专利名称：利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法
技术领域：
本发明属于微生物多糖的发酵，特别是指一种利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法。
背景技术：
胶冻样类芽孢杆菌为土壤芽孢杆菌，其菌落圆形，无色，隆起，胶质粘稠，透明或半透明，边缘整齐。在过去的几十年中被作为微生物肥料的主要功能菌株被开发利用，其在农用微生物制剂领域发挥了重要作用。近年来随着对胶质类芽孢杆菌研究的不断深入，人们开始注意其胞外多糖的研究及应用。但热点依然集中在对胶质芽孢杆菌产多糖成分的分析及多糖对硅酸盐矿物的分解能力方面。对其多糖新的应用领域及优化工艺增加多糖产量方面的研究还较少。目前人们对微生物多糖产生的传统工艺主要是转接斜面法活化斜面菌·种，优化摇瓶发酵工艺参数等常规步骤，利用上述方法生产的发酵液中多糖的产量水平为3_5g/L。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵液中的微生物多糖含量高的利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法。本发明的整体技术构思是
利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，是将胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus )ACCC10013接种于含有碳源及氮源的培养基进行发酵,包括如下工艺步骤
A、菌种热刺激
在无菌条件下将试管斜面中的菌种孢子加入无菌水，振荡洗下孢子制成孢子悬液并置于无菌容器中，将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中，均匀加热，1-10分钟后将无菌容器取出并迅速冷却；
B、发酵
BI、培养基的配制
配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成
淀粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸铵O. 5%-5%，磷酸氢二钾10%_20%，硫酸镁5%_10%，三氯化铁O. 01%-0· 5%，碳酸钙O. 1%-5%，酵母膏O. 1%_3%，余量为无菌水，pH=7. 5 ；
B2、培养
将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比(通风比为发酵液体积每分钟通入空气的体积,下同。)为1:0. 2-0. 5VVM,4-12小时通风比为 1:0. 5-0. 7VVM，12-20 小时通风比为 1:0. 7-0. 9VVM，20-36 小时通风比为 1:1. 1-1. 5VVM,28-36小时通风比为1:0. 5-0. 7VVM，36-60小时通风比为1:0. 3-0. 5VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠I-IOml。本发明中的具体技术内容还有
无菌容器可以选用包括但不局限于试管或其他便于加热的容器，为便于无菌容器的加热，优选的技术方案是，步骤A中的无菌容器选用试管。均匀加热可以采用多种现有方式，均不脱离本发明的实质，其中较为优选的技术方案是，步骤A中的均匀加热采用边加热边振荡的方式进行。将无菌容器取出并迅速冷却是采用冷水将无菌容器冷却。步骤B中装料量为50升小罐装料38升。
本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于
I、将热刺激后的菌种用结晶紫染色，涂片，镜检发现弱菌及一些较弱的芽孢减少了，芽孢较整齐，着色较深，在50升小罐上进行发酵的表现是芽孢萌发快，生长延迟期缩短，减少了总的发酵时间，且菌体生长同步性好有利于后边的工艺控制，比如表面活性剂的加入。2、胶质类芽孢杆菌在营养贫乏时产生大量的荚膜，其能达到菌体大小的5-10倍，本发明在发酵过程中采取了波段培养的方法，即在培养的前期给菌种很好的生长环境以提高其生物量，在发酵培养的后期，严格控制溶氧并加入表面活性剂，创造营养贫乏的环境同时改变细胞膜的通透性使其在发酵液大量积累多糖，以达到提高多糖产量的目的。3、发酵结束后，测定多糖含量。检测方法为蒽酮比色法，其含量最高可达7. 5g/L，与目前报道工艺比较可提高产糖量10-50%。4、发酵产生的发酵液用sevag法进行初步的提取分离之后进行紫外扫描检测，检测发现其基本不含核酸和蛋白质。并初步测得其含有丰富的羟基和羧基，而且此多糖的粘度高，与黄原胶粘度相仿，且其具有很好的假塑性和悬浮性，将其应用到高档陶瓷制作上，发现很少量的此多糖可以产生很好的作用，提高陶瓷表面的光洁度，提高成品率，提升产品档次，能产生很好的经济效益。但相对于黄原胶此多糖的发酵时间短，发酵后期对氧的需求较少，减少了由于发酵液粘度增加引起的通气搅拌电能消耗，省去特殊的设备要求。可这为胶质芽孢杆菌产多糖的应用开创了很好的领域。另外，由于其具有的高粘度，假塑性和悬浮性等特性，其还可以在石油勘探，矿物浮选方面也有很好的应用前景。
具体实施例方式以下结合本发明的实施例作进一步及描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。实施例I
利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，是将胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus ) ACCC10013接种于含有碳源及氮源的培养基进行发酵，包括如下工艺步骤
A、菌种热刺激
在无菌条件下将试管斜面中的菌种孢子加入无菌水，振荡洗下孢子制成孢子悬液并置于无菌容器中，将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中，均匀加热，I分钟后将无菌容器取出并迅速冷却；B、发酵
BI、培养基的配制
配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成
淀粉5%，蔗糖5%，硫酸铵0. 5%，磷酸氢二钾10%，硫酸镁5%，三氯化铁0. 01%,碳酸钙0. 1%，酵母膏0. 1%，余量为无菌水，pH=7. 5 ；
B2、培养
将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培 养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比为1:0. 2VVM, 4-12小时通风比为1:0. 5VVM，12-20小时通风比为1:0. 7VVM, 20-36小时通风比为1:1. 1VVM，28-36小时通风比为1:0. 5VVM，36-60小时通风比为1:0. 3VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠1ml。步骤A中的无菌容器选用试管。步骤A中的均匀加热采用边加热边振荡的方式进行。将无菌容器取出并迅速冷却是采用冷水将无菌容器冷却。步骤B中装料量为50升小罐装料38升。发酵结束后，采用蒽酮比色法测定发酵液中的多糖含量。其含量可达6. 85g/L。实施例2
本实施例中步骤A中将无菌容器均匀加热10分钟后，将无菌容器取出并迅速冷却；
B、发酵
BI、培养基的配制
配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成
淀粉20%，蔗糖10%，硫酸铵5%，磷酸氢二钾20%，硫酸镁10%，三氯化铁0. 5%，碳酸钙5%，酵母膏3%，余量为无菌水，pH=7. 5 ；
B2、培养
将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比为I:. 5VVM，4-12小时通风比为I: 0. 7VVM, 12-20小时通风比为1: 0. 9VVM，20-36小时通风比为I: I. 5VVM, 28-36小时通风比为I: 0. 7VVM, 36-60小时通风比为I: 0. 5VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠10ml。其余内容同实施例I。发酵结束后，采用蒽酮比色法测定发酵液中的多糖含量。其含量可达7. 2g/L。实施例3
本实施例的步骤将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中均匀加热，8分钟后将无菌容器取出并迅速冷却；
B、发酵
BI、培养基的配制
配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成
淀粉15%，蔗糖8%，硫酸铵3%，磷酸氢二钾15%，硫酸镁8%，三氯化铁0. 3%，碳酸钙3%，酵母膏1%，余量为无菌水，pH=7. 5 ；B2、培养
将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比为I: 0. 3VVM，4-12小时通风比为1:0. 6 VVM, 12-20小时通风比为1:0. 8VVM，20-36小时通风比为1:1. 3VVM，28-36小时通风比为1:0. 6VVM，36-60小时通风比为1:0. 4VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠8ml。其余内容同实施例I。发酵结束后，采用蒽酮比色法测定发酵液中的多糖含量。其含量可达7. 5g/L。实施例4
本实施例的步骤将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中均匀加热，6分钟后将无菌容 器取出并迅速冷却；
B、发酵
BI、培养基的配制
配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成
淀粉8%，蔗糖6%，硫酸铵1%，磷酸氢二钾13%，硫酸镁7%，三氯化铁0. 1%，碳酸钙1%，酵母膏0. 5%，余量为无菌水，pH=7. 5 ；
B2、培养
将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比为1:0. 3VVM, 4-12小时通风比为1:0. 6VVM, 12-20小时通风比为1:0. 8VVM, 20-36小时通风比为1:1. 3VVM，28-36小时通风比为1:0. 6VVM，36-60小时通风比为1:0. 5VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠3ml。其余内容同实施例I。发酵结束后，采用蒽酮比色法测定发酵液中的多糖含量。其含量可达7. Og/L。实施例5
本实施例的步骤将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中均匀加热，3分钟后将无菌容器取出并迅速冷却；
B、发酵
BI、培养基的配制
配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成
淀粉18%，蔗糖9%，硫酸铵0. 6%，磷酸氢二钾18%，硫酸镁9%，三氯化铁0. 07%,碳酸钙0. 9%，酵母膏0. 8%，余量为无菌水，pH=7. 5 ；
B2、培养
将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比为1:0. 4VVM，4-12小时通风比为1:0. 6VVM, 12-20小时通风比为1:0. 85VVM，20-36小时通风比为1:1. 45VVM，28-36小时通风比为1:0. 6VVM，36-60小时通风比为1:0. 35VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠9ml。其余内容同实施例I。
发酵结束后，采用蒽酮比色法测定发酵液中的多糖含量。其含量 可达6. 95g/L。
权利要求
1.利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，是将胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus )ACCC10013接种于含有碳源及氮源的培养基进行发酵,其特征在于包括如下工艺步骤 A、菌种热刺激 在无菌条件下将试管斜面中的菌种孢子加入6ml无菌水，振荡洗下孢子制成孢子悬液并置于无菌容器中，将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中，均匀加热，ι- ο分钟后将无菌容器取出并迅速冷却； B、发酵 BI、培养基的配制 配制培养基并灭菌，将其冷却至30°C，培养基由如下质量百分数的组分组成 淀粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸铵O. 5%-5%，磷酸氢二钾10%_20%，硫酸镁5%_10%，三氯化铁O. 01%-0· 5%，碳酸钙O. 1%-5%，酵母膏O. 1%_3%，余量为无菌水，pH=7. 5 ； B2、培养 将步骤A中处理后的菌种接种于步骤B制备的培养基中，发酵周期为60小时，培养温度30°C，接种量为菌种灭菌后培养基的质量百分比为8% ;风量调节为0-4小时通风比为 1:0. 2-0. 5VVM,4-12 小时通风比为 1:0. 5-0. 7VVM, 12-20 小时通风比为 1:0. 7-0. 9VVM,20-36小时通风比为1:1. 1-1. 5VVM，28-36小时通风比为1:0. 5-0. 7VVM, 36-60小时通风比为1:0. 3-0. 5VVM，结束培养，在培养36小时之后补料流加表面活性剂十二烷基磺酸钠I-IOml。
2.根据权利要求I所述的利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中的无菌容器选用试管。
3.根据权利要求I所述的利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中的均匀加热采用边加热边振荡的方式进行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，其特征在于所述的将无菌容器取出并迅速冷却是采用冷水将无菌容器冷却。
5.根据权利要求I所述的利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法，其特征在于所述的步骤B中装料量为50升小罐装料38升。
全文摘要
本发明属于微生物多糖的发酵，特别是指一种利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法。是将胶质类芽孢杆菌接种于含有碳源及氮源的培养基进行发酵，通过菌种热刺激和在发酵过程中添加表面活性剂等方式优化生产工艺，本发明解决了现有技术存在的发酵液中多糖的产量低的问题，具有发酵液中多糖产量高、菌体生长好、发酵周期短等优点。
文档编号C12R1/01GK102952834SQ20121042510
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者陈文杰, 章淑艳, 魏亚新, 李军, 秦艳梅, 赵从波, 韩涛, 王云鹏, 古述江, 刘丽娜 申请人:河北省微生物研究所