专利名称：一种表达抗凝血酶iii的重组羊胎儿成纤维细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因克隆细胞技术领域，具体涉及一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞。
背景技术：
抗凝血酶III (antithrombinIII,简称ATIII)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子，它在血浆中承担着60% 70%的抗凝血活性，在维持血液生理性凝血与抗凝血中起着重要的作用。抗凝血酶III的合成场所为肝脏，其主要通过与凝血酶Xa及XIa结合等方式灭活凝血酶，从而发挥抗凝血的作用。抗凝血酶III在人体中含量减少常见于以下病例a)遗传性抗凝血酶III缺乏；·b)获得性抗凝血酶III缺乏，见于肝硬化、肝癌晚期等各种肝脏疾病；c)抗凝血酶III丢失增多，见于肾脏疾病；d)抗凝血酶III消耗增多，见于各种原因造成的血液凝固性增高；e)由抗凝血酶III先天或后天缺乏导致血栓的形成而引起的脑血栓或心肌梗塞
等疾病。目前人抗凝血酶III蛋白多来自于人类血浆提取，随着市场需求的不断扩增以及血浆原料的不断萎缩，血浆来源的人抗凝血酶III逐渐呈现出供不应求的态势。鉴于此种情况，利用重组DNA技术在体外高效表达与天然蛋白结构功能均类似的重组蛋白替代品便成为了解决血浆蛋白供不应求的不二之选。已有报道的重组人抗凝血酶III蛋白表达体系包括酵母、CHO细胞及转基因动物等。其中美国GTC生物治疗公司的显微注射法转基因胚胎所培育的山羊乳腺生物反应器表达体系所生产达到重组人抗凝血酶III蛋白表达量最高，其结构与功能最接近天然蛋白。但是，GTC公司所制作的转基因细胞系(胚胎)，由于随机整合等因素，难以保持外源基因的稳定遗传，一般外源基因会随细胞系传代或转基因动物繁育而逐渐丢失，不利于优良转基因形状的保持及目的蛋白的高效表达。因此，如何获得一种能够高效表达目的蛋白且外源基因可以随之稳定遗传的细胞系，成为了动物生物反应器制药行业一项亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞，即一种作为核供体细胞的包含rhATIII乳腺特异性表达载体的奶山羊胎儿成纤维细胞系，为制作高质量的rhATIII转基因奶山羊反应器提供坚实的基础，从而弥补现有技术的不足之处。本发明的表达抗凝血酶III的转hATIII基因成纤维细胞SMlsCh-AT已于2012年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 2012103。本发明的重组羊胎儿成纤维细胞的制备方法，是将携带有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表达载体转染入羊胎儿成纤维细胞内，再筛选出目的基因rhATIII已整合到基因组上的山羊胎儿成纤维细胞。本发明的重组羊胎儿成纤维细胞在制备奶山羊生物反应器中的应用。本发明通过构建的rhATIII乳腺特异性表达载体，使目的基因rhATIII整合到羊胎儿成纤维细胞的基因组上。通过在rhATIII基因两端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’调控区，山羊β酪蛋白基因的5’和3’调控区可以指导目的基因在山羊乳腺组织中特异的高效表达。而且，本发明使用基因打靶技术，使含有目的基因rhATIII的特异性表达载体可以定点整合至山羊胎儿成纤维细胞基因组中，避免了由于随机整合而对目的基因表达带来的不确定性，使目的基因rhATIII的表达效率更高。本发明的包含目的基因rhATIII的山羊胎儿成纤维细胞可作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过体细胞核移植法获得转基因克隆胚，将所得胚胎移入受体羊的子宫即可高效率生产出转rhATIII基因的奶山羊生物反应器。
具体实施例方式本发明首先是构建携带有抗凝血酶III (ATIII)基因的重组表达载体，载体构建方法可以参照申请号为2011102521955的专利说明书中的描述来进行，其具体步骤如下I、包含目的基因rhATIII的重组载体构建从人类肝脏组织中提取总RNA，以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。以合成的 cDNA第一链为模板，根据已公开的ATIII基因序列(GenBank，D29832)设计PCR引物，并在引物5’端引入一个唯一的XhoI酶切位点，进行PCR扩增，将PCR产物克隆至pUC19载体上，通过DNA测序分析确定载体所包含的ATIII序列与已公开ATIII序列一致。上述的ATIII基因序列也可以根据GenBank中记录的序列人工合成。2、重组基因打靶表达载体的构建将奶山羊的β —酪蛋白基因去除第二外显子与第七外显子及其之间的DNA序列，建立一个Notl酶切位点。在PCR扩增的ATIII序列片段加上一个Iox序列、一个polyA序列、一个新霉素(Neomycin)筛选基因和另一个Iox序列，使两个Iox序列方向相同。最后将改造后的ATIII序列连接至奶山羊β —酪蛋白DNA载体的表达框架上。通过DNA测序分析确定重组表达载体序列与理论序列一致。将构建的重组载体转染细胞，来构建稳定遗传的细胞系。3、定点打靶载体的细胞转染、筛选与鉴定从30d-45d胎龄的崂山奶山羊胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，将分离的细胞培养在添加10%胎牛血清(FCS)和抗菌素的DMEM-F12 (1:1)培养基中。用电穿孔或脂质体介导的方法将基因打靶载体转入山羊胎儿成纤维细胞中。转染细胞培养48小时后，培养液中加入G418 (600 μ g/mL)进行筛选培养。筛选出的细胞经PCR及Southern杂交检测外源基因整合情况后冷冻保存。阳性转基因细胞株传代30代后，提取基因组DNA进行PCR及Southern杂交检测，PCR引物序列如下正向引物5’-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG -3’反向引物5’ -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3 ’
Southern杂交探针选用Pstl酶切Genome DNA plasmid片段,长度为440bp。检测结果显示，外源 基因插入片段仍保持完整，说明所得阳性转基因细胞株中外源目的基因完全整合至细胞基因组中，并可随之稳定遗传；提取细胞株总mRNA进行Northern杂交检测，杂交探针选用ATIII基因序列(GenBank,D29832)或部分序列。检测结果显示，经诱导后的阳性转基因细胞株具有较高的目的基因转录水平，约为正常转录的人类肝脏细胞的3-5倍，说明所得阳性转基因细胞株中外源基因可高效转录。该细胞株命名为转hATIII基因成纤维细胞SMlsCh-AT，已于2012年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 2012103。4、以上述基因组整合了 ATIII目的基因的山羊胎儿成纤维细胞作为核供体细胞，构建转基因克隆胚通过同期发情和超排处理获得体内成熟的卵母细胞和寄母羊。阳性细胞体外饥饿2-5天后移入去核卵母细胞卵周隙内，用电刺激法使供核细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4小时并用离子霉素(Ionomycin)激活5分钟，之后在含有6- 二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培养基中培养5小时。最后将克隆胚移入正常培养基中培养过夜，第二天移入寄母羊输卵管中。寄母羊通过妊娠期可产下定点整合的ATIII转基因克隆羊。该克隆羊即为转基因动物反应器，其乳汁中含有高效表达的ATIII药用蛋白。
权利要求
1.一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞，为转hATIII基因成纤维细胞SMl sCh-AT，其保藏编号为 CCTCC C 2012103。
2.权利要求I所述的重组羊胎儿成纤维细胞的制备方法，是将携带有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表达载体转染入羊胎儿成纤维细胞内，再筛选出目的基因rhATIII已整合到基因组上的山羊胎儿成纤维细胞。
3.权利要求I所述的重组羊胎儿成纤维细胞在制备奶山羊生物反应器中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞，为转hATIII基因成纤维细胞SMlsCh-AT,已于2012年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 2012103。本发明通过构建的rhATIII乳腺特异性表达载体，使目的基因rhATIII整合到羊胎儿成纤维细胞的基因组上。通过在rhATIII基因两端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’调控区，可以指导目的基因在山羊乳腺组织中特异的高效表达。本发明的包含目的基因rhATIII的山羊胎儿成纤维细胞可作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过体细胞核移植法获得转基因克隆胚，将所得胚胎移入受体羊的子宫即可高效率生产出转rhATIII基因的奶山羊生物反应器。
文档编号C12R1/91GK102899292SQ20121036248
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者邹贤刚, 赵雅琳, 袁三平 申请人:青岛森淼实业有限公司