微核酸-196a分子及-196b分子侦测口腔癌的方法及其引物、探针与试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种用微核酸-196a分子及微核酸-196b分子侦测口腔癌的方法及其专用引物、探针与试剂盒，是检测潜在病患的肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水等生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量，其中miR-196a分子具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQID?NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。本发明利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应技术(RT-qPCR)，侦测口腔癌病患及正常者血浆中miR-196a分子和miR-196b分子的表达量，发现无论是微核酸miR-196a还是微核酸miR-196b的表达量均较正常者有明显的高度表达(p＜0.0001)，且侦测敏感度达90％，专一性达85％，证明miR-196a分子及miR-196b分子应用于口腔癌的侦测具有良好的鉴别度。
【专利说明】微核酸-196a分子及-196b分子侦测口腔癌的方法及其引物、探针与试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明提供一种将微核酸-196a(miR_196a)分子及微核酸_196b (miR_196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，尤其以miR-196a分子及miR-196b分子作为口腔癌的肿瘤标记，分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR_196b分子的表达量来推断该潜在病患罹患口腔癌的方法。
【背景技术】 [0002]血液肿瘤标志具有疾病侦测、预后及监控治疗结果的价值。因此，一个临床上应用的血液型肿瘤标志可以提供更好的疾病控制。现行的血液型肿瘤标志有侦测大肠直肠癌的CEA、侦测肝癌的AFP与侦测摄护腺癌的PSA，过去也有报导指出SCC抗原与Cyfra21可以作为头颈癌的侦测标志，但目前尚未提到有临床使用的口腔癌侦测标志。此外，微核酸(miRNA)是内生性，不转译蛋白的小片段RNA，其利用结合到标的基因讯息RNA的3’不转译区域(3’UTR)，进而抑制标的基因转译而达到负向调控基因表达。微核酸被认为是一群重要的基因调控分子，估计有1/3-1/2的人类基因会受微核酸调控，此外每个微小RNA亦可以同时调控不同的标的基因。已知微核酸参与多样的生物功能，如细胞增生、分化、凋亡及移行功能，甚至微核酸表达异常也认为与细胞恶性转化有关。近年来研究显示，许多不同的癌症都有其特异的微核酸表达，然而研究显示共同的结果并不多，表示微核酸的复杂性及其机制并未被真正了解。
[0003]目前口腔癌是十大癌症之一，每年约以五十万人的新病例增加，为改善医疗成效，提升口腔癌患者的存活率，除了改善治疗的方式外，发现并建立一个临床上可以用来侦测以及监控病程的肿瘤标志，可有效减少口腔癌病人的死亡率。
【发明内容】
[0004]目前并无适当的分子肿瘤标志，可应用于口腔癌的临床侦测，为了改善医疗成效，提升口腔癌患者的存活率，本发明提供一种以将微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，是分析潜在病患的肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水等生物检体中miR-196a分子及miR_196b分子的表达量，其中miR_196a分子具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR_196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。
[0005]以血浆检体为例，又本发明分析潜在病患的生物检体中miR_196a分子及miR-196b分子的表达量的分析步骤为:步骤一:首先取得血浆检体，将血浆样分装出200 μ 1，用可纯化miRNA的试剂组来萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700 μ I QIAzol使其均质化后再加入140 μ I氯仿分离萃取RNA，离心之后取上清液(约525 μ I)加入750 μ I纯乙醇沉淀核酸产物，然后用离心管柱分离出沉淀物，丢弃下层流出液，在润洗管柱后，每个样本用20 μ I无核酸水解酶(RNase-free)的水将核酸提取出来；步骤二:微核酸(miRNA)的定量，微核酸的定量方式是用反转录实时荧光定量PCR反应试剂进行，首先将所萃取的核酸取3μ I进行反转录反应，30 μ I反应体系包含4单位的反转录酶、10单位的核酸水解酶抑制剂及25mM dNTP，置于37°C孵育30分钟，接着用实时荧光定量PCR检测仪进行实时荧光定量PCR检测，方法为:将8111反转录后的产物与1111上述用于侦测1^1?-196&分子或miR-196b分子表达量的引物和探针混和，并加入6μ I水和10 μ I实时荧光定量PCR试剂后上机，结果以Ct值(threshold cycle)显不，以已知浓度的miR_196a分子及miR-196b分子的检测结果为对照，根据对照的Ct值及检体的Ct值，得到检体中miR_196a分子及miR_196b分子的表达量。[0006]本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测miR_196a分子和miR_196b分子表达量的引物和探针，其中，检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列存在于AppliedBiosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196a:000495)中，检测 miR_196b 的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems- TaqMan? MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b:002215)中。
[0007]本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，包括侦测miR_196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems- TaqMan?MicroRNA Assays试剂盒(miR_196a:000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems-TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196b:002215)中的引物和探针。
[0008]本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，由侦测miR_196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针组成；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为 Appl ied Biosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196a:000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为AppliedBiosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196b:002215)中的引物和探针。
[0009]本发明通过实验证明口腔癌病人血浆中的miR_196a分子及miR_196b分子含量比起正常人有显著上升(P < 0.001，AUC > 0.90)，且侦测敏感度达90 %，专一性达85 %，表示miR-196a分子及miR-196b分子具有良好的口腔癌侦测能力，因此，测定生物检体中miR-196a分子及miR_196b分子的含量可以用于侦测口腔癌，以往并无适当的口腔癌肿瘤标志，因此miR-196a分子及miR_196b分子应用于口腔癌的发现与侦测上为一医学上的突破，且具有良好的功效。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:利用各微核酸在癌细胞即正常口腔上皮细胞的平均荧光表达含量作图，其所示为侦测470个微核酸的荧光强度图。
[0011]图2:透过非预设性阶层分级分析并以ANOVA计算，以FDR < 0.1且具有两倍以上差异的结果显示有23个微核酸的表达在口腔癌细胞与正常口腔上皮的样本中有显著差
巳
[0012]图3:表示使用miR_196a及miR_196b的抑制核酸序列(antagomir)处理细胞会降低细胞移行能力。
[0013]图4:表示高度表达miR_196a与miR_196b会促进细胞移行能力。
[0014]图5:表示细胞向外侵犯能力会因为抑制miR_196a及miR_196b而下降。
[0015]图6:表示高度表达细胞中的miR-196a及miR-196b会促进口腔癌细胞的侵犯能力。
[0016]图7(A) (B):表示测定临床组织检体中口腔癌肿瘤样本(T)与周围正常组织样本(N)内 miR-196a 与 miR_196b 的表达量。
[0017]图8(A)⑶:表示miR_196a在口腔癌病人的血浆有过度表达的现象。
[0018]图9(A)⑶:表示miR_196b在口腔癌病人的血浆有过度表达的现象。
【具体实施方式】
[0019]本发明提 供一种将微核酸-196a(miR_196a)分子及微核酸_196b (miR_196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，分析潜在病患的血浆、血清、口水、漱口水或肿瘤组织等生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量，其中miR-196a分子包含具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，miR-196b分子包含具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，若miR_196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683± 1.88，本数值是采一般正常人的平均表现量来作为正常值，所测定的值是一个相对定量后的结果)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。
[0020]本发明首先经由分析口腔癌细胞的微核酸(miRNA)，发现miR_196a分子及miR-196b分子在口腔癌细胞中扮演重要的致癌角色，而进一步侦测口腔癌病人以及正常人血浆中miR-196a分子及miR-196b分子的含量发现，在口腔癌病患的血浆中miR_196a分子及miR-196b分子呈高度表达，因此认为miR-196a分子及miR_196b分子具有可以做为早期侦测口腔癌肿瘤标志的潜力。故本发明利用微核酸微阵列(Agilent Technology, USA)的方式分析比对在口腔癌细胞与正常的口腔上皮细胞内的微核酸是否有差异，本发明总共分析6株口腔癌细胞以及5株的正常口腔上皮细胞内470个微核酸的表达，实验方法为:一个样品以总量I μ g的核糖核酸进行实验，RNA首先用碱性去磷酸酶37°C处理30分钟将其去磷酸化后，100度高温终止反应5分钟，并立即降温至0°C，加入5 μ I的DMSO (Dimethylsulfoxide)加热至100度后随即降温至O °C,后续加上ligase buffer及BSA与50 μ MpCp-Cy, 15单位的T41igase总体积为28 μ I后静置于16度2小时，荧光标定完成后以MicroBioSpin6管柱去盐类，并加入杂交缓冲液与阻断试剂使总体积为45 μ 1，混和物加热10CTC并立即降温至0°C后取至Agilent human miRNA microarray vl芯片上于55°C进行杂交反应20小时,反应后芯片用清洗液在室温下清洗5分钟后用Agilent microarrayscanner进行扫描(miRNA microarray送外检(威健公司，Agilent),上述操作步骤为Aglilent的操作步骤经发明人简化翻译而成)，数据用GeneSpring GX software分析,将微弱讯息过滤之后，以ANONA计算，选择标准订为错误选取率< 0.1 (FDR < 0.1)且有两倍以上差异。结果如图1所示，图1利用各微核酸在癌细胞即正常口腔上皮细胞的平均荧光表达含量作图，其所示为侦测的470个微核酸的荧光强度图，X轴为在5个正常口腔上皮细胞平均强度，Y轴为在6个口腔癌细胞中的平均表达强度。
[0021]表1为以微阵列方式筛选的有显著差异的微核酸,表列23个有显著差异的微核酸在6个口腔癌细胞(C)与5个正常口腔上皮细胞(K)的平均表达量与相对倍数差及P值，P值低显示在同群组中微核酸的表达趋势相同，而在23个微核酸中，miR-196a及miR_196b在癌细胞显著高表达(> 10倍)，显示出miR-196a及miR-196b在口腔癌形成时扮演一种重要角色。侦测470个人类微核酸,接着经过常态化(normalization)并去除微弱讯号后共190个微核酸进行群集分析(clustering analysis),非预设性阶层分级分析(Theunsupervised hierarchical clustering analysis)结果显不，这 190 个微核酸的表达数据图谱可以将样本分为癌细胞及正常口腔上皮细胞两个群组，以统计方法(analysis ofvariance, AN0VA)计算，将条件设定为错误发现率(False discovery rate, FDR) < 0.1,并同时有两倍以上差异，得知有23个微小RNA的表达在口腔癌细胞与正常口腔上皮的样本中有显著差异，其中包含19个微核酸表达量上升，4个微核酸表达量下降于口腔癌细胞株(如图2所示)，图2是非预设性阶层分级分析图。
[0022]表1以微阵列方式筛选的口腔癌细胞(Cancer)与正常口腔上皮细胞(Normal)表达量有显著差异的微核酸
[0023]
【权利要求】
1.用实时荧光定量PCR法侦测miR-196a分子和miR_196b分子表达量的引物和探针，其中，检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列存在于AppliedBiosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196a:000495)中，检测 miR_196b 的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems-TaqMan?MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b:002215)中。
2.一种用miR-196a分子和miR_196b分子侦测口腔癌的方法，是用权利要求1所述的引物、探针和实时荧光定量PCR法分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量，其中miR-196a分子具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，miR_196b分子具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值，即可推断该潜在病患罹患口腔癌，其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述miR-196a分子高出正常值约14倍。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述miR-196b分子高出正常值约10倍。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述生物检体可为肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:以血浆检体为例，所述分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR_196b分子的表达量的分析步骤为: 步骤一:首先取得血浆检体，将血浆样分装出200 μ 1，用可纯化miRNA的试剂萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700 μ I QIAzol使其均质化后再加入140 μ I氯仿分离萃取RNA，离心后取上清液(约525 μ I)加入750 μ I纯乙醇沉淀微核酸，然后用离心管柱分离出沉淀物(微核酸)，丢弃下层流出液，润洗管柱后，每个样本用20 μ I无核酸水解酶(RNase-free)的水将微核酸提取出来； 步骤二:微核酸的定量，微核酸的定量方式是用反转录实时荧光定量PCR反应试剂进行，首先取步骤一萃取的3 μ I微核酸进行反转录反应,在30 μ I反应体系中加入4单位的反转录酶、10单位的核酸水解酶抑制剂及25mM dNTP，置于37°C孵育30分钟，接着用实时荧光定量PCR检测仪进行实时荧光定量PCR检测，方法为:将8 μ I反转录后的产物与I μ I权利要求1所述的侦测miR-196a分子或miR_196b分子表达量的引物和探针混和，并加入6μ1水和10 μ I实时荧光定量PCR试剂后上机，结果以Ct值(threshold cycle)显示，以已知浓度的miR-196a分子及miR_196b分子的检测结果为对照,根据对照的Ct值及检体的Ct值，得到检体中miR-196a分子及miR_196b分子的表达量。
7.一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，包括侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为 Applied Biosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196a:000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为AppliedBiosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196b:002215)中的引物和探针。
8.一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，由侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针组成；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为 Applied Biosystems- TaqMan? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196a:000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为AppliedBiosystems- TaqMa n? MicroRNA Assays 试剂盒(miR_196b:002215)中的引物和探针。
【文档编号】C12Q1/68GK103571936SQ201210274004
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月3日 优先权日:2012年8月3日
【发明者】郑恩加, 吕雅情 申请人:长庚大学