专利名称：密码子优化的7β-羟基类固醇脱氢酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种按大肠杆菌密码子偏爱性优化的的7β_羟基类固醇脱氢酶σβ-HSDH)基因。
背景技术：
熊胆是名贵的中药材，用于治疗胆结石疾病以及各种急性、慢性肝病，具有良好的治疗效果。熊去氧胆酸(3 α -7 β - 二羟基-5 β -胆烷酸，以下简称UDCA)以及牛磺/甘氨熊去氧胆酸(T/GUDCA)是中药材熊胆的主要有效成份。然而，由于中药熊胆粉主要的获取方式为“活熊引流取胆”，这有违野生动物保护法。并且被认为是非常不人道的获取方式。另外，化学合成法过程复杂、得率较低。然而动物胆汁中存在众多胆酸类物质，如牛、羊胆酸、鹅去氧胆酸、熊胆酸、猪胆酸、猪去氧胆酸等，这些物质可以通过适当的生物培育转化成UDCA及其衍生物，其中在鸡胆汁中鹅去氧胆酸(CDCA)以及牛磺/甘氨鹅去氧胆酸(Τ/ G⑶CA)含量丰富。⑶CA与UDCA的差别仅在于7位羟基的差向异构，利用7 α、7 β -羟基类固醇脱氢酶(7 α、7 β -HSDH)可以将CDCA、T/GCDCA转化为UDCA、T/GUDCA。来自撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)的 7 α、7 β-HSDH 酶可以实现上述转化过程。因此，为了快速获取大量的和高纯度的7 β -HSDH酶，本发明提出通过密码子优化的7β-HSDH酶基因在大肠杆菌中进行原核表达。原核表达在短时间内可以得到大量产物，而为了得到有活性、结构完整的目的蛋白，分析基因中使用频率较低的密码子并进行替换从而得到优化的基因序列是十分必要的。另外，原核表达时采用原核表达载体pGEX-6p-l与目的基因进行GST融合表达，得到的融合表达蛋白往往具有正确的空间结构和相应的酶活，并且GST融合蛋白纯化方法简单快速，从而能够快速得到有活性的目的蛋白。
发明内容
鉴于此，本发明的目的之一是提供密码子经过改造且mRNA 二级结构稳定的密码子优化的7β-羟基类固醇脱氢酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。该优化基因在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，按照大肠杆菌的偏爱性进行优化，使其在宿主细胞中的表达量和纯度显著提高；本发明的目的之二是提供含密码子优化的7 β -羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体 pGEX-6p-l-7 β -HSDH ；本发明的目的之三是提供含密码子优化的7 β -羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体的大肠杆菌。本发明采用密码子优化的7β_羟基类固醇脱氢酶基因与原核表达载体pGEX-6p-l在大肠杆菌中GST融合表达，在短时间内可以生成大量有活性、结构完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白纯化方法简单快速，从而能够快速得到有活性的目的蛋白。
图I为本发明优化前后7 β -HSDH基因序列比较图2Α为本发明7 β -HSDH基因优化前表达的7 β -羟基类固醇脱氢酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳2Β为本发明7 β -HSDH基因优化后表达的7 β -羟基类固醇脱氢酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳3为本发明不同pH条件下优化的7 β -HSDH催化⑶CA氧化的酶活比较
具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。 实施例I :7 β -羟基类固醇脱氢酶基因的优化设计和合成稀有密码子的分析稀有密码子主要通过软件Ε. coli Codon Usage Analysis2. O(Morris Maduro,参考Analysis and Predictions from Escherichia coli sequencesin:Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2，Ch. 114:2047-2066，1996，Neidhardt FCed.，ASM press, Washington, D. C.)分析得到在大肠杆菌中的使用相对频率低于阈值(10%。)的密码子。优化稀有密码子根据不同密码子在大肠杆菌中的使用频率将使用频率低于阈值的密码子进行优化。优化结果如下本发明所用的优化密码子
权利要求
1.密码子优化的7β-羟基类固醇脱氢酶基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNO. I所示。
2.含权利要求I所述密码子优化的7β-羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体pGEX-6p-l-7β -HSDH。
3.含权利要求2所述重组表达载体的大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了密码子优化的7β-羟基类固醇脱氢酶基因、含所述优化基因的重组表达载体pGEX-6p-1-7β-HSDH和含所述重组表达载体的大肠杆菌。本发明采用密码子优化的7β-羟基类固醇脱氢酶基因与原核表达载体pGEX-6p-1在大肠杆菌中GST融合表达，在短时间内可以生成大量有活性、结构完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白纯化方法简单快速，从而能够快速得到有活性的目的蛋白。
文档编号C12N1/21GK102827847SQ20121026006
公开日2012年12月19日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者王伯初, 娄德帅, 谭君, 祝连彩, 季庆治, 岑小惜, 刘宜善 申请人:上海凯宝药业股份有限公司