专利名称：一种高活性复合纤维素酶及其制备和在木质纤维酶解糖化中的应用方法
技术领域：
本发明涉及ー种真菌高产纤维素酶制备的复合酶及其制备方法，以及它在木质纤维酶解糖化中的应用。
背景技术：
由于能缓解能源紧张、減少环境污染、促进农村发展、避免“与人争粮，与农争地”等重要作用，利用自然界丰富的木质纤维素植物资源生产燃料こ醇已越来越受到社会的关注和支持，纤维素燃料こ醇已经成了可再生能源的重要组成部分。从木质纤维素到こ醇的生物转化过程通常包括①木质纤维素原料预处理；②纤维素酶的生产；③纤维素的水解糖化；④纤维素水解产物(己糖)的发酵和⑤半纤维素水解产物(戊糖)的发酵。
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纤维素こ醇生产过程中，纤维素酶的成本占了很大的比例，甚至达到了整个成本的一半以上。纤维素酶是利用产纤维素酶的菌株经过发酵提取精制而成的液体状复合酶制齐U，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶三种酶系。目前，里氏木霉是公认的ー种优秀的产纤维素酶的菌种，但其产生的纤维素酶中的3 -葡萄糖苷酶活性较低，致使纤维ニ糖积累，影响了酶解糖化效率，进而降低了こ醇的得率。进行高活性纤维素酶制取及酶系优化在木质纤维酶解糖化中的应用对木质纤维燃料こ醇生产具有重要的实践价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是客服现有技术的不足，提供一种由爪哇正青霉高产的^ -葡萄糖苷酶制备的高活性复合纤维素酶及其制备方法，并进行复合酶系优化实现其在酶解糖化木质纤维中的应用。本发明的目的是通过以下方式实现的—种高活性复合纤维素酶所述的复合纤维素酶是由爪哇正青霉ZN-205 CCTCCN0:M208204生产的P -葡萄糖苷酶与里氏木霉Rut C-30 ATCC 56765生产的纤维素酶(里氏木霉Rut C-30 ATCC 56765生产纤维素酶的方法见參考文献I)经浓缩处理，将浓缩后的酶液进行混合得到的，得到的复合纤维素酶的P -葡萄糖苷酶活/PFA酶活最优比值为1.4；所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204生产P -葡萄糖苷酶的过程如下挑取一环爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204孢子接种于种子培养基的摇瓶中，摇床上培养作为接种物；按摇瓶装液量体积的5%，将上述接种物接种于装有IOOml产酶培养基的250ml摇瓶中，280C，175rpm条件下培养5天；离心，上清液即为P -葡萄糖苷酶；所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204产酶培养基初始pH为6. 0 ;微晶纤维素质量浓度为2. 5%，蛋白胨质量浓度0. 75%，KH2PO4 2g/L，CaCl2 2H20 0. 4g/L，MgSO4 7H20 0. 02g/L, Mandels 微量元素浓缩液 lml/L, lmol/L 柠檬酸缓冲液 50ml/L ;吐温-80的添加质量百分比为0. 05%，加水配制成IL ；其中，Mandels微量元素浓缩液FeS04 *7H20 5g/L,MnSO4 .H2O I. 6g/L,ZnSO4 *7H20I. 4g/L，CoCl2 6H20 3. 7g/l，加水配制成 IL ；lmol/1 柠檬酸缓冲液:柠檬酸(C6H8O7 H2O 210g)，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷却后测pH为4. 2，加水至1000ml, pH为4. 45。所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨lg/L，Mandels营养盐浓缩液100ml/L，Mandels微量元素浓缩液lml/L，IM柠檬酸缓冲液50ml/L，加水配制成IL ；其中，Mandels营养盐浓缩液(NH4)2SO4 14g/L，(NH4)2CO3 3 g/L，KH2PO4 20g/L,CaCl2 2H20 4g/L，MgSO4 7H20 0. 2g/L，加水配制成 IL ；Mandels 微量元素浓缩液=FeSO4 7H20 5g/L, MnSO4 H2O I. 6g/L, ZnSO4 ·7H20I. 4g/L，CoCl2 6H20 3. 7g/L，加水配制成 IL ；lmol/1 柠檬酸缓冲液柠檬酸(C6H8O7 -H2O) 210g，H20 750ml，加 NaOH 78g，冷却后测 pH 为 4. 2，加水至 1000ml, pH 为 4. 45。上述利用爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204孢子接种于种子培养基培养的具体过程如下从保存的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204固体平板培养基中挑取ー环孢子接种于装液50ml种子培养基的250ml摇瓶中，28°C，200rpm摇床上培养2. 5^3天作为接种物。所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204经过产酶培养基培养后在4000rpm下,离心IOmin,得到上清液。ー种高活性复合纤维素酶，是由上述的方法制备得到的。上述高活性复合纤维素酶用于酶解糖化木质纤维素；具体可以酶解蒸汽爆破预处理的杨木。所述的蒸汽爆破预处理的杨木占所述的复合纤维素酶液的质量浓度为5%，，酶解糖化用酶量为15FPU/g杨木，酶解糖化时间为48h。所述的蒸汽爆破预处理的杨木是在蒸汽爆破装置的爆破反应器中填装杨木片；开启蒸汽发生器，蒸汽到达预设温度210°C后即可通入爆破反应器；3MPa蒸汽压カ下维持压力20分钟，同时利用反应器上的夹套进行加热；瞬间释放压力，爆破完成，然后将爆破液烘干至无水收集备用。与现有技术相比，本发明的优点在于通过优化爪哇正青霉ZN-205产P -葡萄糖苷酶生产条件，可以制得活性高、成本低的P -葡萄糖苷酶，其再与里氏木霉Ru-C30生产的纤维素酶混合，优化得到两者的最优酶活配比，用于高效酶解木质纤维素。虽然里氏木霉RU-C30生产的纤维素酶中￠-葡萄糖苷酶酶活低；但其还包括起重要作用的内切￠-葡聚糖酶和外切￠-葡聚糖酶，所以爪哇正青霉ZN-205制得的活性高的￠-葡萄糖苷酶能够弥补里氏木霉RU-C30生产的纤维素酶的缺陷，两者互补。本发明的应用可能开辟新的高效、低成本的酶解木质纤维素技术，为木质纤维素发酵制取燃料こ醇提供技术保障。本发明所用爪睡正青霉(Eupenicillium javanicum) ZN-205,为自主选育并于2008年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏菌株，保藏号为=CCTCCN0:M208204，并已申请专利保护该菌株(专利授权公告号CN101463327B)。里氏木霉RU-C30是从中国食品发酵エ业研究院购买，编号为ATCC56765 (其为代理的美国ATCC (生物资源中心)的产品)。
图I蒸汽爆破处理前后杨木；图2复合纤维素酶系酶解糖化杨木效果；图3发酵罐内产酶活力；图4复合纤维素酶系酶解糖化木质纤维发酵罐实验。
具体实施方式
·以下结合实施例旨在进ー步说明本发明，而非限制本发明。实施例I从实验室保存的爪哇正青霉ZN-205 土豆固体平板培养基中挑取一环孢子接种于装液50ml种子培养基的250ml摇瓶中，28°C，200rpm摇床上培养2. 5^3天作为接种物。按5% (v/v)接种量，将上述培养物接种于装有50ml产酶培养基的250ml摇瓶中，28°C，200rpm条件下培养5天。4000rpm下，离心lOmin，上清液即为粗酶液。測定其P -葡萄糖苷酶活为 I. 521IU/ml。爪哇正青霉ZN-205种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨lg/L，Mandels营养盐浓缩液100ml/L，Mandels微量元素浓缩液lml/L，IM柠檬酸缓冲液50ml/L，加水至1し爪哇正青霉ZN-205产酶培养基微晶纤维素25g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 2H20 0. 4g/L，MgSO4 7H20 0. 02g/L, Mandels 微量元素浓缩液 lml/L, lmol/L 柠檬酸缓冲液50ml/l,加水至1し其中，Mandels营养盐浓缩液(NH4)2SO4 14g/L，(NH4)2CO3 3 g/L，KH2PO4 20g/L,CaCl2 2H20 4g/L, MgSO4 7H20 0. 2g/L ；Mandels 微量元素浓缩液FeS04 7H20 5g/L, MnSO4 H2O I. 6g/L, ZnSO4 7H20
I.4g/L, CoCl2 6H20 3. 7g/L ；lmol/L 柠檬酸缓冲液柠檬酸(C6H8O7 -H2O) 210g，H20 750ml，加 NaOH 78g，冷却后测pH约为4. 2，加水至1000ml, pH约为4. 45。本发明提供了 P -葡萄糖苷酶活力的測定方法，具体如下取I. Oml 1.0%的水杨苷(溶解于0. 05mol/L pH=4. 8柠檬酸缓冲液中)，加入0. 5ml适当稀释的酶液，50°C水浴保温30min，加入3ml DNS溶液，在沸水中煮沸lOmin，冷却后用加蒸馏水定容至25ml，摇匀，在分光光度计波长为540nm下測定吸光度。以加热处理的酶液按同样的方法作为空白対照。酶活力的定义在上述条件下，Iml酶液在Imin内使底物产生I y mol葡萄糖的还原糖量,为I个酶活力単位，以IU/ml表示。
葡萄糖苷酶活(祖/-)=-—-
' "xOJM x30miii其中，m为葡萄糖含量(mg)，n为粗酶液的稀释倍数。
实施例2本发明采用单因素实验设计对实施例I中爪哇正青霉ZN-205产P -葡萄糖苷酶エ艺继续进行优化，具体如下。产酶培养基单因素试验保持产酶液体培养基中其他成分不变，分别改变碳源、氮源、pH值和表面活性剂(吐温-80)这四个因素(表1)，筛选出影响爪哇正青霉ZN-205产3-葡萄糖苷酶的最佳产酶培养基的单因素。各因素对￠-葡萄糖苷酶活性的影响的大小顺序为碳源>氮源>表面活性剂>初始pH。从试验结果(表2)得出最优组合初始pH为6. 0，氮源质量浓度为0. 75%，碳源质量浓度为2. 5%，吐温-80的添加量为0. 05wt%。表I产酶培养基正交试验设计· m査
四杀
水 1/:ABCD
tt始pH鉍源(.％)碳源(％)吐温-80 (%)
15.00.252.00.05
25.50.52.50,1
_3_6,0_0.75 _3.0 _0.15 _表2产酶培养基正交试验设计结果
因 #ABCDSi 活
'初始pH氣《碳漏吐温-80 C IU/ml)
111111.145
21222 1.823
31333 1.821
42123 1.678
52231 1.826
62312 1.492
73132 1.366
83213 1.717
93321 2.037 Kl4.789 4.1894.3545.008
K24.996 5.3665.5384.618 K35.120 5.3505.0135.216 kl1.596 1.3961.4511.669 k21.665 1.7891.8461.539 k31.707 1.7831.6711.739 __R _0.111_0.393 _ 0.395 _ 0.200 _产酶外部条件单因素试验保持产酶液体培养基成分不变，分别改变培养温度、接种量、装液量和摇床转速(表3)，筛选出影响爪哇正青霉ZN-205产@ -葡萄糖苷酶的最佳产酶外部条件。各因素对￠-葡萄糖苷酶活性的影响的大小顺序为培养温度>接种量>装液量>摇床转速(表4)。
表3产酶外部条件正交试验设计
权利要求
1.一种高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述的复合纤维素酶是由爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204生产的P -葡萄糖苷酶与里氏木霉Rut C-30 ATCC56765生产的纤维素酶经浓缩处理，将浓缩后的酶液进行混合得到的，得到的复合纤维素酶的3 -葡萄糖苷酶活/PFA酶活比值为I. 4 ; 所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204生产P -葡萄糖苷酶的过程如下 挑取一环爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204孢子接种于种子培养基的摇瓶中，摇床上培养作为接种物；按摇瓶装液量体积的5%，将上述接种物接种于装有IOOml产酶培养基的250ml摇瓶中，280C，175rpm条件下培养5天；离心，上清液即为P -葡萄糖苷酶； 所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC N0:M208204产酶培养基初始pH为6. 0 ;微晶纤维素质量浓度为 2. 5%，蛋白胨质量浓度 0. 75%，KH2PO4 2g/L，CaCl2 2H20 0. 4g/L，MgSO4 7H20.0.02g/L，Mandels微量元素浓缩液lml/L，lmol/L柠檬酸缓冲液50ml/L ;吐温_80的添加质量百分比为0. 05%，加水配制成IL ；其中，Mandels 微量元素浓缩液FeS04 7H20 5g/L, MnSO4 H2O I. 6g/L, ZnSO4 7H20.1.4g/L，CoCl2 6H20 3. 7g/L，加水配制成 IL ； lmol/L 柠檬酸缓冲液C6H8O7 H2O 210g，H20 750ml，加 NaOH 78g，冷却后测 pH 为 4. 2，加水至 1000ml, pH 为 4. 45。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的爪哇正青霉ZN-205CCTCCNO:M208204种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨lg/L，Mandels营养盐浓缩液IOOml/L，Mandels微量元素浓缩液lml/L，IM柠檬酸缓冲液50ml/L，加水配制成IL ； 其中，Mandels 营养盐浓缩液(NH4)2SO4 14g/L，(NH4)2CO3 3g/L，KH2PO4 20g/L,CaCl2 2H20 4g/L，MgSO4 7H20 0. 2g/L，加水配制成 IL ；Mandels 微量元素浓缩液=FeSO4 7H20 5g/L, MnSO4 H2O I. 6g/L, ZnSO4 7H20 I. 4g/L，CoCl2 6H20 3. 7g/L，加水配制成 IL ； lmol/L 柠檬酸缓冲液C6H8O7 H2O 210g，H20 750ml，加 NaOH 78g，冷却后测 pH 为 4. 2，加水至 1000ml, pH 为 4. 45。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，从保存的爪哇正青霉ZN-205CCTCCN0:M208204固体平板培养基中挑取一环孢子接种于装液50ml种子培养基的250ml摇瓶中，28°C，200rpm摇床上培养2. 5^3天作为接种物。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的爪哇正青霉ZN-205CCTCCN0:M208204经过产酶培养基培养后在4000rpm下，离心lOmin，得到上清液。
5.一种高活性复合纤维素酶，其特征在于，是由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的。
6.权利要求5所述的高活性复合纤维素酶的应用方法，其特征在于，采用所述的复合纤维素酶酶解糖化木质纤维素。
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，采用所述的复合纤维素酶酶解蒸汽爆破预处理的杨木。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述的蒸汽爆破预处理的杨木占所述的复合纤维素酶液的质量浓度为5%，酶解糖化用酶量为15 FPU/g杨木，酶解糖化时间为48h。
9.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述的蒸汽爆破预处理的杨木是在蒸汽爆破装置的爆破反应器中填装杨木片；开启蒸汽发生器，蒸汽到达预设温度210°C后即可通入爆破反应器；3MPa蒸汽压力下维持压力20分钟，瞬间释放压力，爆破完成，然后将爆破液烘干至无水收集备用。
全文摘要
本发明公开了一种高活性复合纤维素酶及其制备和在木质纤维酶解糖化中的应用方法。利用爪哇正青霉ZN-205进行摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶，最佳产酶条件初始pH为6.0，蛋白胨浓度为0.75%，微晶纤维素浓度为2.5%，吐温-80的添加量为0.05%，培养温度为28℃，250ml三角瓶装液量为100ml，摇床转速为175r/min，接种量为5%；最高β-葡萄糖苷酶活为2.312IU/ml。将爪哇正青霉ZN-205生产的β-葡萄糖苷酶与里氏木霉Rut C-30生产的纤维素酶进行酶系复合，获得最优β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.4，采用该复合酶系酶解糖化木质纤维，实现了高效、低成本的酶解糖化效果。
文档编号C12P19/14GK102787104SQ201210260079
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者张 林, 王义强, 詹鹏, 陈介南, 陈石兰 申请人:中南林业科技大学, 长沙联美生物科技有限责任公司