抗病毒转基因蚕的制作方法

抗病毒转基因蚕的制作方法
【专利摘要】本文提供抗病毒转基因蚕及其生产方法。本文所公开的转基因蚕显示至少两种病毒基因的双链RNA的同步组成型表达。本发明所述的转基因蚕通过RNA干扰(RNAi)介导的杆状病毒的病毒基因的抑制来生产。
【专利说明】抗病毒转基因蚕
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用RNA干扰(RNAi)来抑制转基因昆虫,家蚕(Bombyx mori L.)中的杆状病毒感染(baculoviral infection)。通过基于PiggyBac转座子的载体,我们获得了18株组成型生产针对四种必需病毒基因，即立早基因(immediate early)-1 (ie_l)、迟效因子基因(late effector factors) (lefl和3)和p74的双链RNA的转基因蚕纯合子系。
【背景技术】
[0002]家蚕(Bombyx mori L)为具有显著经济价值的主要鳞翅目(Iepidopteran)昆虫，其也被认为是用于基因组分析的理想鳞翅目模型体系(Nagaraju J和Goldsmith MR(2002)Silkworm genomics-progress and prospects.Current Science83:415-425 ；NagarajuJ、Klimenko V 和 Couble P (2000)The silkworm Bombyx mori, a model genetic system.1n Encyclopedia of Genetics, ed.Reeves E.(Fitzroy Dearborn，London)，pp.219-239)。除了其用作经济昆虫和遗传工具以外，通过使用基于PiggyBac转座子的载体的成功的种系转基因而增加了香的工业应用(Tamura T，Thibert C，Royer C，Kanda T，AbrahamE，Kamba M，Komoto N，Thomas JLj Mauchamp B,Chavancy Gj Shirk P，Fraser Mj PrudhommeJC，Couble P，Toshiki T，Chantal T，Corinne R，Toshio K，Eappen A, Mari K，NatuoK，Jean-Luc T，Bernard M，Gerard C，Paul S，Malcolm Fj Jean-Claude P 和 PierreC(2000)Germline transformation of the silkworm Bombyx mori Lusing a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnologyl8:81-84)。这种鱗翅目昆虫为印度成千上万的农民提供生计，但由于病毒-家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus , BmNPV)所引起的严重杆状病毒疾病而影响了他们的收入。将近50%的作物损失是由杆状病毒引起的。在杆状病毒感染周期结束时产生的多角体病毒体的稳固性质帮助病毒感染广泛传播，特别是在夏季和炎热潮湿的季节。因此，对于稳定蚕茧作物和改善丝产量，反过来改善蚕丝业经济，当务之急是开发抗BmNPV蚕株。
[0003]BmNPV为感染节肢动物(主要是昆虫)的无脊椎动物的14个主要家族之一的杆状病毒科(Baculoviridae)的成员(van Regenmortel MHj Fauquet CM，BishopDHL, Carstens EB，Estes MKj Lemon SM，Maniloff Jj Mayo MAj McGeoch DJj Pringle CR和Wickner RB (2000)Seventh Report of the International Committee on Taxonomy ofViruses (Academic Press, San Diego, Wien New York.;Murphy FA，Fauquet CM, BishopDHL, Ghabrial SAj Jarvis AWj Martelli GPj Mayo MA 和 Summers MD (1995)Sixth Reportof the International Committee on Taxonomy of Virus.(Springer Verlagj Wien, NewYork)。与大多数杆状病毒类似，BmNPV为宿主特异性并对家蚕(Bombyx mori)N(BmN)细胞具高度感染性，但并不在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf21)细胞中复制(Kondo A 和 Maeda S(1991)Host range expansion by recombination of thebaculoviruses Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and Autographa californicanuclear polyhedrosis virus.Journal of Virology65:3625-3632)。当虫蜀(caterpillar)食用沉积在叶子上的为多面包涵体(PIB,也称作病毒源包含体(occlusion derivedvirus))的耐环境病毒颗粒时，所述抗病毒颗粒进入碱性中肠环境，释放游离的病毒体，游离的病毒体通过受体进入中肠细胞，此时紧接着发生杆状病毒的生命周期。在细胞内部，随着早期基因如立早基因-l(ie-l)、ie-2由宿主RNA聚合酶II从早期启动子转录，病毒基因开始瞬时转录(Huh NE 和 Weaver RF (1990a) Categorizing some early andlate transcripts directed by the Autographa californica nuclear polyhedrosisvirus.Journal of General Virology71:2195-2200) 0 随后其他迟效因子(Ief)表达，同时耐鹅膏覃碱的病毒RNA聚合酶引发极晚期基因的转录(Huh NE和Weaver RF (1990b)Identifying the RNA polymerases that synthesize specific transcripts ofthe Autographa californica nuclear polyhedrosis virus.Journal of GeneralViiOlogy71:195-201)。最后，细胞溶解及被感染幼虫的完全溶解使包被在多面被膜中的病毒体释放至环境中。与PIB相反，在细胞内部形成的无多面包覆的游离病毒(已知为芽殖病毒(Budded Virus)-BV)引发个体内感染。幼虫器官系统为杆状病毒穿过基膜并传播感染提供主要通道(Engelhard Ej Kam-Morgan Lj Washburn J和 Volkman L (1994) The insecttracheal system:A conduit for the systemic spread of Autographa californicamultiple nuclear polyhedrosis virus.Proceedings National Academy of SciencesUSA91:3224-3227)。
[0004]通过使用质粒DNA复制显示出，Ief基因如ie_l、lef-1、lef_2和lef_3对于复制是必不可少的(Lu A 和 Miller L(1995)The roles of eighteen baculoviruslate expression factor genes in transcription and DNA replication.Journal ofVirology 69:975-982)。杆状病毒立早_1 (ie_l)基因为病毒复制所需的5种必需基因之一(Lu A和Miller L(1995)The roles of eighteen baculovirus late expression factorgenes in transcription and DNA replication.Journal of Virology69:975-982;KoolM，Ahrens C，Goldbach R，Rohrmann G和Vlak J(1994)Identification of genes involvedin DNA replication of the Autographa californica baculovirus.ProceedingsNational Academy of Sciences USA91:11212-11216)。已提出 IE-1 活化包括 ie_2、39K 和p35 的早期基因的启动子(Ca`rson Dj Summers M 和 Guarino L(1991)Molecular analysisof a baculovirus regulatory gene.Virology 182:279-286;Guarino LA 和 SummersMD (1986)Functional mapping of a trans-activating gene required for expressionof a baculovirus delayed-early gene.Journal of Virology57:563—571;NissenMS 和 Friesen PD(1989)Molecular analysis of the transcriptional regulatoryregion of an early baculovirus gene.Journal of Virology63:493-503)并直接或间接参与晚期基因的表达(Passarelli A 和 Miller L(1993) Three baculovirus genesinvolved in late and very late gene expression:1e-1, ie_n，and lef-2.Journalof Virology67:2149-2158) 0对DNA复制至关重要的晚期表达因子之一是lef_l，一种参与晚期和极晚期基因表达的基因(Kool Mj Ahrens C，Goldbach Rj Rohrmann G和 Vlak J(1994)Identification of genes involved in DNA replication of theAutographa californica baculovirus.Proceedings National Academy of SciencesUSA91:11212-11216) o LEF-1 为对 DNA 复制起始至关重要的 DNA 引发酶(Isobe Rj KojimaK, Matsuyama T，Quan GX，Kanda T，Tamura T，Sahara K，Asano SI 和Bando H(2004)Use ofRNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms.Archives Virologyl49:1931-1940)。然而，RNAi介导的Ief-1单独敲除未显示出杆状病毒增殖的完全抑制(Isobe Rj Kojima K，Matsuyama Tj Quan GXj Kanda Tj Tamura Tj SaharaK，Asano SI和Bando H(2004)Use of RNAi technology to confer enhanced resistanceto BmNPV on transgenic silkworms.Archives Virologyl49:1931-1940)。
[0005]Lef-3基因是DNA复制必须的由杆状病毒编码的另一必需早期类基因(Lu A和 Miller L(1995)The roles of eighteen baculovirus late expression factorgenes in transcription and DNA replication.Journal of Virology69:975-982;KoolM，Ahrens C，Goldbach R，Rohrmann G和Vlak J (1994)Identification of genes involvedin DNA replication of the Autographa californica baculovirus.ProceedingsNational Academy of Sciences USA91:11212-11216;Li Yj A L Passarelli AL 和Miller LK(1993)Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3，abaculovirus gene involved in late and very late gene expression.Journal ofVirology67:5260-5268)。LEF-3为形成同三聚体的单链DNA结合蛋白(Wu Y和CarstensEB (1998)A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates thenuclear localization of the putative helicase P143.Virology247: 32-40)，介导假定的DNA螺旋酶P143 的核定位(Wu Y和 Carstens EB (1998) A baculovirus single-strandedDNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putativehelicase P143.Virology247:32-40, Chen Z 和 Carstens EB (2005)Identificationof domains in Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus lateexpression factor 3 required for nuclear transport of P143.Journal ofVirology79:10915-10922) o
[0006]P74为在ODV形式的病毒体中发现的包膜蛋白(Kuzio Jj Jaques R和FaulknerP(1989)Identification of p74，a gene essential for virulence of baculovirusocclusion bodies.Virologyl73:759-763) ；Faulkner Pj Kuzio Jj Williams GV 和 WilsonJA(1997)Analysis of P74，a PDV envelope protein of Autographa californicanucleopolyhedrovirus required for occlusion body infectivity in viv0.Journalof General Virology78:3091_310)，对于病毒毒性是至关重要的(Kuzio J，Jaques R和 Faulkner P(1989)Identification of p74，a gene essential for virulence ofbaculovirus occlusion bodies.Virologyl73:759-763)，但并不与 DNA 复制相关。其在杆状病毒的生命周期晚期转录，并被认为在口服接种期间辅助病毒体与中肠附着(Haas-Stapleton EJj Washburn JO 和 Volkman LE (2004)P74mediates specific bindingof Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus occlusion-derivedvirus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothisvirescens larvae.Journal of Virology78:6786-6791)。
[0007]RNA干扰(RNAi)是mRNA选择性破坏导致基因敲除的现象(Fire A，XuS，Montgomery M，Kostas S，Driver S 和 Mello C(1998)Potent and specific geneticinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature391:806-811) oRNAi目前被认为是传统的抗病毒策略(Lindenbach B和Rice C (2002) RNAitargeting an animal virus:news from the front.Molecular Cel19:925-927;DownwardJ (2004) RNA interference.British Medical Journal 328:1245-1248)，其部分细胞机(cellular machine)还用于基因调控机制(Denli AM 和 Hannon GJ(2003) RNA1:anever-growing puzzle.Trends in Biochemical Sciences 28: 196—201;AgrawalNj Dasaradhi PVj Mohmmed A,Malhotra Pj Bhatnagar RK 和 Mukherjee SK (2003)RNA interference:biology, mechanism, and applications.Microbiology and MolecularBiology Review67:657-685)。RNAi已显示在包括蚕B.mori的许多节肢动物物种中起作用(Riu HLj Li W-X 和 Ding S-W(2004)RNA-based immunity in insects.1nSGM symposium63:Microbe - vector interactions in vector-borne diseases,ed.S.H.Gillespie, G.L S.A.0.(Cambridge University Press)pp.63-74)，并确认抑制草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)中 AcNPV 的增殖(Valdes VJj Sampieri A, SepulvedaJ 和 Vaca L (2003) Using double-stranded RNA to prevent in vitro and in vivoviral infections by recombinant baculovirus.Journal of Biological Chemistry278:19317-19324)，而靶向RNAi的单独的lef-1和单独的ie_l对于有效抑制家蚕中BmNPV生长并不有效(Isobe Rj Kojima K，Matsuyama Tj Quan GXj Kanda T，Tamura Tj SaharaK，Asano SI和Bando H(2004)Use of RNAi technology to confer enhanced resistanceto BmNPV on transgenic silkworms.Archives Virology 149:1931—1940;KanginakudruSj Royer C，EdupalIi SVjJalabert A，Mauchamp B，Chandrashekaraiahj PrasadSVj Chavancy G，Couble P 和 Nagaraju J (2007) Targeting ie-lgene by RNAi inducesbaculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenicsilkworms, Insect Molecular Biology 16:635-644)。

【发明内容】

[0008]本发明的一个方面涉及用于RNAi介导的抑制昆虫中的杆状病毒感染的短发夹RNA(shRNA)，其中所述shRNA包括RNA正义链，其中所述正义链包括选自由SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段；间隔子序列；和与该正义RNA链互补的反义RNA链。
[0009]本发明的另一方面涉及重组DNA构建体，其包括:
[0010]?具有 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸为反义方向并产生dsRNA分子；或
[0011]?包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链及其互补多核苷酸；或
[0012]?包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链，其互补多核苷酸，和间隔子多核苷酸序列；或
[0013].如本发明所公开的编码shRNA的多核苷酸
[0014]其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0015]本发明的另一方面还涉及抗杆状病毒的转基因昆虫的生产方法，其中所述方法包括用如本发明所公开的重组构建体转化昆虫，并选择对杆状病毒显示抗性的转基因昆虫。
[0016]本发明的另一方面还涉及表达如本发明所公开的短发夹RNA(ShRNA)或如本发明所公开的重组DNA构建体的抗杆状病毒的转基因昆虫。
[0017]本发明的另外的方面涉及表达如本发明所公开的短发夹RNA(ShRNA)或如本发明所公开的重组DNA构建体的抗杆状病毒转基因昆虫后代。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1 示出将基于 PiggyBac 的 RNAi 载体 pPiggy-正义-3XP3-GFP、pPiggy-反义-3XP3-DsRed2 和 pPiggy-多基因正-反(flip-flop)-3XP3_DsRed2 用于获得转基因蚕。左侧ITR和右侧ITR表示piggyBac转座元件的左和右末端反向重复序列。各构建体包括四种病毒基因，即 ie-1 (310bp)、Ief-1 (326bp)、lef-3 (316bp)、p74 (310bp)、标记基因gfp (800bp)和200bp SV40多聚腺苷酸化位点的片段。
[0019]A)pPiggy-正义-3XP3-GFP构建体(9677bp)，由受到遍在表达的蚕胞质肌动蛋白(A3)启动子支配的转录为正义链的四种病毒靶基因的片段构成。编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因受在复眼和其它神经组织中表达的3XP3启动子支配，用作标记基因来鉴定胚胎阶段和蛾阶段的转基因蚕。
[0020]B) pPiggy-反义-3XP3-DsRed2构建体(10097bp),由受到遍在表达的蚕胞质肌动蛋白(A3)启动子支配的转录为反义链的四种病毒靶基因的片段构成。编码红色荧光蛋白(DsRed2)的基因受在复眼和其它神经组织中表达的3XP3启动子支配，用作标记基因来鉴定晚期胚胎阶段和蛾阶 段的转基因蚕。
[0021]OpPiggy-多基因正-反-3XP3_DsRed2 构建体(12422bp)，携带被间隔子(323bp)分开的正义和反义方向的各杆状病毒必需基因的部分，由遍在表达的蚕胞质肌动蛋白(A3)启动子驱动。编码红色荧光蛋白(DsRed2)的基因受在复眼和其它神经组织中表达的3XP3启动子支配，用作标记基因来鉴定晚期胚胎阶段和蛾阶段的转基因蚕。
[0022]D)pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2构建体，携带被间隔子(323bp)分开的在无gfp片段的正义和反义方向的各杆状病毒必需基因(无gfp片段)的部分，由遍在表达的蚕胞质肌动蛋白(A3)启动子驱动。编码红色荧光蛋白(DsRed2)的基因受在复眼和其它神经组织中表达的3XP3启动子支配，用作标记基因来鉴定晚期胚胎阶段和蛾阶段的转基因蚕。
[0023]E)pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2构建体，携带被间隔子(323bp)分开的正义和反义方向的三种杆状病毒必需基因(无P74和gfp片段)中的每一个的部分，由遍在表达的蚕胞质肌动蛋白(A3)启动子驱动。编码红色荧光蛋白(DsRed2)的基因受在复眼和其它神经组织中表达的3XP3启动子支配，用作标记基因来鉴定晚期胚胎阶段和蛾阶段的转基因蚕。
[0024]图2示出蚕转基因体(transgenics)的分子特性。
[0025]A)转座元件展示(TED)法。
[0026]B)使用TED分析表征转基因系中转基因的拷贝数和插入位点。七种Nistari转基因系(170A、170B、164C、164B、154C、154D 和 118A)显示单拷贝插入。
[0027]C)介导piggyBac左臂的转基因整合的piggyBac所特有的特征序列(signaturesequence) TTAA的存在。piggyBac介导转位所特有的TTAA序列以红色示出。
[0028]D)在表达杆状病毒必需基因的dsRNA的不同转基因系中转基因绘制到染色体位置。
[0029]图3示出蚕的转基因和非转基因Nistari (NM)系中的BmNPV抗性。用BmNPVPlO-GFP以12000PIB/幼虫的剂量供给第四幼虫龄期。基于蛾出现的数目计算死亡率。柱(bar)表示标准偏差。TAFib6-表达非靶标dsRNA的转基因系；IE-1FF-带有单病毒基因靶标的转基因Nistari系；MFF-带有正义和反义方向表达的四种杆状病毒必需靶基因的转基因系；正义(ABS)-带有正义方向转录的四种病毒靶基因的片段的Nistari转基因系；反义(AS)-带有反义方向转录的四种病毒靶基因的片段的Nistari转基因系；和杂交体-正义XAS-通过正义和AS系杂交获得的转基因系。
[0030]图4示出BmNPV诱导纯系或转基因与非转基因(CSR2)系的杂交体的死亡率。死亡率在具有转基因的谱系中降低。柱表示标准偏差。TAFib6—表达非靶标dsRNA的转基因系；IE-1FF(E)-带有单病毒基因靶标的转基因Nistari系；多基因FF(MFF)-带有正义和反义方向表达的四种杆状病毒必需靶基因的转基因系；正义(ABS)-带有正义方向转录的四种病毒靶基因的片段的Nistari转基因系；反义(AS)-带有反义方向转录的四种病毒基因的片段的Nistari转基因系；和杂交体-正义XAS-通过正义和AS系杂交获得的转基因系。
[0031]图5示出多面包涵体(PIB)在不同转基因蚕中的滴度。与非转基因对照系相比，转基因系中的多面包涵体形成数目低得多。051?2-对照051?2系，匪-对照附8丨&1^系；IE-1FF(E)-带有单病毒基因靶标的转基因Nistari系；正义(ABS)-带有正义方向转录的四种病毒靶基因的片段的Nistari转基因系；反义(AS)-带有反义方向转录的四种病毒靶基因的片段的Nistari转基因系；杂交体(ABSXAS)-通过正义和反义谱系杂交获得的转基因系；和多基因FF(MFF)-带有正义和反义方向表达的四种杆状病毒必需靶基因的转基因Nistari 系。
[0032]图6示出四种杆状病毒基因ie-l、lef-l、lef_3和p74最初克隆至pCRII TOPO载体(Invitrogen)中。所得质粒标记为 Topo-1e-l、Topo-lef-l> Topo-lef-3 和 Topo_p74。通过限制性酶切和DNA测序确认具有正确插入的这些载体，稍后用于克隆步骤。
[0033]图1 示出构建 pPiggy 正义-3XP3-GFP、pPiggy 反义-3XP3_DsRed2 和 pPiggy 多基因正-反-3XP3-DsRed2中所涉及的各步骤。在本文中提供逐步描述。
[0034]本发明的目的
[0035]本发明的首要目的为生产显示耐病毒感染性改善的转基因蚕。
[0036]本发明的一个目的为精选早期杆状病毒增殖所必需的适当病毒基因。
[0037]本发明的另一目的为鉴定此类病毒基因的DNA片段。
[0038]本发明的另一目的为构建复合载体，所述复合载体携带在受到遍在活性启动子支配的正义和反义方向的所鉴定的必需病毒基因的DNA片段，从而确保转基因在所有组织中的表达。
[0039]本发明的另一目的还包括在启动子的调控下的适当可选择的标记基因，所述标记基因在早期或晚期胚胎阶段以及成虫阶段表达，从而使得容易筛选转基因世代(transgenic brood)。
[0040]再者，本发明的另一目的还为评价RNAi介导的必需多病毒基因的同时抑制以及其对转基因蚕中杆状病毒增殖的影响。
[0041]本发明进一步的目的为研究将转基因特性转移至转基因X非转基因蚕菌株的F1代杂交后代的可行性。
【具体实施方式】[0042]定义
[0043]如本说明书中所使用的，术语"反义"是指基因或该基因来源的核苷酸序列，其与本文所定义的靶基因具有大于50%、优选大于80%的同源性，并且以相对于靶基因的5’ -3’反方向连接至启动子。
[0044]如本说明书中所使用的，术语〃RNAi〃 (RNA干扰)是指通过导入和表达与全部或部分靶基因相对应的并产生双链RNA的序列而使靶基因的表达抑制，导致靶基因特异性基因沉默(抑制)。通常，此类RNAi序列包括线性排列的部分正义和反义DNA序列，其表达形成RNA干扰。
[0045]〃多核苷酸〃为包括多个聚合的核苷酸，如至少约15个连续聚合的核苷酸的核酸分子。多核苷酸可为核酸、寡核苷酸、核苷酸或其任意片段。在许多情况下，多核苷酸包括编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段的核苷酸序列。此外，多核苷酸可包括启动子、内含子、增强子区、多聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5’或3’非翻译区、报告基因或可选择标记等。多核苷酸可为单链或双链DNA或RNA。多核苷酸可选地包括修饰碱基或修饰主体。多核苷酸可为例如基因组DNA或RNA、转录本(如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆DNA、合成DNA或RNA等。多核苷酸可与糖类、脂类、蛋白质或其他材料结合来行使特定的活性，例如转化或形成有用的复合体如肽核酸(PNA)。多核苷酸可包括正义或反义方向的序列。"寡核苷酸"实质上等于术语扩增物、引物、低聚物、元件、靶标和探针，并优选为单链。
[0046]〃基因〃或〃基因序列〃是指基因的部分或完整的编码序列、其互补序列(complement)及其5’或3’非翻译区。基因还为遗传的功能单位，并且在物理方面为参与产生多肽链的DNA (或在RNA病毒的情况下为RNA)分子的核苷酸的特定片段或序列。后者可进行后续加工如化学修饰或折叠以获得功能性蛋白质或多肽。基因可为分离的、部分分离的或在生物体基因组中存在。举例来说，转录因子基因编码转录因子多肽，转录因子多肽可为功能性或需要加工以行使转录起始子的功能。
[0047]可操作地,基因可由顺反试验(cis-trans test)限定,顺反试验为确定两个突变是否发生于同一基因中并可用于确定遗传活性单位的界限的遗传试验。基因通常包括在编码区之前的区域(〃头〃；上游)和在编码区之后的区域(〃尾〃；下游)。基因还可包括称作"内含子"的插入的非编码序列，其位于称作“外显子”的单个编码片段之间。大多数基因具有相关联的启动子区、转录起始密码子的5’调控序列(某些基因不具有可辨别的启动子)。基因的功能还可受增强子、操纵子和其他调控元件的调节。
[0048]构建体:除非另有说明，否则术语“构建体”是指包括本发明的一种或多种分离的多核苷酸序列的重组遗传分子。
[0049]用于在宿主生物体中转基因表达的遗传构建体包括可操作地连接至开放阅读框的基因启动子序列以及可选地开放阅读框3’下游的基因终止序列。取决于所期望的基因序列的用途，开放阅读框可定位于正义或反义方向。构建体还可包括一种或多种可选择标记基因以及基因表达的其它调控元件。
[0050]载体:能够在宿主细胞中复制和/或可与另外的DNA片段可操作地连接来实现所附片段的复制的DNA分子。质粒、噬菌粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、病毒、YAC和BAC都是典型的载体。
[0051]术语〃载体〃是指用于将多核苷酸序列导入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。"载体"可包括除上述遗传构建体以外的遗传物质，如允许在一种或多种宿主细胞中复制的一种或多种核酸序列，例如本领域已知的复制起点、可选择标记基因和其他遗传元件(如，用于将遗传物质整合至宿主细胞基因组中的序列等)。
[0052]本发明提供通过同时靶向超过一种、优选两种、更优选三种、最优选四种病毒基因的RNA干扰(RNAi)介导的转基因蚕中杆状病毒增殖的抑制。本发明还提供抗杆状病毒的转基因蚕的生产方法，其中转基因蚕显示至少两种病毒基因、优选三种病毒基因、更优选四种病毒基因的双链RNA的同时表达。另外，本发明提供将病毒抗性转移至杂交蚕后代的方法。
[0053]本发明特别提供通过同时靶向超过一种、优选两种、更优选三种、最优选四种病毒基因的RNA干扰(RNAi)介导的在转基因蚕中的杆状病毒增殖的抑制，其中所述病毒基因选自由立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组。
[0054]本发明还提供抗杆状病毒的转基因蚕的生产方法，其中所述转基因蚕显示同时表达至少两种病毒基因、优选三种病毒基因、更优选四中病毒基因的双链RNA，其中所述病毒基因选自由立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组。
[0055]本发明进一步提供组成型并同时表达至少两种病毒基因、优选三种病毒基因、更优选四种病毒基因的双链RNA的转基因蚕及其后代，其中所述病毒基因选自由立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组。
[0056]另外，本发明提供将病毒抗性转移至杂交蚕后代的方法。
[0057]本发明还提供具有SEQ ID NO: 11所述核苷酸序列的立早-1基因(ie_l)、具有SEQID NO: 12中所述的核苷酸序列的迟效因子基因(lef-Ι)、具有SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的lef-3基因和具有SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的p74基因的多核苷酸。
[0058]本发明进一步提供间隔子的多核苷酸，其中所述间隔子的核苷酸为如SEQ IDNO: 15中所述。
[0059]在本研究中，我们选择ie-1、lef-1、lef_3和p74的多个必需病毒基因片段来生产双链RNA(dsRNA)并产生复合载体。我们将复合载体导入在转基因蚕的所有组织中均表达dsRNA的构建的转基因蚕。我们以如下方式制备该复合构建体，使所选基因的dsRNA在所有组织中受遍在活性启动子支配而表达并使标记基因在幼虫和成虫的眼细胞(复眼)中表达，从而使得容易筛选转基因个体。我们还成功地将转基因性质转移至F1代杂交后代。
[0060]根据本发明，在本发明的一个实施方案中，提供包括正义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因的多核苷酸和反义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1 >lef-3和p74基因的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。 [0061 ] 在本发明的一个实施方案中，提供包括至少两种选自由正义和反义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0062]在本发明的一个实施方案中，提供包括至少三种选自由正义和反义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0063]在本发明的另一实施方案中，提供包括正义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因Ief-1和lef-3的多核苷酸以及反义方向的立早_1基因(ie_l)、迟效因子基因Ief-1和lef-3的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0064]在本发明的另一实施方案中，提供包括正义方向的立早-1基因(ie-Ι)和迟效因子基因Ief-1的多核苷酸以及反义方向的立早-1基因(ie-Ι)和迟效因子基因Ief-1的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0065]在本发明的另一实施方案中，提供包括正义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因Ief-1和p74基因的多核苷酸以及反义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因Ief-1和p74基因的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0066]在本发明的另一实施方案中，提供包括正义方向的立早-1基因(ie-1)、lef-3和P74基因的多核苷酸以及反义方向的立早-1基因(ie-1)、lef-3和p74基因的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0067]在本发明的另一实施方案中，提供包括正义方向的立早-1基因(ie-Ι)和p74基因的多核苷酸以及反义方向 的立早-1基因(ie-Ι)和p74基因的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0068]在本发明的另外的实施方案中，提供抗杆状病毒的转基因蚕的生产方法，其中所述方法包括导入包括至少两种选自由正义和反义方向的立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组的多核苷酸的重组载体，其中正义和反义方向的多核苷酸被间隔子DNA分开。
[0069]在本发明的优选实施方案中，提供组成型并同时表达至少两种病毒基因的双链RNA的转基因蚕及其后代，其中所述病毒基因选自由立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因Ief-U lef-3和p74基因组成的组。
[0070]在本发明的另一实施方案中，提供组成型并同时表达至少三种病毒基因的双链RNA的转基因蚕及其后代，其中所述病毒基因选自由立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因Ief-U lef-3和p74基因组成的组。
[0071]在本发明的另一实施方案中，提供组成型并同时表达四种病毒基因的双链RNA的转基因蚕及其后代，其中所述病毒基因选自由立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因组成的组。
[0072]本发明中所公开的转基因蚕显示高水平的RNA干扰介导的对杆状病毒感染的抗性。
[0073]本发明的一个实施方案提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中shRNA包括RNA正义链、间隔子序列和与该正义RNA链互补的反义RNA链，其中所述正义链包括两种以上的选自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14组成的组的核苷酸序列的片段。[0074]本发明的另一实施方案提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中所述shRNA包括RNA正义链、间隔子序列和与该正义RNA链互补的反义RNA链，其中所述正义链包括两种以上的选自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ IDNO: 13和SEQ ID NO: 14组成的组的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
[0075]本发明的另一实施方案提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中shRNA包括RNA正义链、间隔子序列和与该正义RNA链互补的反义RNA链，其中所述正义链包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。 [0076]本发明的另一实施方案提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中所述正义链包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ IDNO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段，间隔子序列以及与该正义RNA链互补的反义RNA链。
[0077]本发明的另一实施方案提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中所述正义链包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ IDNO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段，间隔子序列以及与该正义RNA链互补的反义RNA链。
[0078]本发明的另一实施方案还提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中所述正义链包括SEQ ID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQID N0:13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段，间隔子序列以及与该正义RNA链互补的反义RNA链。
[0079]本发明的另一实施方案另外还提供用于RNAi介导的昆虫中的杆状病毒感染的抑制的短发夹RNA(shRNA)，其中所述正义链包括SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段，间隔子序列以及与该正义RNA链互补的反义RNA链。
[0080]本发明的另外的实施方案提供包括SEQ ID NO: 15中所述的间隔子序列的本发明的 shRNA。
[0081]本发明的另一实施方案提供一种重组DNA构建体,其包括
[0082]?具有 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸为反义方向并产生dsRNA分子；或
[0083]?包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链及其互补多核苷酸；或
[0084]?包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链，其互补多核苷酸和间隔子多核苷酸序列；或
[0085].如本发明所公开的编码shRNA的多核苷酸，
[0086]其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0087]本发明的另一实施方案还提供如本发明所公开的重组DNA构建体，其中所述启动子为组成型启动子如蚕胞质肌动蛋白(Bmactin)启动子或组织特异性启动子如Pax(3XP3)启动子。
[0088]如本发明所公开的重组DNA构建体包括两种启动子,一种启动子包括遍在表达的编码香胞质肌动蛋白蛋白(Bmactin)的基因的组成型启动子，和另一种为编码Pax蛋白(3XP3)的基因的组织特异性启动子。
[0089]本发明的一个实施方案提供宿主细胞，其中宿主细胞为大肠杆菌菌株一次性INVllO (Invitrogen),其为化学活性(chemically competent)菌株。
[0090]本发明的另一个实施方案还提供重组DNA构建体，其包括编码本发明的shRNA的多核苷酸，其中编码shRNA的多核苷酸包括
[0091]a.包括选自由 SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18 和 SEQ IDN0:19 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的正义链，
[0092]b.间隔子序列，和
[0093]c.与所述正义链互补的反义链。
[0094]如本发明所公开的重组DNA构建体进一步包括报告基因。
[0095]本发明的另外的实施方案提供包括编码短发夹RNA(ShRNA)的多核苷酸的重组载体，其中shRNA包括RNA正义链，间隔子序列，和与该正义RNA链互补的反义RNA链，其中所述正义链包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸。
[0096]本发明的另外的实施方案提供包括重组构建体的重组载体，其中所述重组构建体包括
[0097]?具有 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中多核苷酸为反义方向并产生dsRNA分子；或
[0098]?包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链及其互补多核苷酸；或
[0099]?包括选自由 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链，其互补多核苷酸，和间隔子多核苷酸序列；或
[0100].如本发明所公开的编码shRNA的多核苷酸，
[0101]其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
[0102]本发明的另一实施方案提供包括编码如本发明所公开的短发夹RNA(ShRNA)的多核苷酸或本发明的重组构建体或本发明的重组载体的宿主细胞。
[0103]本发明的另一实施方案提供宿主细胞，例如大肠杆菌或昆虫细胞如蚕。
[0104]本发明的另一实施方案还提供抗杆状病毒的转基因昆虫的生产方法，其中所述方法包括用本发明的重组构建体转化昆虫，和筛选对杆状病毒显示抗性的转基因昆虫。
[0105]本发明的另一实施方案还提供抗杆状病毒的转基因蚕的生产方法，其中所述方法包括用本发明的重组构建体转化蚕，和筛选对杆状病毒显示抗性的转基因蚕。
[0106]本发明的另一实施方案还提供抗杆状病毒的转基因家蚕的生产方法，其中所述方法包括用本发明的重组构建体转化家蚕，和筛选对杆状病毒显示抗性的转基因昆虫。
[0107]本发明的另一实施方案还提供抗杆状病毒的转基因家蚕的生产方法，其中所述方法包括用本发明的重组构建体转化家蚕，和筛选对杆状病毒显示抗性的转基因昆虫，其中所述蚕为家蚕Nistari菌株。
[0108]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的短发夹RNA(ShRNA)的杆状病毒抗性转基因昆虫。
[0109]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的重组DNA构建体的杆状病毒抗性转基因昆虫。
[0110]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的短发夹RNA(ShRNA)的杆状病毒抗性
转基因香。
[0111]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的重组DNA构建体的杆状病毒抗性转
基因香。
[0112]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的短发夹RNA(ShRNA)的杆状病毒抗性转基因昆虫后代。
[0113]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的重组DNA构建体的杆状病毒抗性转基因昆虫后代。
[0114]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的短发夹RNA(ShRNA)的杆状病毒抗性转基因蚕后代。
[0115]本发明的另外的实施方案提供表达本发明的重组DNA构建体的杆状病毒抗性转基因蚕后代。
`[0116]本发明具体提供通过RNAi和转基因生产具有高水平杆状病毒抗性的家养蚕株(strain)(家蚕)。通过构建基于piggyBac转座子的载体,我们获得了组成型产生抗四种杆状病毒基因即立早-1基因(ie-Ι)、迟效因子基因lef-1、lef-3和p74基因的双链RNA的转基因蚕的几种同源系。当与非转基因对照相比时，由转基因蚕中的低死亡率表明，这些同源种显示抑制家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染。病毒增殖的减少还通过蛋白质印迹分析和其他常规方法确认。该抗病毒性可成功地转移至转基因蚕种与非转基因家蚕种的F1代杂交后代。这些结果表明，我们已通过将同时靶向多种杆状病毒必需基因与蚕转基因结合而成功构建了具有高水平抗性的家蚕株。
[0117]已使用RNAi机理比较鳞翅目中杆状病毒感染的抑制结果。初步报告表明，通过瞬时RNAi介导靶向IE-1，使Sf9细胞系和草地贪夜蛾中的AcNPV增殖成功地接近完全抑制(Kanginakudru S，Royer C，Edupalli SV, Jalabert A, MauchampB, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P和Nagaraju J (2007)Targetingie-lgene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell linesand in the transgenic silkworms.1nsect Molecular Biology 16:635-644)。Isobe等人(Li Yj A L Passarelli AL 和 Miller LK(1993)Identification, sequence, andtranscriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and verylate gene expression.Journal of Virology67:5260-5268)报道了类似的观察，通过革巴向Ief-1基因在转基因蚕家蚕中观察到适度病毒抑制但并未完全保护。这些对比性结果可归因于靶基因的差异，因为已知靶基因/区域可决定RNAi介导的基因抑制的成功。鉴于获得可遗传的RNAi介导的杆状病毒抑制，我们开始研究通过靶向杆状病毒必需基因ie-1、Ief-U lef-3和p74来观察转基因蚕中杆状病毒的抑制效力。
[0118]为了获得转基因蚕，我们构建了携带选择标记3XP3-GFP和3XP3_DsRed、用于表达四种病毒基因的正义、反义和多基因正-反的双链RNA的DNA(图1)。由于3XP3-GFP选择标记基因在胚胎中表达，因此使得容易筛选早期发育时期的转基因蚕。另外，由3XP3-GFP表达的GFP局限于特定组织。我们利用3XP3-GFP构建体的这一性质促进两种转基因体的简便筛选以及杆状病毒感染进程。通过共注射产生dsRNA的质粒和辅助质粒至Nistari种新产的卵，我们获得了几种转基因蚕系。通过控制繁殖，我们获得了 18个纯合子转基因系，我们使用作为表达BmNPV的重组GFP的BmNPV-PlOGFP来测试它们的抗病毒活性。我们通过给药病毒并计算死亡率来测试经口感染。
[0119]我们的结果表明，不论感染途径如何，转基因蚕比非转基因蚕系更具有抗性。蛋白质印迹分析和显微观察确认，转基因体中的病毒增殖低于非转基因体。
[0120]总之，我们在这里示出了 RNAi介导的抗杆状病毒在鳞翅目中是可行的，特别侧重于家蚕B.mori,可通过piggyBac介导的种系转基因而成功生产具有用于RNAi介导的病毒感染抑制的转基因的家蚕的转基因种。可有趣地看出，其中可靶向不同杆状病毒必需基因的多基因靶向的效果。需要开发使用较好的通用启动子，特别是被杆状病毒活化的启动子作为双链靶RNA的驱动者。我们建议按照该方向进一步研究可教导我们使用RNAi作为用于杆状病毒感染抑制的工具。
[0121]在以下实施例的辅助下详细描述本发明。然而，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。[0122]实施例
[0123]应理解的是，此处所述的下列实施例仅为说明性目的，依照其的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是有所教导的，并且包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围内。
[0124]实施例1
[0125]载体
[0126]pPIG3XP3GFP-FF
[0127]载体PPIGA3GFP-FF在作为几乎通用的启动子的蚕胞质肌动蛋白启动子支配下表达绿色荧光蛋白(GFP)。受该启动子驱动的gfp遍在表达，因此尽管未整合，但包含载体的GO期胚胎或细胞发荧光，使得难以筛选转基因体。为了克服该问题，我们早期已研发了基于 3XP3 的载体(Kanginakudru S，Royer C，Edupalli SV, Jalabert A, MauchampB,Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P 和 Nagaraju J (2007)Targetingie~l gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell linesand in the transgenic silkworms.1nsect Molecular Biology 16:635-644)用于转基因，该载体携带有用于整合的PiggyBac元件的反向重复序列和受合成眼特异性启动子(3XP3)支配的GFP基因作为可选择的标记。该合成启动子在体内由Pax蛋白识别，并组织特异性地表达下游基因。通过将PPIGA3GFP-FF的A3GFP盒替换为Thomas等人(ThomasJL,Da Rocha M, Besse A, Mauchamp B和Chavancy G(2002)3xP3_EGFP marker facilitatesscreening for transgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stageonwards.1nsect Biochemistry Molecular Biology32:247-253)的 3XP3GFP 盒来构建质粒pPIG3XP3GFP-FF。为此，PCR扩增3XP3-GFP片段并克隆至TA载体中，将其在NgoMIV和SfiI位点之间限制性酶切并移到pPIGA3GFP-FF。再次通过选择性限制性酶切和测序来确认构建体 pPIG3XP3GFP-FF。
[0128]正义、反义和多基因正-反载体
[0129]为了获得具有病毒抗性的转基因蚕株，我们开始靶向多种必需病毒基因的工作。使用PiggyBac载体主体构建载体。这些构建体为pPiggy正义-3XP3-GFP、PPiggy反义-3XP3-DsRed2和pPiggy多基因正-反-3XP3_DsRed2。所用载体的图示示于图1。通过使用携带特异性限制性酶切位点的引物来扩增分别编码家蚕核型多角体病毒的立早I基因、晚期表达因子1、3和包膜蛋白的ie-1、lef-1、lef-3和p74基因和 pPIGA3GFP 的 gfp 基因的区域来构建载体(Tamura T, Thibert C，Royer C，KandaT, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P,FraserM, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki Τ, Chantal Τ, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc Τ, Bernard Μ, Gerard C，Paul S，Malcolm F, Jean-Claude P和PierreC(2000)Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnologyl8:81-84)。将扩增子克隆至 pCR IITopo载体(Invitrogen)的T-突出端(图6)。所得质粒标记为Topo-gfp、Topo-1e-l、Topo-lef-UTopo-lef-3和Topo-p74。通过限制性酶切和DNA测序来确认这些具有正确插入的载体。这些基因产生病毒特异性蛋白，并且不与已知的人或昆虫基因享有任何同源性。ie-1、lef-1、lef-3和ρ74的靶区域，对于ie-Ι基因为SEQ ID NO: 11中所述的141-450核苷酸位的核苷酸序列；对于Ief-1基因为SEQ ID NO: 12中所述的80-405核苷酸位的核苷酸序列；对于lef-3基因为SEQ ID NO: 13中所述的391-706核苷酸位的核苷酸序列；和对于P74基因为SEQ ID NO: 14中所述的1243-1552核苷酸位的核苷酸序列。
[0130]使用SEQ ID NO: 1-10 中所述的引物来 PCR 扩增 BmNPV 的 ie_l、lef-1、lef-3 和p74 以及 gfp 的 DNA0
[0131]典型的PCR反应由50μ I终体积组成，具有各自为25皮摩尔的正向和反向引物。在每个反应为 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3，包含 50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01% 明胶和0.01%曲拉通X-100)、ImM dNTP和5U Taq DNA聚合酶(NEB, US)中进行PCR扩增。在热循环机(PE9700, Applied Biosystems)中使用下列条件进行热循环:95°C初始变性5min ;95°C 30s ；50°C 30s和72°C 2min，35个循环，和72°C最终延伸IOmin0在2.0%琼脂糖凝胶中定量PCR产物，使用Qiagen PCR纯化柱根据制造商手册纯化。将纯化产物克隆至如上所述的Topo载体。
[0132]pTopo克隆一次性转化至INVl 10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)(由于其包含dam和dcm缺陷，允许dam-和dcm-敏感的限制性酶的限制性酶切。dam和dcm缺陷使得产生在这些位点未甲基化的DNA)。在包含40 μ I X-Gal (40mg/ml)和40 μ I异丙基β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，IOOmM)的LB琼脂板上进行蓝/白筛选。挑取白色菌落用于通过酶切的插入分析。挑选给出期望大小的正确插入的菌落。
[0133]对于DNA测序,在包含8 μ I现成的反应混合物(Ready reaction mix) (BigDye终止剂，BDTv3.0, Applied Biosystems, Foster City, CA)和 5 皮摩尔 M13 测序引物的测序反应中使用250ng质粒。所用循环条件如下:96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，25个循环。将样品乙醇沉淀，用70%乙醇洗漆并悬浮于H1-Di?甲酰胺(Applied Biosystems)中。在ABIPrism3100基因分析仪(Applied Biosystems)中进行测序并确认各基因片段的完整性。[0134]在下述一系列克隆步骤(图7)中获得构建体pPiggy正义-3XP3-GFP、pPiggy反义-3XP3-DsRed2 和 pPiggy 多基因正-反-3XP3_DsRed2:
[0135]1.使用 Sal1-NheI 位点将 lef_3 的 316bp 的片段(SEQ ID NO: 18)克隆至PA3DS-FSG载体主体(7624bp)中，以产生单基因构建体ρΑ3 Λ S-1ef3 (6057bp)。通过XmnI (lef-3的内部位点)限制性酶切和Xmnl/Scal双酶切来核实转化株。根据DNA strider图谱，XmnI酶切线性化为1-基因构建体的6.05kb片段，利用ScaI (主体中的位点)的双酶切释放323bp的产物或插入大小以及5.73kb的片段。
[0136]2.使用 BspE1-SalI 位点将 ie-Ι 的 310bp 的片段(SEQ ID NO: 16)克隆至口八3八5-16€3载体中，产生双基因构建体口么3八5-丨6116€356(592%口)。使用Xmnl/Hpal限制性体系在顺序酶切下核实转化株。2-基因构建体的Xmn I线性化产生5929bp的片段，XmnI/Hpa I顺序酶切产生期望的三条带，339bp、1071bp和4519bp的片段。
[0137]3.使用Pvu1-BamHI位点将gfp的800bp的片段克隆至ρΑ3 Δ S_iellef3载体主体，产生三基因构建体ρΑ3 Δ S-gfpiellef3 (6665bp)。在PvuI/EcoRI限制性分析下核实转化株，产生834bp的插入物和5834bp的主体。
[0138]4.使用 BspEI/BamHI 将 Ief-1 克隆的 326bp 的片段(SEQ ID NO: 17)加入ρΑ3 Δ S-gfpiellef3 载体主体，产生四基因产物 ρΑ3 Λ S-gfplef liellef3 (6650bp)。通过HpaI和NdeI限制性酶切以分别产生188bp、1410bp、5040bp期望长度的3个片段以及1361bp和5289bp期望长度的2个片段来确认转化株。
[0139]5.使用 Age1-XbaI 位点将 p74 的 310bp 的片段(SEQ ID NO: 19)克隆于ρΑ3 Λ S-gfplefl iellef3载体主体中，以产生五基因构建体ρΑ3 Δ S-gfpleliellef3p74 (6160bp) ?通过Sail限制性酶切确认转化株。其产生520bp插入物和5640bp主体。
[0140]用内部Nhe1-XbaI位点酶切五基因正义取向的构建体pA3AS-gfplefliellef3p74，产生正义和反义取向的五基因的片段池。筛选反义取向质粒的转化株。这通过HindIII/XmnI酶切确认，其中反义菌落产生1.3kb的片段，而正义取向的菌落产生2.2kb的片段。
[0141]正义构建体-使用BglI1-NheI和BglI1-XbaI位点将A3:gfp融合的启动子以及四种基因和 Poly A 尾克隆至 pPiggyP25il2-(3XP3-GFP)TQ 中，产生 pPiggy-正义-3XP3-GFP载体(图1A)。
[0142]反义构建体-将如上所述获得的反义片段克隆至pPiggyP25il2-(3XP3-DsRed2)TQ,产生 pPiggy-反义-3XP3.DsRed2 载体(图 1B)。
[0143]6.多基因正-反构建体-使用BglI1-AgeI位点将上述A3:gfp融合启动子与四种基因一起克隆至pP25(sp*)DsRed载体主体中，产生含间隔子区域(SEQ ID N0:15)的正义片段，中间载体形式pP25(sp*)DsRed-A3AS正义-间隔子。
[0144]7.使用Sse83371-AflII位点将五种基因的反义片段克隆至中间形式的正义-间隔子载体主体，产生正-反形式的多基因构建体，PP25 (sp*) DsRed-A3 Λ S正义-间隔子-反义-Poly A 区。
[0145]8.用BglII和SfiI位点酶切中间穿梭载体pP25 (sp*)正义-间隔子-反义载体，产生正-反形式的插入物。使用Bglll/Sfil位点将该插入物克隆至 PiggyP25IL2-(3XP3-DsRed2)TQ，产生 pPiggyA3gfplefliellef3p74.间隔子.p741ef3ielleflgfp.3XP3_DsRed2 载体，其中 DsRed2 为选择标记基因(图 1C)。
[0146]因此，可根据载体的要求和功能构建包括编码本发明shRNA的多核苷酸的重组载体，其中编码shRNA的多核苷酸包括两种或更多种以不同顺序排列的核苷酸片段。
[0147]实施例2
[0148]豕香的种系转基因
[0149]基本上根据Tamura等人的方法进行种系转基因(Tamura T, Thibert C，RoyerC，Kanda T, Abraham E，Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, ShirkP, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P,Toshiki Τ,Chantal Τ,Corinne R, Toshio K, EappenA, Mari K, Natuo K, Jean-Luc Τ, Bernard Μ, Gerard C，Paul S，Malcolm F，Jean-Claude P和 Pierre C(2000)Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using apiggyBac transposon-derived vector.Nature Biotechnologyl8:81-84)。
[0150]对约1000个蚕卵显微注射I μ g/ μ I的pPiggy-正义-3XP3-GFP,和等摩尔比的辅助质粒。同样，其它构建体即，pPiggy-反义-3XP3-DsRed2和pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2也与辅助质粒一起注射至单独的卵，以产生不同系的转基因体。温育所得卵，并通过眼中荧光的表达来分析各构建体的整合。通过控制繁殖获得了 18个纯合子转基因蚕系。通过使用pPiggy-正义-3XP3-GFP、pPiggy-反义-3XP3_DsRed2和pPiggy-多基因正-反-3XP3-DsRed2获得的转基因系分别称为正义(S)系、反义(AS)系和多基因正-反(MFF)系。所得转基因系包括3个正义、2个反义、5个正义X反义杂交体和8个MFF。
[0151]实施例3
[0152]转基因体的分子特性
[0153]以如下所述表征含有产生四种杆状病毒必需基因的双链RNA的转基因的MFF转基因系的转基因插入位点、它们的拷贝数和它们在蚕基因组中的物理位置。
[0154]3.1转座元件展示(TED)法
[0155]根据van der Linden 和 Plasterk2004 (Van der Linden AM 和 PlasterkRH (2004)Shotgun cloning of transposon insertions in the genome ofCaenorhabditis elegans.Computational and Functional Genomics5:225-229)的改进方案，将转座元件展示(TED)法用于识别插入位点和插入物的拷贝数(图2A)。简言之，根据 Nagaraja 和 Nagarajul995 (Nagaraja GM 和 Nagaraju J (1995)Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using random arbitraryprimers.Electrophoresisl6:1633 - 1638)提取来自转基因系的基因组DNA并用Sau3A酶切。所得酶切的DNA连接至携带Sau3A突出端的载体盒(01 igo503和504)。使用设计于piggyBac转基因内部邻近左侧反向重复序列(LIR)的转座子特异性 LIR 外引物(SEQ ID NO:20-5，-CTCACGCGGTCGTTATAGTT)和 LIR 内引物(SEQ IDN0:21-5’-GGCGACTGAGATGTCCTAAA)以及 van der Linden 和 Plasterk 的连接子特异性 505和337NEW引物进行两轮PCR。使用MBI taq酶，使用LIR外引物和505引物进行第一轮PCR，使用LIR内引物和337NEW引物进行第二轮PCR。第二轮PCR后扩增子的期望大小为大于120bp，包括120bp的转基因部分和未知长度的基因组DNA。将来自第二次扩增步骤的PCR产物用于测序。第二次PCR反应后单一 PCR扩增产物的形成显示在转基因系中存在转基因的单拷贝插入(图2B)。将TED用于靶向piggyBac转座子的左臂。
[0156]3.2转基因在转基因系的不同染色体上的定位
[0157]为了确认插入位置，将PCR产物测序，并对整个家蚕基因组序列进行BLAST搜索。在所有转基因系中，发现转基因的基因组整合受PiggyBac的介导，由如图2C所示的PiggyBac介导的整合的特有序列TTAA特征的存在所证实。对蚕的序列的组装物理图谱(http://sRp.dna.affrc.r0.jp/KAIKO/)搜索这些序列，并确定各转基因系的染色体上转基因的染色体定位和相对位置(表1&图2D)。
[0158]表1:转基因的插入位置
[0159]
【权利要求】
1.一种短发夹RNA(ShRNA)，其用于RNAi介导的昆虫中杆状病毒感染的抑制，其中所述shRNA包括 a.RNA正义链，其中所述正义链包括选自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段， b.间隔子序列，和 c.反义RNA链，其与所述RNA正义链互补。
2.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述片段包括至少15个连续核苷酸。
3.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述正义RNA链包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
4.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述正义RNA链包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段。
5.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述正义RNA链包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
6.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述正义RNA链包括SEQID NO: 11中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
7.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述正义RNA链包括SEQID NO: 12中所述的核苷酸序列的片段、SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列的片段和SEQ ID NO: 14中所述的核苷酸序列的片段。
8.根据权利要求1所述的shRNA，其中所述间隔子序列为如SEQID NO: 15所述。
9.一种重组DNA构建体，其包括 a.具有SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所述的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸为反义方向且产生dsRNA分子；或 b.包括选自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDN0:14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链及其互补多核苷酸；或 c.包括选自由SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDN0:14 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的片段的多核苷酸的正义链，其互补多核苷酸和间隔子多核苷酸序列；或 d.编码根据权利要求1所述的shRNA的多核苷酸， 其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
10.根据权利要求9所述的重组DNA构建体，其中所述启动子为组成型启动子或组织特异性启动子。
11.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子为蚕胞质肌动蛋白(Bmactin)启动子。
12.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中所述组织特异性启动子为Pax (3XP3)启动子。
13.根据权利要求9所述的重组DNA构建体，其中所述编码shRNA的多核苷酸包括 a.包括选自由SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18 和 SEQ IDN0:19 组成的组的两种或更多种核苷酸序列的正义链， b.间隔子序列，和 c.与所述正义链互补的反义链。
14.根据权利要求9所述的重组DNA构建体，其进一步包括报告基因。
15.一种重组载体，其包括编码根据权利要求1所述的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸或根据权利要求9所述的重组构建体。
16.一种宿主细胞，其包括编码根据权利要求1所述的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸或根据权利要求9所述的重组构建体或根据权利要求15所述的重组载体。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或昆虫细胞。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述昆虫为蚕。
19.一种抗杆状病毒的转基因昆虫的生产方法，其中所述方法包括用根据权利要求9所述的重组构建体转化昆虫，和筛选显示对杆状病毒的抗性的转基因昆虫。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述昆虫为蚕。
21.根据权利要求20所述的方法，所述蚕为家蚕。
22.—种抗杆状病毒转基因昆虫，其表达根据权利要求1所述的短发夹RNA(shRNA)或根据权利要求9所述的重组DNA构建体。
23.一种抗杆状病毒转基因昆虫后代，其表达根据权利要求1所述的短发夹RNA(shRNA)或根据权利要求9所述的重组DNA构建体。
24.根据权利要求22所述的抗杆状病毒转基因昆虫或根据权利要求23所述的抗杆状病毒转基因昆虫后代，其中所述昆虫为蚕。
【文档编号】C12N15/79GK103687949SQ201280016995
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年2月3日 优先权日:2011年2月4日
【发明者】N·加瓦哥瓦达, S·凯恩吉娜库德鲁 申请人:N·加瓦哥瓦达