通过递送人工转录因子调节受体表达的制作方法

通过递送人工转录因子调节受体表达的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白。在具体的实例中，这些受体基因启动子调节内皮素受体A、内皮素受体B、Toll样受体4或高亲和力IgE受体的表达。指向内皮素A或B受体的人工转录因子用于治疗由内皮素调节的疾病，诸如心血管疾病和尤其是眼疾病，例如视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、黄斑水肿、视神经病变、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视网膜色素变性、Leber遗传性视神经病变等。指向Toll样受体4或IgE受体的人工转录因子分别用于治疗自身免疫病症等，和变应性病症。
【专利说明】通过递送人工转录因子调节受体表达
发明领域
[0001]本发明涉及人工转录因子，其包含融合至抑制或激活结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白，以及它们在治疗由特异性效应物与此类受体的结合所调节的疾病中的用途。
【背景技术】
[0002]提出人工转录因子(ATF)是用于调苄基因表达的有用工具(Sera T.，2009, AdvDrug Deliv Rev &1, 513-526)。许多天然存在的转录因子通过抑制或激活基因转录来影响表达，具有识别某一 DNA序列的复杂的特定结构域。如果技术人员意在修饰它们的特异性和一个或多个靶基因，则这使得它们对于操作而言是无吸引力的目标。然而，某一类转录因子含有几个所谓锌指(ZF)结构域，它们是模块化的，并因此使得它们可以进行遗传工程。锌指是几乎独立靶向三个DNA碱基对的短(30个氨基酸)DNA结合基序。含有几个此类锌指的蛋白因此能够识别更长的DNA序列。六聚锌指蛋白(ZFP )识别18个碱基对(bp )的DNA靶，其在整个人基因组中几乎是唯一的。最初认为是完全背景独立的，但更深入的分析显示对于锌指的某些背景特异性(KlugA.，2010, AnnuRevBiocheml^, 213-231)。突变在锌指识别表面中的某些氨基酸改变ZF模块的结合特异性产生对于大部分的5’-GNN-3’、5’-CNN-3’、5’ -ANN-3’和某些5’ -TNN-3’密码子的确定的ZF结构单元(例如所谓的Barbas模块，见Dreier B.，Barbas C.F.3rd 等，2005，JBiol Chem 280, 35588-35597)。尽管关于人工转录因子的早期工作集中于基于组合预先选择的锌指与已知的3 bp靶序列的合理设计，但意识到锌指的某一背景特异性需要产生大的锌指文库，其使用复杂方法诸如细菌或酵母单杂交、卩遼菌体展示、区室化核糖体展示(compartmentalized ribosome display)或使用FACS分析的体内选择来询问。
[0003]使用此类人工锌指蛋白，可以以高特异性靶向在人基因组内的DNA基因座。因此，这些锌指蛋白是将具有转录调节活性的蛋白结构域转运至特定启动子序列以产生目标基因表达的调节的理想工具。用于转录沉默的合适结构域是Kru印pel相关的结构域(KRAB)如N-末端(SEQ ID NO:1)或C-末端(SEQ ID NO: 2) KRAB结构域、Sin3相互作用结构域(SID, SEQ ID NO: 3)和ERF阻抑蛋白结构域(ERD，SEQ ID NO: 4)，而基因转录的激活通过单纯疱疹病毒VP16 (SEQ ID NO: 5)或VP64 (VP16的四聚体重复，SEQ ID NO: 6)结构域来完成(Beerli R.R.等，Proc Natl Acad Sci USA 95，14628-14633)。此外，考虑通过基因本体论 G0:0001071 (http://amigo, geneontology.0rg/cg1-bin/amigo/term_details?term=G0:0001071)确定的蛋白的转录活性结构域实现革巴蛋白的转录调节。
[0004]所有已知药物靶的很大百分比是受体分子，其被具有时常相当大的脱靶(off-target)活性的小分子药物的作用而刺激或阻断。此类受体的实例是组胺Hl受体或α和β肾上腺素受体，但通常是通过基因本体论G0:0004888和G0:0004930确定的蛋白。
[0005] 尽管由于特定特征的高保守性，小分子药物并非总能选择性靶向给定蛋白家族的某一成员，但如基于抗体的新药物所显示出的，生物制剂提供了巨大的特异性。然而，实际上所有生物制剂到目前为止均在细胞外起作用。
[0006]尤其是上文提及的人工转录因子将适合于以治疗上有用的方式影响基因转录。然而，此类因子向作用位点一细胞核一的递送并不容易实现，因而妨碍了治疗性人工转录因子方法的有效性，例如通过依赖于逆转录病毒递送具有该方法的所有缺点，诸如免疫原性和细胞转化的潜能(Lund C.V.等，2005，Mol Cell Biol 25，9082-9091)。
[0007]所谓的蛋白质转导结构域(PTD)显示促进蛋白经质膜易位至细胞溶胶/核质中。短肽诸如HIV来源的TAT肽(SEQ ID NO: 7)和其他显示出诱导不依赖于细胞类型的货物蛋白质的大胞饮摄取(ffadia J.S.etal.，2004，NatMed 10，310-315)。当到达细胞溶胶中时，此类融合蛋白显示出具有生物活性。有趣的是，在蛋白转导后，极可能是通过胞内蛋白伴侣的作用，即使错误折叠的蛋白也能够变得有功能。
[0008]血管活性内皮素系统在多种疾病的发病中起重要作用。内皮素一方面参与调节血液供给，并且另一方面是由低氧诱导的事件级联中的主要参与者。内皮素例如参与血脑或血视网膜屏障的破坏和参与新血管形成。此外，内皮素参与神经变性以及调节痛觉或甚至口渴感觉的阈值。内皮素还参与调节眼内压。
[0009]内皮素作用通过它的同族受体来介导，主要是内皮素受体A，其通常位于环绕血管的平滑肌细胞上。影响内皮素系统一全身地或局部地一是治疗许多疾病诸如蛛网膜下腔或脑出血所关注的。内皮素还影响多发性硬化的病程。内皮素是(肺动脉)高血压的原因，而且也是低动脉压、心肌病和雷诺综合征、变异型心绞痛和其他心血管疾病的原因。内皮素参与糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病变。在眼中，它还对青光眼性神经变性、视网膜静脉阻塞、巨细胞性关节炎、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、Morbus Leber、Susac综合征、眼内出血、视网膜前神经胶质增生和某些其他病理学病况起作用。
[0010]眼是精密器官，其强烈依赖于平衡的且充足的灌注以达到它的高需氧量。无法提供充足且稳定的供氧会引起局部缺血-再灌注损伤，导致神经胶质活化和神经元损害，如在患有渐进性疾病的青光眼患者中所观察到的，尽管其具有正常或标准化的眼内压。如在糖尿病性视网膜病变或湿性年龄相关性黄斑变性中显而易见的，不充足的血液供给还导致低氧，引起具有进一步视网膜损害潜能的失控的(run-away)新血管形成。眼组织灌注在复杂控制之下并且依赖于血压、眼内压以及调节血管直径的局部因子。此类局部因子例如提及的内皮素、具有强血管收缩活性的短肽。内皮素的三种同工型(ET-1、ET-2和ET-3)由内皮素转化酶从位于血管壁中的内皮细胞分泌的前体分子来产生。成熟ET的两个同族受体是已知的，ETRA和ETRB。尽管ETRA位于形成血管壁的平滑肌细胞中并促进血管收缩，但ETRB主要表达于内皮细胞中，并且通过促进一氧化氮的释放来使血管舒张，因而引起平滑肌松弛。ETRA和ETRB属于G蛋白偶联的七跨膜螺旋受体的大类。ET与ETRA或ETRB的结合导致G蛋白活化，因而引发胞内钙浓度的升高，并由此引起一大批的细胞反应。
[0011]药理学上影响ET系统可能证明在其中ET水平升高并且ET以有害形式起作用的病例中，诸如在视网膜静脉阻塞、青光眼性神经变性、视网膜色素变性、巨细胞性关节炎、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、多发性硬化、视神经炎、类风湿性关节炎、Susac综合征、辐射性视网膜病变、视网膜前神经胶质增生、纤维肌痛和糖尿病性视网膜病变过程中是有用的。为此目的，下调ETRA将有助于调节疾病结果。但在某些情况下，上调ETRA并因此对ET提高的敏感性可能是希望的，例如以促进在从角膜外伤或角膜溃疡恢复过程中的角膜伤口愈合。
[0012]此外,ETRB介导的信号传递例如在癌症干细胞维持和肿瘤生长过程中与病例生理学过程有关。此外，上调ETRB与青光眼性神经变性有关，而抑制ETRB则显示出在青光眼过程中起神经保护作用。此外，ETRB在炎症过程中被上调。因此，通过特异性人工转录因子药理学上调节ETRB将可用于治疗癌症，预防神经变性和调节炎症过程。
[0013]细菌细胞壁组分诸如脂多糖(LPS)在多种疾病的发病中起重要作用。体内存在LPS指向需要由免疫系统针对的细菌感染。由于LPS是革兰氏阴性细菌的一般组分，因此LPS构成了能够激活免疫系统的所谓的危险信号。LPS由Toll样受体4 (TLR4)所识别，所述Toll样受体4是参与识别多种危险信号或与细菌或病毒感染相关的病原体相关分子模式(PAMP)的Toll样受体的更大家族的成员。尽管识别LPS为危险信号是先天免疫的重要部分，但TLR4受体的过度刺激或延长的刺激与多种与慢性炎症有关的病理学病况相关。实例是多种肝疾病，诸如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、慢性乙型肝炎或丙型肝炎病毒(HCV)感染、和HIV-HCV共感染。其他与TLR4信号传递相关的疾病是类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、银屑病、克罗恩氏病、葡萄膜炎、接触镜相关性角膜炎和角膜炎症。此外，TLR4介导的信号传递参与癌症进展(cancer progression)和对化学疗法的抗性。
[0014]药理学上影响LPS识别和TLR4信号传递可能证明对于与由于TLR4的不恰当活化而导致的慢性炎症有关的疾病是有用的。因此，通过靶向TLR4启动子的特异性负调节的人工转录因子的作用来下调TLR4蛋白，会有助于通过破坏由LPS导致的慢性炎症的恶性循环来调节疾病结果。 [0015]免疫球蛋白同种型E(IgE)是适应性免疫系统的部分，并且同样参与针对感染以及致瘤性转化的保护。IgE通过位于肥大细胞和嗜碱细胞上的高亲和力IgE受体(FCERl)来结合。IgE与FCERl的结合及随后经称为变应原的特异性抗原交联这些复合体导致多种因子从肥大细胞和嗜碱细胞中释放，引起变应性应答。在这些因子中有组胺、白细胞三烯类、多种细胞因子以及溶菌酶、类胰蛋白酶或己糖胺酶。这些因子的释放与变应性疾病诸如变应性鼻炎、哮喘、湿疹和过敏反应相关。
[0016]发明概述
本发明涉及人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白，并且涉及包含此类人工转录因子的药物组合物。此外，本发明涉及此类人工转录因子用于调节细胞对外界刺激和对其他可溶性信号分子的反应的用途，以及在治疗由特异性效应物与此类受体的结合所调节的疾病中的用途。
[0017]在一个具体的实施方案中，受体基因启动子是内皮素受体A启动子。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及此类人工转录因子，其用于影响对内皮素的细胞应答，以降低或提高内皮素受体水平，并且用于治疗由内皮素调节的疾病，尤其用于治疗此类眼疾病。同样，本发明涉及治疗由内皮素调节的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子。
[0018]在另一个具体的实施方案中，本发明涉及人工转录因子中间体，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向内皮素受体A启动子的多指锌指蛋白。
[0019]在另一个具体的实施方案中，受体基因启动子是内皮素受体B启动子。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及此类人工转录因子，其用于影响对内皮素的细胞应答，以降低或提高内皮素受体B水平，并且用于治疗由内皮素调节的疾病，尤其用于治疗此类眼疾病。同样，本发明涉及治疗由内皮素调节的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子。
[0020]在另一个具体的实施方案中，本发明涉及人工转录因子中间体，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向内皮素受体B启动子的多指锌指蛋白。
[0021]在另一个具体的实施方案中，受体基因启动子是Toll样受体4启动子。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及此类人工转录因子，其用于影响对脂多糖的细胞应答，以降低或提高Toll样受体4水平，并且用于治疗由脂多糖调节的疾病，尤其用于治疗眼疾病。同样，本发明涉及治疗由脂多糖调节的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子。 [0022]在另一个具体的实施方案中，本发明涉及人工转录因子中间体，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向Toll样受体4启动子的多指锌指蛋白。
[0023]在另一个具体的实施方案中，受体基因启动子是高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基α启动子。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及此类人工转录因子，其用于影响对免疫球蛋白E (IgE)的细胞应答，以降低或提高高亲和力IgE受体水平，并且用于治疗由IgE调节的疾病，尤其用于治疗眼疾病。同样，本发明涉及治疗由IgE调节的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子。
[0024]在另一个具体的实施方案中，本发明涉及人工转录因子中间体，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基α启动子的多指锌指蛋白。
[0025]附图简述
图1:通过调节受体表达改变细胞敏感性
通过蛋白质转导结构域(PTD)诸如TAT或其他的作用将人工转录因子转运至细胞中，所述人工转录因子含有融合至抑制/激活结构域(RD=调节域)以及核定位序列(NLS)的特异性靶向受体基因(RG)启动子(P)的六聚锌指(ZF)蛋白。根据转录调节域，受体基因表达提高(+)或抑制(_)，分别产生增强的或减少的对受体(R1、R2或R3)激动剂(A)的细胞敏感性。
[0026]图2:人内皮素受体A (ETRA)启动子区
显示了含有假定的ETRA启动子的ETRA基因的5’非翻译区。突出显示的是转录起始(用+1标记)和人工转录因子潜在的15bp和18 bp靶位点(TS)(下划线表示并标记为TS-855、TS-555、TS-487、TS-447、TS-306、TS-230、TS-103、TS-37、TS+74)。
[0027]图3:人Toll样等体4 (TLR4)启动子区
显示了含有TLR4启动子的TLR4基因的5’区。突出显示的是转录起始(用+1标记)、第一外显子的起始密码子和可读框(粗体字母)和特异性人工转录因子潜在的18 bp靶位点(下划线表示并标记为TS-276、TS-55、TS+113)。
[0028]图4:高亲和力IgE等体A (FCERlA)启动子区显示了含有邻近的、组成型启动子的FCERlA基因的5’区。突出显示的是转录起始(用+1标记)、第一外显子的起始密码子和可读框(粗体字母)和特异性人工转录因子潜在的18bp靶位点(下划线表示并标记为TS-147和TS+17)。
[0029]图5:人内皮素受体B (ETRB)启动子区
显示了含有ETRB启动子的ETRB基因的5’区。突出显示的是翻译起始(用+1标记)和特异性人工转录因子潜在的18 bp靶位点(下划线表示并标记为TS-1149和TS-487)。由于报道了几个可变转录起始位点(AraiH.等，1993，JBiol Chem 268, 3463-70; TsutsumiM.等，1999，Gene 4, 43_9),选择翻译起始位点作为命名祀位点的参考点。
[0030]图6:人工转录闵子
A)将多种锌指蛋白克隆入三个不同质粒中。显示唯一的限制酶位点以突出多种表达质粒的模块设计。产生的DNA构建体编码以下融合蛋白:KRAB-NLS-6ZFP-3xmyc (SEQ ID NO:8)、SID-NLS-6ZFP-3xmyc、
NLS-6ZFP-GGSGGS (SEQ ID NO: 9)接头-KRAB A-3xmyc 和
NLS-6ZFP-GGSGGS 接头-VP64_3xmyc。
[0031]图7:通讨人工转录闵子A074A、A074E、A074R和A074V调节人内皮素等体A(ETRA)活性
(A)ETRA启动子驱 动的蛋白表达的人工转录因子依赖的阻抑。显示了表达指向ETRA启动子内的靶位点的A074A (SEQ ID NO: 10)、A074E (SEQ ID NO: 11)、A074R (SEQ ID NO: 12)和A074V (SEQ ID NO: 13)后的萤光素酶报道基因测定(RLuA =相对萤光素酶活性，相对于对照C，以％计)的结果。C =作为对照的黄色荧光蛋白(YFP)。
(B)A074Vp (SEQ ID NO: 14)，转导的A074V蛋白，相比于对照B (缓冲液处理的细胞)不抑制HeLa细胞增殖。RP =以对照的％计的相对增殖。
(C)A074Vp相比于对照B (缓冲液处理的细胞)不抑制人子宫平滑肌细胞(hUtSMC)的增殖。
(D)A074Vp阻断了 hUtSMC的ET-1依赖性收缩。将hUtSMC植入三维胶原网格。C =作为对照的用缓冲液处理的细胞。B =用缓冲液和ET-1处理的细胞。A074Vp =用A074Vp和ET-1处理的细胞。RLA=以对照C的％计的相对网格面积。细节描述于下文。
[0032]图8:通讨人工转录闵子A074Ra和A074Va驱动的ETRA启动子活件的增强
(A)激活人工转录因子A074Ra(SEQ ID NO: 15)和A074Va (SEQ ID NO: 16)表达后，ETRA启动子驱动的萤光素酶报道基因的表达升高。RLuA =相对萤光素酶活性，以相对于对照C(YFP)的％计。
(B)用A074Vap(SEQ ID NO: 17)处理并不抑制hUtSMCs细胞增殖。作为蛋白递送的A074Vp对hUtSMCs细胞没有毒性，并且并不负面影响细胞增殖。B =缓冲液处理的细胞。RP=以对照的％计的相对增殖。
[0033]图9:通讨A01149N和A01149P的人内皮素等体B (ETRB)启动子的阳.抑 在萤光素酶报道基因测定中，人工转录因子A01149N (SEQ ID NO: 18)和A01149P (SEQ
ID NO: 19)的表达相对于YFP (对照C)阻抑了 ETRB启动子活性。RLuA =相对萤光素酶活性，以相对于对照C的％计。
[0034]图10:通讨A055B和A055E的人Toll样等体4 (TLR4)活件的调节(A)在萤光素酶报道基因测定中，A055B(SEQ ID NO: 20)和A055E (SEQ ID NO: 21)的表达相对于YFP (对照C)阻断了 TLR4启动子活性。RLuA =相对萤光素酶活性，以相对于对照C的％计。
(B)在巨噬细胞样U937细胞中表达A055B后，TLR4依赖性的、LPS诱导的白细胞介素(IL) -6 的分泌变弱(blunted)。
(C)用A055Bp(SEQ ID NO: 22)处理并不抑制HeLa细胞增殖。RP =以对照的％计的相对增殖。B =缓冲液处理的细胞。RP =以对照的％计的相对增殖。
[0035]图11:高亲和力IgE等体通讨AOl47A调节
⑷A0147A (SEQ ID NO: 23)表达后，高亲和力IgE受体α亚基(FCERlA)启动子驱动的萤光素酶报道基因的表达在大鼠嗜碱RBL-2H3细胞中被抑制。RLuA =相对萤光素酶活性，以相对于对照C (YFP)的％计。
(B)A0147Ap (SEQ ID NO: 24)并不抑制HeLa细胞增殖。B =缓冲液处理的细胞。RP =以对照的％计的相对增殖。
C).用Α0147Αρ处理抑制人IgE与人嗜碱KU812F细胞的结合为80%左右。IgEB =使用人IgE和用FITC标记的小鼠抗人IgE通过流式细胞术测定的IgE对FCERl的结合能力，以相对于作为对照的缓冲液处理的细胞(B)的％计。 [0036]发明详述
本发明涉及人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白，并且涉及包含此类人工转录因子的药物组合物。
[0037]许多疾病的治疗基于调节细胞受体信号传递。实例是高血压(其中β阻断剂抑制β肾上腺素能受体的功能)、抑郁(其中5-羟色胺摄取阻断剂增加激动剂浓度和因此的5-羟色胺受体信号传递)、或青光眼(其中前列腺素类似物活化前列腺素受体，继而降低眼内压)。传统上，为了治疗目的，使用以受体激动剂或拮抗剂形式的小分子来影响受体信号传递。然而，细胞受体信号传递还能够被受体蛋白表达的直接调节所影响。
[0038]顺从于受体表达水平的直接调节的病理学过程例如为以下:患有由于先天性心脏病的充血性心力衰竭的患者将受益于β肾上腺素受体的上调，这是由于该受体在心肌中的下调与手术后心力衰竭风险相关。在帕金森氏病中，用多巴胺能药疗法的治疗抑制多巴胺受体的可利用性，因此，多巴胺受体的上调将改善多巴胺能药疗法的效力。在癫痫中，海马中大麻素受体表达不足涉及疾病病因学，因此，大麻素受体的上调将是癫痫患者的可行疗法。
[0039]对于由受体蛋白的单倍剂量不足引起的遗传疾病，诸如引起生长迟缓的胰岛素样生长因子I受体，但还有其他的，额外激活剩余的有功能的受体基因将有益于患者。此外并在其他中，病理性自身免疫的诱导和永续性(perpetuation)与从Toll样受体的不恰当信号传递相关联。因此，下调Toll样受体破坏多种自身免疫疾病的恶性循环。在变应性疾病中，通过高亲和力IgE受体防止IgE介导的信号传递用于操纵变应性反应。在癌症中，下调生长因子受体或上调胞外基质受体对于防止肿瘤进展是有利的。
[0040]在此类受体分子中的是来自所谓的七跨膜或G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白家族的蛋白，其特征在于将受体锚定在质膜中的七跨膜结构域和G蛋白依赖性信号级联放大。此类蛋白的实例是内皮素的受体A和B。其他受体蛋白经单跨膜区锚定，例如脂多糖的受体、Toll样受体4或多种细胞因子受体诸如IL-4受体。其他受体由多聚蛋白复合体组成，例如由α、β和Y链组成的IgE抗体的高亲和力受体，或者由α、β、Y、δ、ε和ζ链组成的T细胞受体。因此，在术语“受体分子”下包含的是来自不同蛋白家族具有非常不同的作用模式的蛋白。
[0041]本发明中考虑的受体是人受体分子，其由以下编码:
【权利要求】
1.人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白。
2.人工转录因子，其中受体基因启动子是内皮素受体A启动子。
3.人工转录因子，其中受体基因启动子是内皮素受体B启动子。
4.人工转录因子，其中受体基因启动子是Toll样受体4启动子。
5.人工转录因子，其中受体基因启动子是FCERlA启动子。
6.权利要求1、2、3、4或5的人工转录因子，其包含六聚锌指蛋白。
7.权利要求2、3、4或5的人工转录因子，其包含具有选自以下的蛋白序列的锌指蛋白:SEQ ID NO: 31 至 SEQ ID NO: 37,SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 43,SEQ ID NO: 45 至 SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:52,SEQ IDN0:54 至 SEQ ID NO:57,SEQ IDN0:59 至 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66 MSEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82 至 SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97 至 SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120至 SEQ ID NO: 136,SEQ ID NO: 138 至 SEQ ID NO: 143,SEQ ID NO: 145 至 SEQ ID NO: 153,SEQ IDNO: 155 至 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO: 166 至 SEQ ID NO: 173,SEQ ID NO: 175 至 SEQ ID NO: 181、和 SEQ ID NO: 183 至 SEQ ID NO: 191。
8.权利要求 2、3、4或5的人工转录因子，其包含具有选自以下蛋白序列的锌指蛋白:SEQ ID NO 56、83、85、101、114、118、127、133、140、142、146、147、156、159、175、和 181。
9.权利要求2、3、4或5的人工转录因子，其包含SEQID NO 118、133、156、或175的锌指蛋白。
10.权利要求1-9中任一项的人工转录因子，其中所述锌指蛋白融合至抑制蛋白结合域。
11.权利要求10的人工转录因子，其中所述抑制蛋白结构域是SEQID NO:1的N-末端KRAB, SEQ ID NO: 2 的 C-末端的 KRAB、SEQ ID NO: 3 的 SID、或 SEQ ID NO: 4 的 ERD。
12.权利要求1-9中任一项的人工转录因子，其中所述锌指蛋白融合至激活蛋白结合域。
13.权利要求12的人工转录因子，其中所述激活蛋白结构域是SEQID NO: 5的VP16或SEQ ID NO: 6 的 VP64。
14.权利要求1-13中任一项的人工转录因子，其中所述核定位序列是含有K-K/R-X-K/R共有序列的碱性氨基酸簇或SEQ ID NO: 196的SV40 NLS。
15.权利要求1-14中任一项的人工转录因子，其中所述蛋白质转导结构域是SEQIDNO: 7 的 HIV 衍生的 TAT 肽、HSV-1 VP22 肽、SEQ ID NO: 192 的合成肽 mT02、SEQ ID NO: 193的合成肽mT03、SEQ ID NO: 194的R9肽、ANTP结构域、或保护性抗原/致死因子N末端PTD。
16.人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向内皮素受体A启动子的多指锌指蛋白。
17.人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向内皮素受体B启动子的多指锌指蛋白。
18.人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向Toll样受体4启动子的多指锌指蛋白。
19.人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域和核定位序列的特异性靶向FCERlA启动子的多指锌指蛋白。
20.药物组合物，其包含权利要求1-19的人工转录因子。
21.权利要求1-19的人工转录因子，其用于调节细胞对外界刺激和对其他可溶性信号分子的反应。
22.权利要求1-19的人工转录因子，其用于治疗由特异性效应物与受体的结合所调节的疾病，为此所述多指锌指蛋白特异性靶向所述受体基因启动子。
23.权利要求2或6-16的人工转录因子，其用于影响对内皮素的细胞应答，以降低或提高内皮素受体A水平，并且用于治疗由内皮素调节的疾病。
24.权利要求3、6-15或17的人工转录因子，其用于影响对内皮素的细胞应答，以降低或提高内皮素受体B水平，并且用于治疗由内皮素调节的疾病。
25.权利要求4、6-15或18的人工转录因子，其用于影响对脂多糖的细胞应答，以降低或提高Toll样受体4水平，并且用于治疗由脂多糖调节的疾病。
26.权利要求5-15或19的人工转录因子，其用于影响对IgE的细胞应答，以降低或提高IgE受体水平，并且用于治疗由IgE调节的疾病。
27.治疗疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-26的人工转录因子，其中待治疗疾病由特异性效应物与受体的结合所调节，为此所述多指锌指蛋白特异性靶向所述受体基因启动子。
28.治疗由内皮素调 节的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治疗有效量的权利要求2、3或6-17的人工转录因子。
【文档编号】C12N15/62GK103998609SQ201280049781
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年10月10日 优先权日:2011年10月11日
【发明者】J.弗拉梅, A.纽茨纳, A.赫克斯利 申请人:阿里奥弗塔股份公司