专利名称：青枯病菌培养基及青枯病菌电激感受态细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于农业病虫害防治领域，具体是涉及一种青枯病菌培养基及青枯病菌电激感受态细胞的制备方法。
背景技术：
青枯病是爺科植物上由爺科雷尔氏菌引起的一种世界范围的细菌性土传病害，广泛分布于热带、亚热带及温带地区。青枯病菌具有广泛的寄主，可侵染50多个科的200余种植物，植物一旦感染这种病原菌后，会造成作物的大量减产。由于“温室效应”所引起的全球气候变暖，该病原菌呈现出向高纬度地区蔓延的趋势，给作物生产带来极大的危害。青枯病是一种维管束病害，在作物 的整个生长期都可发生，现蕾开花期症状最明显，特别是温暖潮湿、雨水充沛的环境发病尤为严重。病原菌侵害植株的维管束，使茎基部和根维管束变褐色，尤其是导管部分变褐甚至腐烂。感病的块茎切开后，可见维管束呈褐色，切面不需挤压即可溢出白色菌脓，这也是判断得此病的标准。在生产上对于青枯病目前还没有很好的防治措施。化学药剂及农业综合防治效果都不明显，化学药剂防治一方面提高了生产成本，另一方面也对环境造成污染；农业综合防治费时费力，难以推广。因此，深入了解青枯病菌的致病机理，对有效防止和控制青枯病的发生有很大的帮助。研究青枯病菌的致病机理的关键是获得无致病能力的突变菌株，目前最佳的方法是通过转座子进行青枯病菌致病菌株基因组的突变，进行转座子突变的前提条件是获得具有较高转化效率的青枯病菌株的感受态细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青枯病菌培养基及青枯病菌电激感受态细胞的制备方法，以便获得具备较高电激转化效率的青枯病菌感受态细胞。本发明的技术方案是，一种青枯病菌培养基，固体，每I升培养基中，各组分及含量为:500克新鲜马铃薯浸出液；Ca(NO3)2. 4H201. O克；Na2HPO4. 12H20 2. O克；蛋白胨5. O克；酵母浸出物I克；鹿糖15克；琼脂15克。前面所述的青枯病菌培养基，优选的方案是，pH值6. 8。前面所述青枯病菌培养基的制备方法，步骤如下
(1)取新鲜马铃薯(优选的，所用新鲜马铃薯为500克)切丁(优选I厘米见方的丁 )，放到盛有蒸馏水的烧杯(优选盛有800毫升蒸馏水的I升烧杯)中加热至沸腾后，自然冷却至室温，用尼龙网(优选200目的尼龙网)过滤得马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块；
(2)将Ca(NO3)2.4H20,Na2HPO4. 12H20、蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到I升，调节PH值至6. 8 (优选的，用盐酸或氢氧化钾调节pH值)；
(3)用三角瓶(优选500毫升的三角瓶)进行分装(优选的，各取200毫升培养基进行分装)为5瓶，每瓶加入琼脂3克，制作成固体培养基。一种青枯病菌培养基，液体，每I升培养基中,各组分及含量为500克新鲜马铃薯浸出液；Ca(NO3)2. 4H201. O克；Na2HPO4. 12Η20 2· O克;蛋白胨5· O克;酵母浸出物I克；鹿糖15克。所述的青枯病菌培养基，pH值6. 8。前面所述青枯病菌培养基的制备方法，步骤如下
(1)取新鲜马铃薯(优选的，所用新鲜马铃薯为500克)切丁(优选I厘米见方的丁 )，放到盛有蒸馏水的烧杯(优选盛有800毫升蒸馏水的I升烧杯)中加热至沸腾后，自然冷却至室温，用尼龙网(优选200目的尼龙网)过滤得马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块；
(2)将Ca(NO3)2.4H20,Na2HPO4. 12H20、蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到I升，调节PH值至6. 8 (优选的，用盐酸或氢氧化钾调节pH值)；
(3)用三角瓶(优选500毫升的三角瓶)进行分装(优选的，各取200毫升培养基进行分 装)为5瓶。本发明还提供了一种青枯病菌电激感受态细胞的制备方法，步骤如下
(1)将权利要求1或2所述固体培养基、权利要求4或5所述液体培养基、培养皿、10%甘油500毫升、10毫升离心管、50毫升离心管、1. 5毫升离心管高温灭菌，灭菌结束后，放到无菌超净工作台备用；
(2)取出青枯病菌菌株在固体培养基上划线，30°C培养48小时；
(3)挑取2个单菌落，分别加入到盛有I毫升液体培养基的10毫升离心管中，在水浴摇床中以30°C 260rpm进行培养6小时；
(4)将培养的I毫升菌液加入到200毫升的液体培养基中，在水浴摇床中以30°C300rpm进行培养，10小时后用可见光分光光度计监测550纳米下吸光值0D550，等到吸光值0D550为O. 57时立刻把三角瓶从水浴中取出，放到冰水混合物中进行冷却约15分钟；
(5)将冷却的菌液分装到50毫升离心管中，4°C2400g离心10分钟；
(6)弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体。(7)4°C 2400g离心10分钟，弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体；
(8)4°C 2400g离心10分钟，弃掉上清液，加入I毫升10%预冷的甘油，重新悬浮菌体，分装到1. 5毫升离心管中，每个离心管分装50微升，置超低温冰箱中保存待用。前面所述的制备方法，优选的方案是，步骤(I)的灭菌条件为121°C，15分钟。前面所述的制备方法，优选的方案是，步骤(8)超低温冰箱温度为_80°C。本发明的解决方案是基于细菌细胞通过特殊培养及理化方法进行处理后使细胞处于容易吸收外源DNA的状态，本发明通过培养基配方调整及在细胞培养过程中通过物理方法进行特殊处理使制备的感受态细胞具备较高的转化效率。本发明与现有的氯化钙热激感受态制备相比，具有以下优点
(I)感受态电激转化效率高，可达到IXlO9 cuf/mg pUC18 DNA。(2)使用同等体积的液体培养基制备感受态，此方法制备的感受态细胞量多，一次制备可够多次使用。原因是OD55tl为O. 57时才进行制备，而氯化钙热激制备是在OD55tl为O. 4时就进行制备。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例一种青枯病菌培养基及青枯病菌电激感受态细胞的制备方法。一、青枯病菌培养基由下列原料配制而成(I升培养基，pH值6. 8)
新鲜马铃薯 500克； Ca(NO3)2. 4H201. O克；
Na2HPO4. 12H20 2· O 克； 蛋白胨5· O 克；
酵母浸出物 I克； 蔗糖15克；
琼脂15克(固体培养基使用；液体培养基不使用)
二、青枯病菌培养基的制备方法
(I)将新鲜马铃薯500克切成I厘米见方的丁，如何放到盛有800毫升蒸馏水的I升烧杯中放在微波炉中加入至沸腾后，自然冷却至室温。用200目的尼龙网过滤马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块。(2)将 Ca(NO3)2. 4H201. O 克、Na2HPO4. 12Η20 2. O 克、蛋白胨 5. O 克、酵母浸出物 I克、蔗糖15克依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到I升，用盐酸或氢氧化钾调节pH值至6. 8。用500毫升的三角瓶各取200毫升培养基进行分装，其中I瓶加入3克琼脂，制作成固体培养基；其余四瓶为液体培养基。三、青枯病菌电激感受态细胞的制备方法
(3)由上述配制固体培养基、液体培养基、培养皿、10%甘油500毫升、10毫升离心管、50毫升离心管、1. 5毫升离心管等实验所需物品高温灭菌，灭菌条件为121°C 15分钟。灭菌结束后，放到无菌超净工作台备用。(4)取出青枯病菌菌株在固体培养基上划线，30°C培养48小时。(5)挑取2个单菌落，分别加入到盛有I毫升液体培养基的10毫升离心管中，在水浴摇床中以30°C 260rpm进行培养6小时。(6)将培养的I毫升菌液加入到200毫升的液体培养基中，，在水浴摇床中以30°C300rpm进行培养，10小时后用可见光分光光度计监测550纳米下吸光值(OD55tl),等到吸光值为O. 57时立刻把三角瓶从水浴中取出，放到冰水混合物中进行冷却约15分钟。(7)将冷却的菌液分装到50毫升离心管中，4°C 2400g离心10分钟。(8)弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体。(9)4°C 2400g离心10分钟。弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体。(10) 40C 2400g离心10分钟。弃掉上清液，加入I毫升10%预冷的甘油，重新悬浮菌体，分装到1. 5毫升离心管中，每个离心管分装50微升，置超低温冰箱中(-80°c)保存待用。本专利申请基于2项山东省自然科学基金资助(I)项目名称利用比较基因组学发掘马铃薯青枯病菌致病因子；项目编号ZR2010CQ205 ;执行年限2010. 11-2013. 11 ；
(2)项目名称马铃薯青枯病菌突变体文库构建及致病相关基因的克隆；项目编号ZR2012CL16 ;执行年限 2012. 12-2015. 12。
权利要求
1.一种青枯病菌培养基，其特征是，固体，每I升培养基中，各组分及含量为500克新鲜马铃薯浸出液;Ca(NO3)2. 4H201. O克；Na2HPO4. 12Η20 2. O克;蛋白胨5. O克;酵母浸出物 I克；鹿糖15克；琼脂15克。
2.根据权利要求1所述的青枯病菌培养基，其特征是，pH值6.8。
3.根据权利要求1或2所述青枯病菌培养基的制备方法，其特征是，步骤如下(1)取新鲜马铃薯(优选的，所用新鲜马铃薯为500克)切丁(优选I厘米见方的丁)，放到盛有蒸馏水的烧杯(优选盛有800毫升蒸馏水的I升烧杯)中加热至沸腾后，自然冷却至室温，用尼龙网(优选200目的尼龙网)过滤得马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块；(2)将Ca(NO3)2.4H20,Na2HPO4. 12H20、蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到I升，调节PH值至6. 8 (优选的，用盐酸或氢氧化钾调节pH值)；(3)用三角瓶(优选500毫升的三角瓶)进行分装(优选的，各取200毫升培养基进行分装)为5瓶，每瓶加入琼脂3克，制作成固体培养基。
4.一种青枯病菌培养基，其特征是，液体，每I升培养基中，各组分及含量为500克新鲜马铃薯浸出液;Ca(NO3)2. 4H201. O克；Na2HPO4. 12Η20 2. O克;蛋白胨5. O克;酵母浸出物I克；鹿糖15克。
5.根据权利要求3所述的青枯病菌培养基，其特征是，pH值6.8。
6.根据权利要求4或5所述青枯病菌培养基的制备方法，其特征是，步骤如下(1)取新鲜马铃薯(优选的，所用新鲜马铃薯为500克)切丁(优选I厘米见方的丁)，放到盛有蒸馏水的烧杯(优选盛有800毫升蒸馏水的I升烧杯)中加热至沸腾后，自然冷却至室温，用尼龙网(优选200目的尼龙网)过滤得马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块；(2)将Ca(N03)2.4H20,Na2HP04. 12H20、蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到I升，调节PH值至6. 8 (优选的，用盐酸或氢氧化钾调节pH值)；(3)用三角瓶(优选500毫升的三角瓶)进行分装(优选的，各取200毫升培养基进行分装)为5瓶。
7.一种青枯病菌电激感受态细胞的制备方法，其特征是，步骤如下(1)将权利要求1或2所述固体培养基、权利要求4或5所述液体培养基、培养皿、10% 甘油500毫升、10毫升离心管、50毫升离心管、1. 5毫升离心管高温灭菌，灭菌结束后，放到无菌超净工作台备用；(2)取出青枯病菌菌株在固体培养基上划线，30°C培养48小时；(3)挑取2个单菌落，分别加入到盛有I毫升液体培养基的10毫升离心管中，在水浴摇床中以30°C 260rpm进行培养6小时；(4)将培养的I毫升菌液加入到200毫升的液体培养基中，在水浴摇床中以30°C 300rpm进行培养，10小时后用可见光分光光度计监测550纳米下吸光值0D550，等到吸光值0D550为O. 57时立刻把三角瓶从水浴中取出，放到冰水混合物中进行冷却约15分钟；(5)将冷却的菌液分装到50毫升离心管中，4°C2400g离心10分钟；(6)弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体；(7)4°C2400g离心10分钟，弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体；(8)4°C2400g离心10分钟，弃掉上清液，加入I毫升10%预冷的甘油，重新悬浮菌体，分装到1. 5毫升离心管中，每个离心管分装50微升，置超低温冰箱中保存待用。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是，步骤(I)的灭菌条件为121°C，15分钟。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是，步骤(8)超低温冰箱温度为_80°C。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种青枯病菌培养基及青枯病菌电激感受态细胞的制备方法，以便获得具备较高电激转化效率的青枯病菌感受态细胞。本发明的解决方案是基于细菌细胞通过特殊培养及理化方法进行处理后使细胞处于容易吸收外源DNA的状态，本发明通过培养基配方调整及在细胞培养过程中通过物理方法进行特殊处理使制备的感受态细胞具备较高的转化效率。
文档编号C12R1/01GK103013883SQ20121056687
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者樊颖伦, 吕山花 申请人:聊城大学