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保温溶解。
4.根据权利要求I所述的ー种用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步骤三中向完全溶解的壳聚糖醋酸溶液中加入浓度为0. 2mol/L 0. 3mol/L的CaCl2溶液。
5.根据权利要求I所述的ー种用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步骤四中向形成的光滑微胶囊球的混合溶液中加入浓度为0. 25% 0. 35%的戊ニ醛。
6.根据权利要求I所述的ー种用海藻酸钠-壳聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步骤五中交联时间6. 5h 7. 5h。
全文摘要
本发明提供一种以海藻酸钠-壳聚糖复合载体为材料，采用物理包埋的方法来固定磷脂酶A2。研究了海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、钙离子浓度、戊二醛浓度和交联时间等不同固定化条件对磷脂酶A2固定效率和催化效果的影响，并采用响应面的分析方法对所研究的因素进行优化。通过固定磷脂酶A2的SEM图像进一步解释利用海藻酸钠-壳聚糖作为载体固定磷脂酶A2的优势。根据本发明中复合载体的包埋特性固定磷脂酶A2，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产，最终得到的固定化酶活力回收率为74.8％，对于油脂精炼中的酶法脱胶工艺具有重要指导意义。
文档编号C12N11/10GK102796721SQ20121016370
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者于殿宇, 江连洲, 胡立志, 李宝昌, 张佳宇, 邹小雨, 刘鑫, 李万振, 宋鹏, 王玥, 宋云花, 张春艳 申请人:东北农业大学