专利名称：细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞色素结合结构域蛋白及其编码基因的新用途，尤其涉及细胞色素结合结构域蛋白及其编码基因作为助分泌因子或助分泌基因以提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量中的新用途，属于细胞色素结合结构域蛋白或其编码基因的用途领域。
背景技术：
毕赤酵母(Pichia pastoris)是单细胞真核生物，既有类似原核生物的生长特征， 又有一般真核生物的细胞生物学特性，是目前最成功的外源基因真核表达系统。毕赤酵母表达系统具有易于操作培养，高密度发酵水平很高，表达菌株稳定，正确翻译和翻译后加工修饰更接近于高等真核生物等优点。除此之外毕赤酵母极少分泌自身蛋白，在其培养液中除目的蛋白外，几乎不含任何其它蛋白，这样就使得目的蛋白的纯化变得非常简单，而且许多外源基因的分泌表达量可达到每升克级以上，因此利用该系统可以极大的降低目的蛋白的生产成本。但是，如果目的蛋白不能分泌到胞外，其产量一般不会高于细胞总蛋白量的 1%，并且目的蛋白的纯化将变得非常复杂，蛋白质的生产成本自然也会非常高。因此尽管科研人员非常希望利用毕赤酵母高效分泌表达外源基因，然而到目前为止仍然有许多基因 (尤其是那些在原始菌或细胞中不分泌表达的基因)不能在毕赤酵母中分泌表达或分泌表达量非常低，这个问题也成为限制该表达系统更广泛应用的一个关键因素。
有研究发现若蛋白在毕赤酵母中表达但不分泌，可以通过在蛋白质N端融合一些蛋白质标签来，表达提高目的蛋白的分泌量。已有的助分泌因子主要有谷胱甘肽转移酶 (glutathione-S-transf erase, GST),绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP), 硫氧还蛋白(thioredoxin),泛素(ubiquitin),纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CE )，翻译起始因子 IF2 的 Domainl,绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)以及来源于大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)。这些蛋白质标签可以提高一些特定蛋白质在毕赤酵母中的分泌量。
细胞色素结合结构域蛋白(Cytochromes heme binding domain, CHBD)为蛋白质细胞色素b5 (cytochrome b5)中N端的一部分(N端100个氨基酸)。该蛋白质广泛存于高等动物内质网膜，具有分子量小、可溶性大、稳定性高等优点，作为电子传递蛋白，可参与生物体组织中一系列重要的氧化还原反应，如脂质和类固醇的合成代谢等。发明内容
本发明的主要目的是提供细胞色素结合结构域蛋白的一种新用途；
本发明的另外一个目的是提供一种提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的
本发明通过试验发现，将细胞色素结合结构域蛋白(CHBD)编码基因(SEQ IDNo. I)与外源基因进行融合并转化到毕赤酵母中进行分泌表达，能有效提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。进一步的，本发明将细胞色素结合结构域蛋白编码基因通过密码子优化、提高mRNA 二级结构的稳定性等措施得到优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因(CHBD-O) (SEQ ID No. 2)，将该优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因进行融合并转化到毕赤酵母中进行分泌表达，能够非常显著的提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。
由此，可将细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子或将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因作为助分泌基因应用于提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。
本发明按照毕赤酵母的偏嗜性对细胞色素结合结构域蛋白(CHBD)编码基因进行了优化，通过在原始的CHBD或优化后的CHBD-O标签的C端引入能在毕赤酵母中能被KeX2 蛋白酶识别的切割位点(EKREAEA) (SEQ IDNo. 5)，然后再加上外源基因得到融合基因，所表达的融合蛋白在分泌出胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和CHBD助分泌因子，能够更有效的提高外源基因的分泌表达量；由于该方法在外源蛋白质的N端不增加多余的序列，因而不会影响分泌蛋白质的理化性质。
本发明通过进一步的研究发现，细胞色素结合结构域作为蛋白标签可以提高许多种蛋白质(如甲基对硫磷水解酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶等)的分泌表达量，具有较好的应用前景。
本发明的另一个目的是提供一种提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量的方法， 该方法包括以下步骤
将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合在一起，得到融合基因；将融合基因与酵母表达载体可操作性的连接在一起构建得到含有所述融合基因的重组酵母表达载体；将所述重组酵母表达载体转化到毕赤酵母中进行分泌表达。
优选的，将将细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合之前，先将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点 (EKREAEA)，然后再加上外源基因。
作为本发明一个优选的具体实施方案，本发明将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点(EKREAEA)，然后再加上甲基对硫磷水解酶(mph)编码基因，得到融合基因CHBD-O-MPH ;将该融合基因与毕赤酵母表达载体 pPIC9相连接构建得到重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o-mph ;作为对照,本发明将甲基对硫磷水解酶基因与毕赤酵母表达载体PPIC9相连接构建得到重组毕赤酵母表达载体 pPIC9-mph ;将所构建的重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o_mph以及pPIC9_mph分别转化到毕赤酵母中进行分泌表达；试验结果发现，没有融合细胞色素结合结构域蛋白基因的 MPH在毕赤酵母表达时分泌量极低，其在毕赤酵母中表达分泌量极低，通过测量50个阳性克隆子，经诱导后其上清平均酶活性为O. 02U/mL。而将助分泌因子(CHBD-O)融合至mph的 N-端后，挑取50个阳性克隆子，经摇瓶诱导培养研究发现，CHBD-O-MPH的毕赤酵母重组菌株经诱导培养基上清平均能达到O. 31U/mL,因此该融合蛋白使MPH的毕赤酵母表达分泌量提高13倍，因此CHBD或CHBD-O助分泌因子可用于提高MPH等外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。此外，融合蛋白表达后在分泌出胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和CHBD助分泌因子质，外源蛋白质的N端不增加额外的序列，因而不会影响分泌蛋白质的理化性质。
图I对硝基酚含量测定标准曲线。
图2重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph的图谱。
图3MPH、融合标签CHBD-MPH、融合标签CHBD-O-MPH毕赤酵母表达初筛菌株诱导上清酶活分布箱须图；1 :毕赤酵母中单独表达MPH的初筛菌株诱导48h后上清酶活分布；2 毕赤酵母中表达MPH的N端融合CHBD的初筛菌株诱导48h后上清酶活分布；3 :毕赤酵母中表达MPH的N端融合优化的CHBD的初筛菌株诱导48h后上清酶活分布；
箱外圆圈表示异常值，箱三条横线代从下至上分别代表第一四分位数(初筛的重组毕赤酵母总体数目中，诱导培养基上清酶活从低至高计数，1/4倍初筛菌株总体数目的酶活值为第一四分位线)，中位数(初筛的重组毕赤酵母中，诱导培养基上清酶活数据中除异常值外其他酶活数的平均值)，第三四分位数(初筛的重组毕赤酵母总体数目中，诱导培养基上清酶活从低至高计数，3/4倍初筛菌株总体数目的酶活值为第一四分位线)；箱外下横线分别代表酶活数据分布状态的最小值，箱外上横线分别代表酶活数据分布状态的最大值；箱面积越小，代表酶活值越集中。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。保护
I实验材料
I. I菌株，质粒，工具酶，试剂
大肠杆菌ToplO菌株和毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司；质粒pPIC9购自 Invitrogen公司；Fast Pfu购自全式金生物技术有限公司；Taq polymeras、DNA胶回收试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast extract)购买自英国Oxford公司；YNB购买自北京经科宏达生物技术有限公司；甲基对硫磷购于国家农药质量监督检验中心，Ikb的DNA分子量标准定购于鼎国公司，dNTP、DNA纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒均定购于天根生化科技有限公司，琼脂糖购于 Sigma公司，其余化学试剂均为国产分析纯。
I. 2培养基及有关溶液的配制
LB培养基氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，用3M的氢氧化钠调节至 PH7. O (固体培养基配制时添加I. 5%的琼脂粉)，121° C，15min高压蒸汽灭菌。
质粒提取溶液I :50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH8. O)，IOmM EDTA (pH8. O)。
质粒提取溶液II :0. 2M氢氧化钠，1%SDS,现用现配。
质粒提取溶液III 5M乙酸钾60. OmL，冰乙酸11. 5mL，水28. 5mL。
3M醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH 5. 2):量 600mL 的蒸馏水，称取 408. 24g NaAC ·3Η20， 用冰醋酸调至pH 5. 2，定容至1L。
TAE (50 X) 242g Tris 碱，57. ImL 冰乙酸，IOOmL O. 5M EDTA (ρΗ8· O)，无菌水定容至IL0
YPD :蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L, 108° C, 30min高压蒸汽灭菌。
BMGY培养基蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾11. 9g/L，磷酸氢二钾3g/ L，甘油10mL/L，121° C，15min高压蒸汽灭菌，待冷却至室温加入YNB 13. 4g/L，生物素 4Xl(T4g/L，0. 5% 的甲醇。
BMMY培养基蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾11. 9g/L，磷酸氢二钾3g/ L，121° C，15min高压蒸汽灭菌，待冷却至室温加入YNB13. 4g/L，生物素4X 10_4g/L，甲醇 5mL/L。
MD培养基琼脂糖20g/L，葡萄糖20g/L，108° C，30min高压蒸汽灭菌，冷却后加入 YNB13. 4g/L，生物素 4X l(T4g/L。
SDS-PAGE 上样缓冲液(2X) 100mM Tris-HCl (pH6. 8)、200mM 二硫苏糖醇(DTT)、 4%SDS、0. 2%溴酚蓝、10%甘油。
30%丙烯酰胺溶液29g丙烯酰胺，Ig N, N-亚甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水。
Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mM Tris 碱，250mM 甘氨酸(pH8. 3),0. 1%SDS。
考马斯亮蓝染液0. 24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇水(I: 1，v/v)和IOmL 冰乙酸。
脱色液90mL甲醇水(1:1, v/v)与IOmL冰乙酸混合至100mL。
实施例I pPIC9-chbd-mph、pPIC9-chbd-o_mph表达载体的构建、在毕赤酵母中的表达以及表达产物的产量和酶学性质分析
I、试验方法
I. I细胞色素结合结构域(CHBD)基因的优化
对CHBD基因(全长300bp)(SEQ ID No. I)通过密码子优化、提高mRNA 二级结构的稳定性等措施得到SEQ ID No. 2所示的优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因。其中，对 65个碱基进行优化，优化后的GC含量由优化前的50%下降到41. 33%，其在毕赤酵母中的密码子适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)由优化前的O. 69提高到O. 81。通过上述的密码子的优化手段有效提高了 CHBD基因翻译的效率，最终显著提高目的蛋白质的表达量。
CHBD基因优化前转录出mRNA的吉布斯自由能为-90. 6，CHBD基因优化后转录出 mRNA的吉布斯自由能为-78. lOkcal/mol，可见，优化后的CHBD基因转录出mRNA的吉布斯自由能明显提高，有利于维持mRNA的稳定性，促进翻译顺利进行，最终有效提高目的蛋白表达量。
I. 2 重组毕赤酵母表达载体 pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph 的构建
将助分泌因子优化的CHBD基因(SEQ ID No. 2) (CHBD-O)与mph基因(GenBank登录号ACC63894)通过KeX2蛋白酶识别位点(SEQ ID No. 4)作为Linker进行连接，并在基因的两端设计酶切位点SnabI和Notl，得到一个完整的基因表达元件(SEQ ID NO. 6)，将该片断进行全基因合成，测序正确后，将其通过酶切位点SnabI和NotI连接到毕赤酵母表达载体pPIC9中，得到重组载体pPIC9-chbd-o_mph ；
按照同样的方法，将未优化的细胞色素结合结构域(CHBD)基因(SEQID No. I)与 mph基因(GenBank登录号ACC63894 )通过KeX2蛋白酶识别位点(SEQ ID No. 4)作为 Linker进行连接，并在基因的两端设计酶切位点SnabI和NotI，得到一个完整的基因表达元件(SEQ ID NO. 7)，将该片断进行全基因合成，测序正确后，将其通过酶切位点SnabI和 NotI连接到毕赤酵母表达载体pPIC9中，得到重组载体pPIC9-chbd-mph ；
重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph的图谱见图2。
同时也通过酶切位点SnabI和NotI构建了只有mph基因而没有CHBD基因和 Linker序列的表达载体pPIC9_mph作为对照。
I. 3质粒DNA的准备
大量提取重组质粒pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph 以及 pPIC9_mph,将质粒进行定量，保证DNA的量达到8 μ g以上。Bgl II线性化质粒DNA，酶切体系见表I :
表I
重组质粒IOOuL(IOug)IOXH Buffer40 μ LBgl II6μ LddH20255 μ L总体积400 μ L
将酶切体系置于37° C处理3h，加入1/10体积的3M NaAC (pH5. 2)，混匀。再加入混合液两倍体积的冰浴无水乙醇，于-20° C放置30min后，12，OOOrpm离心IOmin, 75%乙醇洗涤两次，真空冷冻抽干，溶水20 μ L，备用。
I. 4 GSl 15感受态制备
(I)挑取GS115单菌落到含20mL YPD液体培养基中，28° C摇床过夜培养。
(2)将过夜培养菌以1/100的接种量转接至含IOOmL YPD液体培养基中培养至菌体浓度达到OD600为I. 3-1. 5。
(3)将GS115菌液倒入两个50mL的离心管中，4° C、3750rpm离心5min,弃离心后的上清。
(4)用等体积的冰预冷的去离子水重悬沉淀,4° C、3750rpm离心5min,弃离心后上清。
(5)用半体积的冰预冷的去离子水重悬沉淀,4° C、3750rpm离心5min,弃离心后上清。
(6)用1/10体积冰预冷的IM山梨醇轻柔重悬沉淀,4° C、3750rpm离心5min,弃离心后上清。
(7)用200 μ L预冷的IM山梨醇轻柔重悬沉淀，按每管80 μ L分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70° C。
I. 5电击转化毕赤酵母
各取线性化的重组质粒pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph 或 pPIC9_mph 约 8 μ g，各自加入一管分装好的毕赤酵母感受态中，用枪头轻柔搅动混匀于冰上静置Imin 后，用移液枪转移至洗干净的直径为O. 2cm的预冷电击杯(BioRad)的底部，电击仪电压设置为2. 5kV,电容为25 μ F,电阻为400 Ω的程序进行电击操作。
电转后，立即向电击杯中加入ImL预冷的IM山梨醇，混匀后取200 μ L涂布MD平板，将平板倒置于30° C温箱静置培养。
I. 6酶活测定体系标准曲线的绘制
甲基对硫磷水解酶(MPH)将甲基对硫磷农药水解为等摩尔的对硝基酚 (p-nitrophenol)及二乙基硫代磷酸酯，测定产物中的对硝基酚的含量即可计算出甲基对硫磷水解酶的酶活性。准确称取对硝基酚O. 0835g,先用少量95%乙醇溶解，然后用水定容至IOOmL,终浓度为6mM。如表2所示，将该6mM的母液用Tris-HCl (pH 8. O)稀释成不同浓度的900 μ L体系，再加入10%TCA终止液，10%的Na2CO3显色液，取200 μ L于96孔板中，用酶标仪测量96孔板中样品在405nm下吸光值，并绘制酶活性标准曲线。
表2对硝基酚含量测定的标准曲线制作
权利要求
1.细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子在提高外源基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)分泌表达量中的应用；其中，所述细胞色素结合结构域蛋白的氨基酸序列为SEQID No. 3 所示。
2.优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNo. 2所示。
3.一种融合基因，其特征在于含有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.细胞色素结合结构域蛋白编码基因或权利要求2所述优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因作为助分泌基因在提高外源基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达量中的应用。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，包括将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合得到融合基因；将融合基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于所述的融合是将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入能在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点，然后再加上外源基因；其中，所述切割位点的氨基酸序列为SEQID No. 5所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo. 4所示。
7.按照权利要求1、4、5或6所述的应用，其特征在于所述的外源基因是甲基对硫磷水解酶编码基因。
8.一种提高外源基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达量的方法，包括将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或权利要求I所述优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合在一起得到融合基因；将融合基因与酵母表达载体可操作性的连接在一起构建得到重组酵母表达载体；将重组酵母表达载体转化到毕赤酵母中进行分泌表达。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的融合是将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点，然后再加上外源基因；其中，所述切割位点的氨基酸序列为SEQ IDNo. 5所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示。
10.按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的外源基因是甲基对硫磷水解酶编码基因；所述的酵母表达载体是毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体。
全文摘要
本发明公开了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子提高外源蛋白在毕赤酵母中分泌的用途。将细胞色素结合结构域蛋白编码基因按毕赤酵母密码子偏好进行优化并与外源基因进行融合得到融合基因，将融合基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达能显著提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。由此，本发明提供了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子或其编码基因作为助分泌基因的新用途。此外，融合有细胞色素结合结构域蛋白编码基因的融合基因所表达的融合蛋白在分泌出毕赤酵母细胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和细胞色素结合结构域蛋白质，使外源蛋白质的N端不增加额外的序列，不影响分泌蛋白质的理化性质。
文档编号C12N15/81GK102977206SQ20121046948
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者田 健, 伍宁丰, 初晓宇, 黄璐, 王平 申请人:中国农业科学院生物技术研究所