专利名称：一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法。
背景技术：
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化 作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、萊、砷等重金属)等结合，而具有整合解毒作用。故谷胱甘肽(尤其是肝细胞内的谷胱甘肽)能参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。谷胱甘肽还能帮助保持正常的免疫系统的功能。
权利要求
1.一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，方法步骤包括I)谷胱甘肽氧化还原酶基因的PCR克隆，2)谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌构建，3)谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌诱导表达，4)谷胱甘肽氧化还原酶酶液获得，5)检测样品制备，6)反应催化体系构建，7)检测，8)计算谷胱甘肽浓度， 所述谷胱甘肽氧化还原酶基因为序列表中的SEQ IDl ； 所述谷胱甘肽氧化还原酶基因的PCR克隆为设计PCR引物I和引物2，利用PCR技术对序列 SEQ IDl 进行克隆，引物 I :5’ GCGGGATCCATGACTAAACACTATG3’，引物 2 :5’ GCGAAGCTTTTAACGCATTGTCACGA3’ ； 所述反应催化体系构建为反应体系包括谷胱甘肽氧化还原酶酶液I、含磷酸的缓冲溶液2、样品3 ； 所述检测为采用紫外可见分光光度计检测反应催化体系在340nm处的吸收值A的变化。
2.根据权利要求I所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化还原酶基因的PCR克隆为设计谷胱甘肽氧化还原酶基因GOR的引物，利用PCR技术克隆并回收得到谷胱甘肽氧化还原酶基因，设计的引物I为5’ GCGGGATCCATGACTAAACACTATG3’，引物I酶切位点为BamH I，设计的引物2为5’ GCGAAGCTITTAACGCAITGTCACGA3’，引物2酶切位点为Hind III，以大肠杆菌DH5 a基因组为模版，PCR扩增工艺条件为94° C预变性5min，94° C30s，56° Clmin，72° Clmin，扩增25 30个循环，最终延伸反应为72° ClOmin。
3.根据权利要求I或2所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌构建为获得的谷胱甘肽氧化还原酶基因GOR和表达载体pET28 a进行连接构建，得到重组表达质粒pET28 a -G0R,选取大肠杆菌为表达宿主，将重组表达质粒PET28 a -GOR导入宿主中，得到谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌诱导表达为将构建得到的谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌进行培养2 3h，利用异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG对培养了 2 3h的谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌菌液进行诱导，继续培养l(Tl4h，诱导表达完成。
5.根据权利要求3所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化还原酶酶液获得为离心收集完成诱导表达的谷胱甘肽氧化还原酶重组表达菌菌体，利用浓度为20mM，pH为7. 4的磷酸缓冲液对菌体进行清洗2 3次，并将菌体重悬于浓度为20mM，pH为7. 4的磷酸缓冲液中获得菌体重悬液，菌体和磷酸缓冲液的体积比为1:30飞0，利用超声破碎对菌体重悬液进行破碎，超声破碎条件为工作时间3s，间歇时间2s,功率80W，次数200，超声破碎后离心收集上清，获得谷胱甘肽氧化还原酶酶液。
6.根据权利要求3所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述反应催化体系构建为按顺序先后将谷胱甘肽氧化还原酶酶液I、含磷酸的缓冲溶液2、样品3加入到反应皿中，谷胱甘肽氧化还原酶酶液I、缓冲溶液2、样品3的体积比为300ul 2600ul : IOOul，缓冲溶液2的成分为20mM的K2HPO4溶液，得到反应催化体系。
7.根据权利要求4飞任一项所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述检测样品制备为采用组织破碎仪将需要检测的样品细胞进行组织破碎，细胞样品、直径为0. 2um的磁性、磷酸缓冲液按体积比1:3飞25^50的比例混合得到，混合液破碎条件为，破碎时间为5 8min，破碎功率为200W，破碎完后离心收集上清得到检测样品。
8.根据权利要求7所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述检测为将构建好的反应催化体系放入紫外可见分光光度计检测槽中，设置检测检测时间为2 3min，波长为340nm，利用移液枪将NADP+/NAD+4溶液加入反应催化体系中，并用移液枪吹打反应体系2 3次，启动紫外可见分光光度计检测功能，得到反应催化体系在340nm处的吸收值A变化曲线。
9.根据权利要求7所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述计算谷胱甘肽浓度为根据检测得到的反应催化体系在340nm处的吸收值A变化曲线，计算吸收值A在0. 25、. 75min内的变化速率，变化速率结合参照谷胱甘肽标准样品制作的标准曲线，计算出样品中的谷胱甘肽浓度。
10.根据权利要求8、任一项所述的一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，该检测方法应用于检测酿酒酵母细胞、粘红酵母细胞、毕赤酵母细胞、人体肝脏细胞、人体红细胞中的谷胱甘肽浓度。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测细胞中谷胱甘肽的方法，该方法的实现步骤包括谷胱甘肽氧化还原酶GOR的基因克隆获得；利用基因工程手段构建谷胱甘肽氧化还原酶GOR的表达重组菌BL21/pET28α-GOR；诱导重组菌表达出GOR酶，重组菌细胞破碎，获得谷胱甘肽氧化还原酶酶液；检测样品制备；催化反应体系构建；可见分光光度计检测反应体系在波长为340nm处的变化曲线；谷胱甘肽浓度计算。本发明可应用于真菌类细胞、真核类细胞中谷胱甘肽含量的检测，检测方法具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，灵敏度高，检测结构重复性高等优点。
文档编号C12N1/21GK102978276SQ201210568880
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者陈燕婷 申请人:陈燕婷