专利名称：一种快速筛选微生物絮凝剂产生菌的方法
技术领域：
本发明涉及微生物絮凝剂产生菌的筛选，尤其适用于快速、高效微生物培养产生微生物絮凝剂的方法。
背景技术：
随着水污染问题日益严重，水处理问题也变得越来越严峻，水处理的方法有吸附、化学氧化、电渗析、生化、离子交换等多种方法，其中絮凝法是一种较为有效且成本较低的预处理方法，已经被广泛应用于污水处理、食品生产和工业发酵等诸多领域。絮凝剂分两大类:一是以铝盐、铁盐及其共聚物为主的无机絮凝剂；二是以聚丙烯酰胺为主的合成高分子絮凝剂，该传统的絮凝剂具有一定的腐蚀性和毒性，容易形成二次污染，对人体健康有很大的危害，并且絮凝效果受水质水温条件影响较大。生物絮凝剂可称为第三代絮凝剂，是一种具有高效絮凝活性的微生物代谢产物或化学改性天然有机高分子絮凝剂，它是利用生物技术，通过微生物的发酵培养，从微生物代谢产物中提取、纯化而获得的新型水处理剂，其主要成分有蛋白质、多糖、脂类、纤维素、DNA及有絮凝活性的菌体。生物絮凝剂不仅使用范围广、用量少、成本较低，能自行降解，对环境不产生二次污染，而且处理效果高，可使一些难处理的高浓度废水得到絮凝。文献检索披露:①张志强筛选出的一种复合菌群I (BAFRT4+CYGS1)，在优化培养基条件下，对靛蓝印染废水的COD去除率和脱色率分别达79.2%和87.6% ;②王曙光从土壤中筛选出的一株产气杆菌能够产生絮凝效果较好且性能稳定的微生物絮凝剂；③陈月华等从活性污泥中分离得到的菌株的代谢产物能应用于处理印染废水中国的发明专利CN 101503709A提 供了一种利用地衣芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法；⑤发明专利CN1616358A提供了一种以秸杆菌作为絮凝剂菌种，经发酵培养产生絮凝剂的方法，但这些制备絮凝剂的方法都要经过菌株的初筛、复筛、菌种的分离鉴定、菌株的发酵培养等常规步骤，其过程复杂，步骤繁琐。尽管微生物絮凝剂的优势使其具有广阔的远景，不少专家学者也开展了对生物絮凝剂的研究，但目前为止，微生物絮凝剂在实际中并未得到推广应用，其中繁琐的培养筛选过程、较长的生长周期使实际生产的成本过高，是微生物絮凝剂难以推广的主要原因。优良的生产菌种通常是从不同环境样品中分离、纯化，再经过絮凝实验进一步筛选后得到，这个过程工作量大，周期长，筛选目标不确定，所以筛选效率低。本发明利用微生物间的相互代谢作用，通过微生物群落的富集和发酵培养，得到具有明显絮凝效果的微生物群落，再针对该群落分离得到高效絮凝菌株，并通过优化培养基成分，提高絮凝剂产量，所筛选微生物絮凝剂产生菌的周期短，效率高，针对性强，克服传统微生物筛选复杂，步骤繁琐的缺点，可降低生产成本，易于实现工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于:提供的快速筛选方法克服传统微生物絮凝剂产生菌筛选方法复杂、周期长、效率低的不足，实现对样品的快速、高效筛选。
本发明的目的是这样实现的:一种快速筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，按步骤实施:步骤I微生物的富集培养:取活性污泥水于烧杯中，静置沉淀lOmin，取上清液10ml，加入装有IOOml灭菌的LB液体培养基或PDA液体培养基或高氏一号液体培养基的250ml三角瓶中，在28_37°C，200rpm摇床中培养，富集菌液浓度为1.0CFU/ml ；其中PDA液体培养基:取新鲜土豆去皮，切成约2cm2的小块，放入1500ml的烧杯中煮沸30min，然后用4层纱布过滤，取其滤液加葡萄糖20g，在用蒸馏水补足至1000ml，121°C灭菌25min,得成品；其中高氏一号液体培养基:取可溶性淀粉20g、KN03 lg、NaCl 0.5g、K 2HP04 3H200.5g、MgSO4 7H20 0.5g、FeSO4 7H20 0.0lg，放入 1000ml 蒸馏水中，用 NaOH 调节 pH 7.6，温度121 °C以下，灭菌25min，得到；其中LB液体培养基:取蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 5g，放入1000ml蒸馏水中，用NaOH调节pH 7.0，121°C下灭菌25min，得成品；步骤2优化发酵培养液的制备:将可溶性淀粉 28-32g、K2HP04 4_6g、KH2P04 1.5-2.5g、酵母膏 3_5g、KN030.8-1.2g、NaCl 0.4-0.6g、MgSO4 7H20 0.4-0.6g、FeSO4 0.008-0.013g 依次放入 950_1050ml 蒸馏水的容器中，用NaOH调节pH为7.5-8.5、温度110_115°C下灭菌25_30min，得成品；步骤3微生物的发酵培养:将步骤I富集培养液按1-2:100的接种量接入步骤2优化发酵培养液中培养，温度25-30°C、时间30-40h、摇床转速100-200rpm;培养液离心后取上清2ml，加入IOOml废水，测定絮凝率；其絮凝剂主要成分是多糖，是菌种生长过程中的代谢分泌物；步骤4菌种的分离纯化:选高絮凝效果的发酵液用无菌水稀释，制成不同梯度的稀释菌液，取0.1ml各梯度的稀释菌液涂布在LB固体培养基、PDA固体培养基和高氏一号固体培养基上，在28-37°C静置培养，待长出单菌落后，挑取单菌落再经28-37°C、200rpm摇床培养，浓度达到1.0CFU/ml后按1.5:100的接种量接入发酵培养液，25-30°C，150rpm摇床培养30-40h测定其絮凝率，结果得产生絮凝剂的菌株，絮凝率达80-90% ；步骤5絮凝率的测定方法:称取4g高岭土溶于IOOOml蒸馏水中配置成4g/L的高岭土悬浮液，称取IgCaC I溶于IOOml蒸馏水中配置成1%的溶液；取IOOml高岭土悬浮液于250ml烧杯中，用NaOH调节pH7.0，加入2ml I %的CaCl溶液和2ml的发酵培养液，先快速搅拌2min再缓慢搅拌3min，静置IOmin后取上清液，用分光光度计在550nm处测定其吸光度，以加入发酵培养基的高岭土悬浮液做对照试验，絮凝率计算公式:絮凝率=(A-B) /AX 100% ;其中A为对照上清液在550nm处的吸光度；B为加入发酵液的样品上清液在550nm处的吸光度。本发明的机理与作用:微生物产生的絮凝剂主要成分为糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等，是一种在微生物培养过程中产生的代谢产物，可以由一种或多种微生物培养得到，其产量和絮凝效果不但受絮凝剂产生菌培养条件的影响，还与絮凝剂分离提纯的方法有关，本发明利用微生物间的相互代谢作用，通过微生物群落的富集和发酵培养，得到具有明显絮凝效果的微生物群落，再针对该群落分离得到高效絮凝菌株，并通过优化培养基成分，初始PH值、温度、培养时间和转速给出絮凝剂产生菌的最佳培养条件和提纯方法，缩短培养周期，提高絮凝剂产量。本发明的有益效果:对微生物培养的温度、时间、转速及发酵培养基成分进行了优化，得到的菌株絮凝效果更好，絮凝率达80%以上；微生物产生的絮凝剂成分经鉴定为多糖，无毒，在自然条件下可自行降解；该方法操作简单、快速，可实现大量样品的筛选，应用范围广，彰显技术进步。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明实施例1絮凝活性细菌的筛选:取污水处理厂活性污泥，经沉淀后取上清IOml加入装有100ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37°C，200rpm摇床培养48h至菌液浓度为1.0CFU/ml，按照1.5:100的接种量接入优化发酵培养液中，30°C，150rpm摇床培养30h，培养液离心后取上清2ml，加入IOOml石化废水中，测定絮凝率；经鉴定，絮凝剂成分主要是多糖，是菌种生长过程中的代谢分泌物。测得的具有高絮凝效果的发酵液用无菌水稀释，制成不同梯度的稀释菌液，取
0.1ml各梯度的稀释液涂布到LB固体培养基上，37°C静置培养24h后挑取单菌落进行划线分离直至菌落形态一致，单菌落再经过37°C，200rpm摇床培养48h，浓度达到1.0CFU/ml后按1.5:100的接种量接入发酵培养液，30°C，150rpm摇床培养30h测定其絮凝率，结果得到2株产生絮凝剂的菌株，絮凝率达81.2%。所用LB液体培养基由蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 5g放入1000ml蒸馏水中，用NaOH调节pH 7.0，121°C下灭菌25min得到，所用优化发酵液培养基由可溶性淀粉30g, K2HPO4 5g, KH2PO4 2g,酵母膏 4g, KNO3 lg, NaCl 0.5g, MgSO4 7H20 0.5g, FeSO40.0lg放入1000ml蒸馏水中，用NaOH调节pH 7.5，温度115°C下灭菌30min得到。絮凝率的测定方法:称取4g高岭土溶于IOOOml蒸馏水中配置成4g/L的高岭土悬浮液，称取Ig CaCl溶于IOOml蒸馏水中配置成1%的溶液；取IOOml高岭土悬浮液于250ml烧杯中，用NaOH调节pH7.0，加入2ml 1%的CaCl溶液和2ml的发酵培养液，先快速搅拌2min再缓慢搅拌3min，静置IOmin后取上清液，用分光光度计在550nm处测定其吸光度，以加入发酵培养基的高岭土悬浮液做对照试验，絮凝率计算公式:絮凝率=(A-B)/AX 100%A为对照上清液在550nm处的吸光度B为加入发酵液的样品上清液在550nm处的吸光度实施例2
絮凝活性酵母菌的筛选:取新鲜土豆去皮，切成约2cm2的小块，放入1500ml的烧杯中煮沸30min,然后用4层纱布过滤,取其滤液加葡萄糖20g,在用蒸懼水补足至1000ml,自然pH，121°C灭菌25min得到PDA液体培养基。取污水处理厂活性污泥，经沉淀后取上清IOml加入装有100ml PDA液体培养基的250ml三角瓶中，28°C，200rpm摇床培养72h至菌液浓度为1.0CFU/ml，按照1.5:100的接种量接入优化发酵培养液中，26°C，150rpm摇床培养35h，培养液离心后取上清2ml，加入IOOml乌石化废水中，测定絮凝率，经鉴定，絮凝剂成分主要是多糖，是菌种生长过程中的代谢分泌物。测得的具有高絮凝效果的发酵液用无菌水稀释，制成不同梯度的稀释菌液，取
0.1ml各梯度的稀释液涂布到PDA固体培养基上，28°C静置培养48h后挑取单菌落进行划线分离直至菌落形态一致，单菌落再经过28°C，200rpm摇床培养72h，浓度达到1.0CFU/ml后按1.5:100的接种量接入发酵培养液，26°C，150rpm摇床培养35h测定其絮凝率，结果得到I株产生絮凝剂的菌株，絮凝率达89%。实施例3絮凝活性放线菌的筛选:取污水处理厂活性污泥，经沉淀后取上清IOml加入装有IOOml高氏一号液体培养基的250ml三角瓶中，28°C，200rpm摇床培养6d至菌液浓度为
1.0CFU/ml，按照1.5:100的接种量接入优化发酵培养液中，28°C，150rpm摇床培养40h，培养液离心后取上清2ml，加入IOOml乌石化废水中，测定絮凝率；经鉴定，絮凝剂成分主要是多糖，是菌种生长过程中的代谢分泌物。测得的具有高絮凝效果的发酵液用无菌水稀释，制成不同梯度的稀释菌液，取0.1ml各梯度的稀释液涂布到PDA固体培养基上，28°C静置培养6d后挑取单菌落进行划线分离直至菌落形态一致，单菌落再经过28°C，200rpm摇床培养5d，浓度达到1.0CFU/ml后按1.5:100的接种量接入发酵培养液，28°C，150rpm摇床培养40h测定其絮凝率，结果得到I株产生絮凝剂的菌株，絮凝率达87.9%。所用高氏一号液体培 养基由可溶性淀粉20g，KNO3 lg, NaCl 0.5g, K2HPO4 3H20
0.5g, MgSO4 7H20 0.5g, FeSO4 7H20 0.0lg 放入 1000ml 蒸馏水中，用 NaOH 调节 pH 7.6，温度121 °C以下，灭菌25min得到。本方法选用的原料:可溶性淀粉厂家为天津市化学试剂三厂；K2HP04厂家为天津市河东区红岩试剂厂；kh2po4厂家为天津永晟精细化工有限公司；酵母膏厂家为北京奥博星生物技术有限责任公司；K2HP04 *3H20厂家为广州市润展化工有限公司；MgS04 *7H20厂家为天津市风船化学试剂科技有限公司；FeS04 7H20厂家为西安化学试剂厂；高岭土的厂家为山西大同金源高岭土有限责任公司；所用摇床型号为HZQ-Z。
权利要求
1.一种快速筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于:按步骤实施: 步骤I微生物的富集培养: 取活性污泥水于烧杯中，静置沉淀lOmin，取上清液IOml，加入装有IOOml灭菌的LB液体培养基或PDA液体培养基或高氏一号液体培养基的250ml三角瓶中，在28_37°C，200rpm摇床中培养，富集菌液浓度为1.0CFU/ml ； 其中PDA液体培养基:取新鲜土豆去皮，切成约2cm2的小块，放入1500ml的烧杯中煮沸30min，然后用4层纱布过滤，取其滤液加葡萄糖20g，在用蒸馏水补足至1000ml，121°C灭菌25min,得成品； 其中高氏一号液体培养基:取可溶性淀粉20g、KNO3 lg、NaCl 0.5g、K2HPO4 3H200.5g、MgSO4 *7H20 0.5g、FeSO4 *7H20 0.0lg，放入 1000ml 蒸馏水中，用 NaOH 调节 pH 7.6，温度121 °C以下，灭菌25min，得到； 其中LB液体培养基:取蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 5g，放入1000ml蒸馏水中，用NaOH调节pH 7.0，121°C下灭菌25min，得成品； 步骤2优化发酵培养液的制备:将可溶性淀粉 28-32g、K2HP04 4-6 g,KH2PO4 1.5-2.5g、酵母膏 3_5g、KN03 0.8-1.2g、NaCl 0.4-0.6g、MgSO4 *7H20 0.4-0.6g、FeSO4 0.008-0.013g 依次放入 950_1050ml 蒸馏水的容器中，用NaOH调节pH为7.5-8.5、温度110_115°C下灭菌25_30min，得成品； 步骤3微生物的发酵培养: 将步骤I富集培养液按1-2:100的接种量接入步骤2优化发酵培养液中培养，温度25-30°C、时间30-40h、 摇床转速100-200rpm;培养液离心后取上清2ml，加入IOOml废水，测定絮凝率；其絮凝剂主要成分是多糖，是菌种生长过程中的代谢分泌物； 步骤4菌种的分离纯化: 选高絮凝效果的发酵液用无菌水稀释，制成不同梯度的稀释菌液，取0.1ml各梯度的稀释菌液涂布在LB固体培养基、PDA固体培养基和高氏一号固体培养基上，在28-37°C静置培养，待长出单菌落后，挑取单菌落再经28-37°C、200rpm摇床培养，浓度达到1.0 CFU/ml后按1.5:100的接种量接入发酵培养液，25-30°C，150rpm摇床培养30_40h测定其絮凝率，结果得产生絮凝剂的菌株，絮凝率达80-90% ； 步骤5絮凝率的测定方法:称取4g高岭土溶于IOOOml蒸馏水中配置成4g/L的高岭土悬浮液，称取Ig CaCl溶于IOOml蒸馏水中配置成1%的溶液；取IOOml高岭土悬浮液于250ml烧杯中，用NaOH调节pH7.0，加入2ml 1%的CaCl溶液和2ml的发酵培养液，先快速搅拌2min再缓慢搅拌3min，静置IOmin后取上清液，用分光光度计在550nm处测定其吸光度，以加入发酵培养基的高岭土悬浮液做对照试验，絮凝率计算公式:絮凝率=(A-B) /AX 100% ;其中A为对照上清液在550nm处的吸光度；B为加入发酵液的样品上清液在550nm处的吸光度。
全文摘要
本发明提供的一种快速筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，包括微生物的富集培养，取活性污泥水于烧杯中，静置沉淀10min，取上清液10ml，加入装有100ml灭菌的LB液体培养基或PDA液体培养基或高氏一号液体培养基的250ml三角瓶中，在28-37℃，200rpm摇床中培养，富集菌液浓度为1.0CFU/ml；优化发酵培养液的制备，将可溶性淀粉28-32g、K2HPO4 4-6g、KH2PO41.5-2.5g、酵母膏3-5g、KNO30.8-1.2g、NaCl0.4-0.6g、MgSO4·7H2O0.4-0.6g、FeSO40.008-0.013g依次放入950-1050ml蒸馏水的容器中，用NaOH调节pH7.5-8.5、温度110-115℃下灭菌25-30min，即得；还包括微生物的发酵培养，菌种的分离纯化，絮凝率的测定。
文档编号C12N1/02GK103173378SQ201210567049
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者韦超英, 曾凡付, 王刚, 潘洪涛, 唐倩倩, 侯荣 申请人:新疆德蓝股份有限公司