专利名称：一种以dsf为底物的降解菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及筛选降解可扩散性信号分子(DSF)为底物的降解菌的筛选方法，属于生物技术领域。
背景技术：
黄单胞菌(Xanthomonas spp.)是分布最广泛的与植物相关的细菌性病原物之一。研究表明，这个属的成员可以侵染124种单子叶植物和268种双子叶植物(Leyns etal. , 1984)。其中最具有经济意义的几个种,如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)是绝对优势种，它至少有141个致病变种，能侵染许多植物，包括重要的农作物，如甘蓝、花椰菜、椰菜、番爺、胡椒、棉花、大豆和胡桃等(Hayward, 1993);稻黄单胞(Xanthomonas oryzae)包含2个致病变种，侵染水稻引起严重损失；地毯草黄单胞柑橘致病变种是危害柑橘最为严重的病原细菌。针对植物细菌病害，目前生产上尚无十分有效的控制措施。种子处理虽然能有效地阻止病害通过种子传播，但对老病区而言，控病效果并不理想；目前仍没有十分有效地化学药剂；因此，一旦细菌病害大面积发生和流行。短时间内难以拿出有效的防控措施。日益增加的证据表明细菌不是一个孤立的有机体，而是利用一些小的化学信号分子进行积极的信息交流。群体感应(Quorum Sensing, QS)就是细胞间信息交流机制之一，细菌通过QS机制来监测其分泌到环境中的信号分子的积累情况，从而做出应答，计算它的群体数量(Whitehead et al. , 2001 ；Fuqua and Greenberg, 2002)。与其他细菌相似，黄单胞也进化出了再群体水平上进行遗传调节的QS系统。早期的转座子诱变分析揭示了一个野油菜黄单胞菌的基因簇，并定义为rpfABCDEFG，该基因簇调节致病因子，包括EPS和胞外酶的产生(Tanget al. , 1991)。此后,将rpfF突变株靠近野生型菌株联合培养,发现rpfF突变体蛋白酶的产生量恢复到野生型水平，这个结果表明，野油菜黄单胞野生型菌株能够产生一种可扩散的信号因子(Diffusible singal factor, DSF) (Barber et al·, 1997)。目前已经确定DSF是一种短链脂肪酸,其结构为顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸(Wang et al.,2004)。DSF代表了细菌中一个新的QS信号分子家族。近年来，已经从多种黄单胞菌包括木质部小菌属中检测到DSF活性，并明确其对致病性的显著调控作用(Newman et al.，2004)。近期的研究表明，黄单胞产生的QS信号分子DSF能够被多种细菌降解，这些细菌包括 Bacillus, Paenibacillus, Microbacterium, Staphylococcus 和 Pseudomonas 等属。基于细菌QS系统的特殊功能，科学家研究的焦点集中在抑制细菌群体感应系统上。通过抑制QS信号分子的产生、降解QS信号分子，阻断QS系统的级联反应等多种途径来减弱细菌的致病性。主要参考文献Barber C. E.，Tang J. L，Feng J. X.，et al. 1997. a novel regulatory systemrequired for pathogenicity ofXanthomonas campestris is mediated by a smalldiffusible signal molecule. Mol Microbiol24 :556-566.
Fuqua C&Greenberg EP (2002)Listening in on bacteria acylhomoserinelactone signaling. Nat RevMol Biol3 :685-695Leyns et al. 1984. The host range of the genus Xanthomonas. Bot Rev50 308-355Newman et al. 2008. virulence of planthogenic bacteria attenuated bydegration of fatty acidcell—to—celI signaling factors. Mol Plant MicrobeInteract 21 :326-334.
发明内容
技术问题本发明的目的是发明一种利用四唑紫为指示标记的能够快速、灵敏、准确的以DSF为底物的降解菌的筛选方法。技术方案“碳源一四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法的建立本筛选方法是根据BI0L0G细菌鉴定系统原理自行设计的。四唑紫(tetrazoliumviolet)是一种氧化还原指示剂，能够竞争氧化还原反应中的电子，获得电子后，四唑紫由无色变为紫色，获得的电子越多，紫色越深。本研究以DSF(diffusible signal factor)作为待测碳源，若细菌能够利用该碳源就能发生氧化还原反应，有电子转移，通过四唑紫由无色变为紫色，进而筛选能够降解DSF的阳性菌株。试验材料四唑紫(tetrazoliumviolet)购自 SIGMA 公司(69H1223), DSF 标准品购自Cayman公司(10008123)，96孔细胞培养板购自BOYANG公司，菌株G来自Karyn L. Newman,已报道能够降解DSF。试验方法接种液的配制I)将菌株G于NA培养基上28°C培养24h后，取无菌棉签在接种液(0.4% NaCl水溶液)中蘸湿。2)将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体，注意不要带出培养基。3)在接种液管液面上沿内壁转动棉签，使菌体附着在内壁上，同时将菌体均匀打散。4)倾斜接种液管，用棉签将菌体分散于接种液中。5)调整 0D_ = 0.6。筛选液的配制DSF (diffusible signal factor)是一种短链脂肪酸,在水中的溶解度为0. 5mg/mL(25°C )，因此，将 DSF依次配制成浓度为 0. 025,0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mg/mL 的水溶液，分别取100 μ L加入96孔细胞培养板内，并以无菌水作为阴性对照。每孔加入50 μ L的四唑紫(0. lmg/mL, H20)以及150 μ L的接种液，置于28°C培养12_16h后观察颜色变化。(四)说明书附I. “碳源一四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法的灵敏度检测结果。图2. “碳源一四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法的特异性检测结果。
1-10 :已报道的不能够降解DSF的菌株，11 G菌，12 :无菌水。图3.利用“碳源一四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法对实际样品的检测结果。1-94 :分离的待测菌株；95 G菌，96 :无菌水。
具体实施例方式对不同生境细菌的筛选取样地点I)从发生水稻白叶枯病的稻田取土样及发病的水稻植株；2)从加油站油料污染的土壤取土样； 3)从池塘水取水样；4)从阴沟附近取土样；5)从饭店抽油烟机外排管正对的油污地面取土样。6)将待测菌株于NA培养基上28°C培养24h后，取无菌棉签在接种液(O. 4% NaCl水溶液)中蘸湿。7)将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体，注意不要带出培养基。8)在接种液管液面上沿内壁转动棉签，使菌体附着在内壁上，同时将菌体均匀打散。9)倾斜接种液管，用棉签将菌体分散于接种液中。10)调整 OD600 = 0 . 6。筛选液的配制DSF (diffusible signal factor)是一种短链脂肪酸,在水中的溶解度为O. 5mg/mL (25°C )，因此，将DSF配制成浓度为O. 5mg/mL的水溶液，分别取100 μ L加入96孔细胞培养板内，并以无菌水作为阴性对照。每孔加入50 μ L的四唑紫(O. lmg/mL,H20)以及150 μ L的接种液，置于28°C培养12-16h后观察颜色变化。筛选结果目前为止，从不同生境获得5000余株细菌中，共筛选出57株具有降解DSF的阳性菌株，经 16SrRNA 测序鉴定分别属于 Bacillus、Paenibacillus、Microbacterium、Staphylococcus、Pseudomonas 属。
权利要求
1.用于筛选可扩散的信号因子即DSF降解菌的方法，其筛选方法主要利用的是四唑紫的颜色变化，若细菌能够利用DSF为碳源就能发生氧化还原反应，有电子转移，通过四唑紫由无色变为紫色，进而筛选能够降解DSF的阳性菌株。
2.权利要求I的筛选方法，其步骤为 (I)将待测菌株于NA培养基上28°C培养24h后，取无菌棉签在接种液即O. 4% NaCl水溶液中蘸湿；(2)将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体，转移于接种液中，调整0D_ = 0.6 ； (3)取100 μ L O. 5mg/mL的DSF水溶液，加入96孔细胞培养板内，每孔加入50 μ L的O. lmg/mL四唑紫水溶液，加入150 μ L的接种液，置于28°C培养12-16h后观察颜色变化。
全文摘要
本发明涉及筛选降解可扩散性信号分子(DSF)为底物的降解菌的筛选方法，属于生物技术领域。本筛选方法是根据BIOLOG细菌鉴定系统原理自行设计的，以DSF(diffusible signalfactor)作为待测碳源，若细菌能够利用该碳源就能发生氧化还原反应，有电子转移，通过四唑紫由无色变为紫色，进而筛选能够降解DSF的阳性菌株。图为利用本方法对不同生境细菌的降解DSF的筛选结果。
文档编号C12R1/07GK102876613SQ20121038852
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者胡白石, 田艳丽, 赵玉强, 刘凤权 申请人:南京农业大学