专利名称：具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
本申请是中国专利申请200880113918. X的分案申请，原申请的申请日是2008年 10月29日，发明名称是“具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法”。
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节植物中编码D0F_C2(具有一个指状物的结合DNA的，亚组C2)结构域转录因子多肽或MYB结构域蛋白(MYB7)的核酸的表达而增强产量相关性状或改善多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码 D0F-C2结构域转录因子多肽或MYB7的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供了在本发明方法中有用的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。 常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有可能并不总导致受欢迎性状从亲代植物传递下去的异源遗传组分。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入、胁迫耐受性和早期生长势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以有助于提高作物产量。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人和动物营养是重要的。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的来源)和胚乳(萌发期间和籽苗早期生长期间用于胚生长的养分来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
对于许多作物的另一个重要性状是早期生长势。改进早期生长势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种方面的重要目标。长根对于水栽稻中正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与生长势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对良好出苗是重要的。将早期生长势人工改造到植物内的能力在农业中将是极重要的。例如，不良的早期生长势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.) 杂种。
又一个重要性状是改进的非生物性胁迫耐受性。非生物性胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言平均产量降低超过50% (Wang等人，Planta(2003) 218 :1_14)。非生物性胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。改善植物的非生物性胁迫耐受性能力将在世界范围对农民是巨大的经济优势并且将允许在不利条件期间及在本来不可能栽培作物的陆地上栽培作物。
因而可以通过优化前述因素之一提高作物产量。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于用途。多种机制可以有助于提高种子产量，无论其形式为提高的种子尺寸或提高的种子数目。
提高植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。
现在已经发现可以在植物中通过调节植物中编码植物中D0F-C2结构域转录因子多肽或MYB7的核酸的表达改善产量相关性状或各种生长特征。
Dof结构域蛋白(包含Dof结构域的蛋白质)是植物特异性转录因子，其具有带单个C2-C2锌指的高度保守的DNA结合结构域。在过去十年期间，已经在包括玉米、大麦、 小麦、稻、烟草、拟南芥属植物、南瓜、马铃薯及豌豆的单子叶植物和双子叶植物中鉴定到许多Dof结构域蛋白。已经显示Dof结构域蛋白作为转录激活物或阻遏物在多样的植物特异性生物学过程中发挥作用。系统发育研究表明Dof结构域蛋白在被子植物的多样化之前趋异，因而在长时间增殖后，明显不同的Dof结构域蛋白可能已经进化以在植物生理学中发挥不同的作用。然而，Dof结构域的高度保守序列可以赋予Dof结构域蛋白相似的功能。另一方面，Dof结构域蛋白的序列在Dof结构域之外是高度趋异的。已经提出Dof结构域之外的多样化区域可能与明显不同的Dof结构域蛋白的不同功能有关(Yanagiswa,Plant Cell Physiol. 45(4) :386_391(2004)。
Dof结构域蛋白展示序列特异性DNA结合活性。序列特异性仅由Dof结构域决定(Yanagisawa, S. (1995)Nucleic Acids Res. 23 :3403_3410 ；Kisu, Y. , Ono, T., Shimofurutani, N. ,Suzuki,M.和 Esaka’M. (1998)Plant Cell Physiol. 39 :1054-1064.)。 已经对许多Dof蛋白(Dof结构域蛋白)描述了所革巴向DNA中的结合位点(De Paolis, A. , Sabatini, S. , de Pascalis, L. , Contantino, P.和 Capone, I. (1996)Plant J. 10 215-223 ；Yanagisawa, S.和 Izui，K. (1993)J. Biol. Chem. 268 16028-16036 ；Mena, M.， Vicente-Carbajosa, J.，Schmidt, R. J.和 Carbonero, P. (1998)Plant J. 16 :53_62)。大部分Dof结构域蛋白结合互补链中的序列AAAG或CTTT。在与AGTA序列结合的南瓜AOBP Dof结构域蛋白中存在例夕卜(Kisu等人· 1998. Plant cell physiol 39,1054-1064)。序列 (A/T)AAAG代表Dof结构域的已识别的DNA结合核心基序。
Dof结构域由包含共有序列CX2CX21CX2C的约50_60个氨基酸组成，其中认为所述的共有序列形成与Cys2/Cys2锌指结构域相似的锌指结构，其中4个保守的半胱氨酸残基将与锌离子配位(Uemura等人.2004Plant J 37，741-749)。Dof结构域富含碱性氨基酸。尽管Dof结构域的氨基酸序列和半胱氨酸残基的排列不同于其他锌指，然而全部Dof 结构域均具有4个保守的半Jj光氛酸残基(Yanagisawa, S. (1995)Nucleic Acids Res. 23 3403-3410. Yanagisawa, S. (1996)Trends Plant Sci. I 213-214. Yanagisawa, S. (2002)Trends Plant Sci. 7 :555_560)。
拟南芥和稻的Dof结构域蛋白已经被划分成4个主要直向同源聚类，称作Aa、Bb、 Ce 和 Dd (Li javetzky 等人· 2003. BMC Evolutionary Biology3)。基于系统发育关系，已经在主要聚类中某些聚类内部识别出子聚类。在Dof结构域外部，不同聚类中的成员之间存在很小的序列保守性。这种大的序列多样性提示植物中Dof结构域蛋白的差异性生物学作用。然而，相同聚类或子聚类内部的成员共有大量保守的序列基序，这提示属于相同聚类或子聚类的Dof蛋白的生物学功能保守性。
WO 2007/064724公开了在提高植物产量中有用的属于聚类Dd和Bb的Dof结构域蛋白。
在一个实施方案中，现在已经令人惊讶地发现调节编码属于聚类Ce、子聚类C2的 Dof结构域蛋白(D0F-C2转录因子多肽)的核酸的表达产生了相对于合适的对照植物具有提高(或增强)的产量的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码D0F-C2结构域转录因子多肽的核酸的表达。
MYB结构域蛋白是具有高度保守的DNA结合结构域的转录因子。最初在禽成髓细胞瘤病毒的致癌基因(v-myb)中描述了 MYB结构域(Klempnauer等人，(1982)Cell 33, 453-63)。许多脊椎动物含有与v-Myb、c_Myb、A-Myb和B-Myb相关的3种基因并且已经在昆虫、植物、真菌和粘菌中鉴定到其他的相似基因。所编码的蛋白质对于许多细胞类型中增殖和分化的控制是重要的。MYB蛋白含有50-53个氨基酸的保守序列的I至4个不完全同向重复序列，所述保守序列编码参与DNA结合的螺旋-转角-螺旋结构(Rosinski和 Atchley (1998) J Mol Evol 46, 74-83) 0 3个规律间隔的色氨酸残基(它们在三维螺旋-转角_螺旋结构中形成色氨酸簇)是MYB重复序列的特征。将c-Myb中的这三个重复序列称作Rl、R2和R3 ;并且将来自其他MYB蛋白的重复序列根据它们与Rl、R2或R3的相似性分类。由于在MYB结构域之外存在少量序列保守性，因而已经将MYB蛋白基于MYB编码区之外所鉴定到的保守基序聚类成亚组(Jiang等人，(2004)Genome Biology 5, R46)。
AtMYB7 属于 R2R3-MYB 基因家族(Li 和 Parish, Plant J. 8，963-972，1995)，该基因家族是一个大的基因家族(具有拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已报道的126种基因)(Zimmerman等人,Plant J. 40, 22-34, 2004))。该组成员参与多种过程,包括次级代谢、 细胞形态发生、分生组织形成的调节、花与种子发育、细胞周期、防御和胁迫应答、光和激素信号传导(Chen等人，Cell Res. 16，797-798，2006)。尽管报道AtMYB7在胁迫下具有增加的表达(Ma和Bohnert, Genome Biology 8 :R49, 2007),然而它在植物中的确切功能仍未知。 进一步推测AtMYB7表达在生物胁迫耐受性中发挥作用(W0 02/16655和WO 03/000898)。 WO 2007099096公开了用于提高植物中种子产量的稻MYB蛋白。
在另一个实施方案中，已经令人惊讶地发现调节编码MYB7多肽的核酸的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其提高的营养生物量和提高的出苗生长势的植物。
根据另一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MYB7多肽的核酸的表达。这种改善的产量相关性状包含提高的生物量和提高的出苗生长势。CN 102936605 A书明说4/63 页
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
对照棺物
选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是因分离而丢失转基因的个体。 如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
同源物·
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与衍生它们的非修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基被导入蛋白质中的预定位点。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常，在氨基酸序列内部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约I至10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、 噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、 二氢叶酸还原酶、Tag· 100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP( ·丐调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
替换指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，但是根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约I至10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域熟知的 (见例如 Creighton (1984) Proteins, ff. H. Freeman and Company (编著)和下表 I)。
表I :保守性氨基酸替换的例子
残基保守性替换残基保守性替换AlaSerLeuHeValArgLysLysArgGlnAsnGln ；HisMetLeuHeAspGluPheMetLeu ；TyrGlnAsnSerThrGlyCysSerThrSerValGluAspTrpTyrGlyProTyrTrp ；Phe权利要求
1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MYB7 多肽的核酸的表达，其中所述的MYB7多肽包含2个SANT结构域。
2.根据权利要求I的方法，其中所述的MYB7多肽包含基序I至7(SEQID N0:55至SEQ ID NO 61)中的4种或更多种基序。
3.根据权利要求I或2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码 MYB7多肽的核酸实施。
4.根据权利要求I至3任一项的方法，其中所述编码MYB7多肽的核酸编码表A2中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
5.根据权利要求I至4任一项的方法，其中所述的核酸序列编码表A2中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据权利要求I至5任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物而言提高的生物量和/或提高的出苗生长势。
7.根据权利要求I至6任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
8.根据权利要求3至7任一项的方法，其中所述的核酸有效连接至组成型启动子。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的核酸有效连接至G0S2启动子。
10.根据权利要求9的方法，其中所述的核酸有效连接至来自稻的G0S2启动子。
11.根据权利要求I至10任一项的方法，其中所述编码MYB7多肽的核酸是植物来源的。
12.根据权利要求11的方法，其中所述编码MYB7多肽的核酸是双子叶植物来源的。
13.根据权利要求12的方法，其中所述编码MYB7多肽的核酸来自十字花科 (Brassicaceae)。
14.根据权利要求13的方法，其中所述编码MYB7多肽的核酸来自拟南芥属 (Arabidopsis)。
15.根据权利要求14的方法，其中所述编码MYB7多肽的核酸来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
16.构建体，其包含(i)编码权利要求I或2中定义的一类MYB7多肽的核酸；( )能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地(iii)转录终止序列。
17.根据权利要求16的构建体，其中所述的控制序列之一是组成型启动子。
18.根据权利要求17的构建体，其中所述的组成型启动子是G0S2启动子。
19.根据权利要求18的构建体，其中所述的组成型启动子是来自稻的G0S2启动子。
20.根据权利要求16至19任一项的构建体在用于制备植物的方法中的用途，其中所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别地具有提高的生物量和/或提高的出苗生长势。
21.用根据权利要求16至19任一项的构建体转化的宿主细胞。
22.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有提高的产量、 特别地具有提高的生物量和/或提高的出苗生长势，所述方法包括(i)在植物中导入并表达编码权利要求I至2中定义的MYB7多肽的核酸；和 ( )在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
全文摘要
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于通过调节植物中编码DOF-C2(具有一个指状物的结合DNA的，亚组C2)结构域转录因子多肽或MYB 7多肽的核酸的表达而增强植物中产量相关性状的方法。本发明也涉及具有编码DOF-C2结构域转录因子多肽或MYB7多肽的核酸受调节地表达的植物，所述植物相对于对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的包含DOF-C2结构域转录因子多肽或MYB7多肽的构建体。
文档编号C12N15/29GK102936605SQ201210441289
公开日2013年2月20日 申请日期2008年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者C·勒佐, A·I·桑兹莫林纳罗 申请人:巴斯夫植物科学有限公司