一种重组制癌肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组制癌肽的制备方法，根据肿瘤抑素的N-端74～98氨基酸功能肽(25个氨基酸)和185-191氨基酸功能肽(7个氨基酸)两个功能区与人IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；根据所设计的序列，设计并合成引物F1、F2、R1，以F2为模板，R1为引物进行延伸反应；以延伸反应产物为模板，F1、R1为引物进行PCR反应，得到大小为129bp的制癌肽基因OP。构建制癌肽重组表达质粒pET-SUMO-OP，将重组质粒pET-SUMO-OP进行原核表达，并进行SDS-PAGE鉴定；纯化重组融合蛋白，得到重组制癌肽，该肽具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用。
【专利说明】—种重组制癌肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术药物领域，尤其涉及一种重组制癌肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]最近有研究发现肿瘤干细胞除了高致瘤性之外，具有很强的迁移能力，并涉及肿瘤转移的形成。最初的微小转移灶发生在血管周围的微环境中，随后，其生长直至出现明显的临床症状需要多种复杂的肿瘤-间质相互作用。整合蛋白是细胞外基质蛋白的细胞表面受体，在包括信号传导、细胞粘附、细胞存活、增殖、迁移、血管形成和基因表达等很多生物行为中起重要作用。最近的研究表明，αν整合蛋白在CSCs中过表达。此外，与定型的起始前列腺癌祖细胞亚型相比，av整合蛋白在前列腺癌CSCs群中表达增高。给予人的a v-siRNA能够显著的抑制骨组织中前列腺癌移植瘤细胞生长，并诱导肿瘤细胞调亡。抗血管生成剂，如JF-10-81，一种喜树碱偶联物，可以减少α V β 3和α V β 5在前列腺癌PC3细胞系中的表达，同时可以阻碍体内肿瘤细胞在血管的粘附和血管生成。总之，抑制αν整合蛋白的功能是一种有希望的靶向CSCs治疗恶性肿瘤的策略。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种重组制癌肽的制备方法，旨在提供具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用的制癌肽。
[0004]本发明的目的在于提供一种重组制癌肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤:
[0005]步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；
[0006]步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物Fp F2, R1,以F2为模板，R1为引物进行延伸反应；
[0007]步骤三，以延伸反应产物为模板，F。R1为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定；
[0008]步骤四，回收PCR产物，构建重组pET-SUMO-OP表达质粒，并对重组pET_SUM0_0P表达质粒进行序列分析；
[0009]步骤五，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定；
[0010]步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。
[0011]进一步，在步骤一中，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，设计序列如下:
【权利要求】
1.一种重组制癌肽的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤: 步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计； 步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物Fp F2, R1,以F2为模板，R1为引物进行延伸反应； 步骤三，以延伸反应产物为模板，F1, R1为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定； 步骤四，回收PCR产物，构建重组pET-SUMO-OP表达质粒，并对重组pET-SUM0_0P表达质粒进行序列分析； 步骤五，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定； 步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤一中，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，设计序列。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，根据所设计的序列，设计并合成的三条引物。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，以F2为模板，R1为引物进行延伸反应的具体 过程为: 在无菌 PCR 管中加入以下试剂:5 μ L F2(10ymol/L),5yL R1 (10 μ mol/L)、16 μ LdNTP(10mmol/L)、10μ L 10 X 连接缓冲液、63 μ L H2O0 94°C孵育 30s，55°C温浴 lOmin，离心5s，加入 IyL Taq 酶，72°C 孵育 5min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三中，以延伸产物为模板，F1,R1为引物进行PCR反应的具体过程为: 在无菌PCR管中加入以下试剂:IyL延伸反应液、2 yL F1 (10 μ mol/L)、2 μ LR1 (10 μ mol/L) U μ L dNTP (10mmol/L)、5μ L 10XPCR缓冲液、Taq酶0.2 μ L，最后加双蒸水补足体积至 50 μ L。PCR 循环参数如下-MV 30s, 550C 30s, 72°C 30s, 35cycles, 72°C延伸IOrnin0 用无水乙醇沉淀DNA，12000rpmX IOmin离心，弃除上清液，再用70%乙醇洗涤2次，弃除残余乙醇，TE缓冲液溶解。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三中，产物鉴定的实现方法为: 称取0.75g琼脂糖，加入50mL I X TAE缓冲液； 微波炉加热使琼脂糖溶解，溶液冷却至60°C，加入溴化乙锭至终浓度为0.5 μ g/mL ； 装好电泳槽模具，将胶倒入其内，迅速在模具一侧安插梳子，等凝胶冷却凝固； 小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中； 加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面离于胶面Imm ； 取IyL DNA样品与适量Loading Buffer混匀后加入点样孔中，接通电泳槽和电泳仪的电源，电压调至94V ； 待指示剂迁移至2/3凝胶处，中止电泳； 将胶转移至紫外线透射仪下观察有条带后，再放置在凝胶成像系统上拍照。剩下DNA样品送往上海生物工程技术有限公司测序。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，回收PCR产物的具体过程为: 灌制I %的普通琼脂糖凝胶，在加样孔下方2cm处切一个约1X0.Scm2的小孔，用相应浓度的低熔点凝胶填充，16°C凝固； 在加样孔中加入100 μ L PCR产物后电泳，待样品进入低熔点凝胶中，在310nm的紫外灯下切取目的条带，放入到1.5mL Ep管中称重，按试剂盒说明回收目的DNA; 加 30 μ L Elution Buffer 入回收柱中 37°C静置 2min, 1000Orpm 离心 lmin, Ep 管中液体即为回收的DNA溶液。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤五中，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定的具体过程为: 1.用重组pET-SUMO-OP表达质粒转化BL21(DE3)，Kan筛选阳性克隆，挑取单个BL21 (DE3)阳性菌落，于20mL含50 μ g/mL Kan的LB培养基，37°C，180rpm过夜培养； 2.取200μ L过夜菌液转移至20mL含Kan的LB培养基，37°C，200rpm,培养2h左右至对数生长期； 3.加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L，28°C分别诱导2h、4h、6h、8h，各取1.5mL菌液，1000Orpm离心lmin,收集沉淀菌体； 4.各管加入50 μ L 2 X SDS-PAGE Loading Buffer 溶解沉淀； 5.然后100°C水浴中加热5min，1000Orpm离心10min，转移上清至另一Ep管中； 6.SDS-PAGE凝胶电泳: (1)准备玻璃板，依次用水、10%SDS、H20、乙醇和水冲洗，干燥；
(2)配制5mL 由 1.6mL H 2OU.7mL 30 % 聚丙烯酰胺、pH8.81.5mmol/L Tris、0.05mL10% SDS、0.05mL 10%过硫酸胺溶液、0.002mL TEMED构成12%分离胶溶液； (3)小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，轻轻在顶层加入水封闭； (4)凝胶聚合后，用去离子水洗凝胶上部数次，用吸水纸吸干凝胶顶端残层液体； (5)配制5%成层胶3mL，注入分离胶上端，插入梳子小心避免气泡，其中，5%成层胶由ddH20 2.lmL、30%聚丙烯酰胺 0.5mL、l.0mmoI/L ρΗ6.8 的 Tris0.38mLU0% SDS 0.03mL、10%过硫酸胺0.003mL构成； (6)成层胶聚合后，用去离子水冲洗梳孔，将凝胶放入电泳槽上，上下槽均加入电泳缓冲液，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔； (7).每个小孔中加入10μ L样品上清液后，电压60ν，电泳至浓缩和分离胶界面，120ν电泳至凝胶底端； (8).染色与脱色: 1)0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于IOOmL由甲醇:水:冰乙酸=45: 45: 10构成的溶液中，过滤备用； 2)染色液浸泡凝胶，脱色摇床缓慢旋转IOmin； 3)将凝胶用无染料的甲醇/冰乙酸溶液脱色，脱色摇床缓慢旋转2h，中间换液3-4次； 4)将脱色后的凝胶于凝胶成像分析系统上摄像分析。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，纯化重组融合蛋白的具体过程为: 将重组菌株菌液IOOmL诱导4h后,8000rpmX IOmin离心收集菌体,悬浮于ImL预冷的PBS溶液中，冰上超声破碎细胞10 X 30s，离心取上清液，其中，PBS溶液由150mmol/L NaCl,16mmol/L Na2HPO4、4mmoI/L ρΗ7.4 的 NaH2PO4 构成； 镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积为5mL，用PBS平衡2_5个床体积，流速为2mL/min ；将IOOmL细胞破碎液的上清液0.45 μ m滤膜过滤，上样，流速为lmL/min，用PBS再洗2-5个床体积,流速为2mL/min ； 用400mM咪唑的缓冲液3进行洗脱，流速为2mL/min，收集过柱液，即为纯化的目的蛋白溶液； 制癌肽氨基酸序列在蛋白质序列分析网站通过GARNIER方法分别预测其α螺旋含量(Hh)、β折叠(Ee), β转角(Tt)、无规则卷曲(Ce)的百分含量，结果如下:
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该制备方法所获得的重组制癌肽具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用。
【文档编号】C12N15/70GK103882026SQ201210591150
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月22日 优先权日:2012年12月22日
【发明者】曹建国, 全梅芳, 任凯群 申请人:湖南师范大学