专利名称：检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及耐药检测方法，特别涉及检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法。
背景技术：
目前，我国幽门螺杆菌感染率超过50%，部分高发地区甚至到达70%-80 %。幽门螺杆菌被认为是I类致癌因子，长期幽门螺杆菌感染会导致萎缩性胃炎，肠化生甚至胃癌。随着幽门螺杆菌对抗生素耐药性增加，根除率降低，尤其以常用抗生素克拉霉素为著，因此检测其对克拉霉素的耐药情况尤为重要。在本发明之前，检测幽门螺杆菌对常用抗生素的耐药情况有E-test法和取胃粘膜提DNA两种方法。E-test法是一种应用于各种细菌耐药性的检测方法，该法用于检测幽门螺杆菌对常用抗生素耐药情况主要是通过取胃粘膜组织后涂菌环涂菌，2-3天后进行液体培养，将培养好的细菌均匀涂在培养皿上，通过加入不同抗生素贴条，根据贴条刻度判断其耐药情况。但该方法操作复杂，且稳定性差，易受外界条件干扰，因此在临床上未得以广泛应用。而胃粘膜提DNA法主要通过取感染者胃组织，试剂盒提取DNA，PCR扩增后酶切，通过电泳条带判断突变位点，进而判断细菌耐药情况。该法同样存在操作复杂，病人痛苦不愿配合等缺点，因此该法也无法在临床中应用。
发明内容
本发明目的就在于克服上述缺陷，研究一种检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及其制备方法。本发明的技术方案是:检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其主要技术特征在于该试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；具体在于:(1)其中所述的提取粪便DNA试剂包括2X十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2%巯基乙醇，PBS缓冲液；(2)其中所述的PCR反应试剂包括引物1，引物2，引物3，引物4，TaqPremix(2 X)；(3)其中所述的PCR产物纯化试剂包括4mol/L醋酸铵；(4)其中所述的纯化产物酶切试剂:酶1，酶2。本发明的另一技术方案是:检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒操作方法，其主要技术特征在于试剂盒的操作方法包括以下步骤:(1)粪便DNA提取:取适量新鲜粪便，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试齐U，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；(2)PCR反应:向离心管中加入上述提取的DNA、引物1、引物2、Taq Premix (2X)和ddH20，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无幽门螺杆菌感染；(3) PCR产物纯化:吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积醋酸铵、异丙醇溶液后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，加20ulddH20，置4°C冰禮备用；(4)纯化产物酶切:向纯化产物中加入酶1，酶2，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无克拉霉素耐药存在。本发明的又一技术方案是:检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒制备方法，其主要技术步骤在于:制备DNA提取试剂:(1)制备无菌PBS 缓冲液:将 4gNaCl，0.1gKCl，1.7g Na2HPO4.12Η20，0.Ig KH2PO4加Λ 400ml ddH20中，调节Ph至7.4后用ddH20定容至500ml，分装成IOOml后置入试剂盒；(2)制备 2XCTAB 提取液，其 PH 8.0:由 2 % CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.lMTris-cl,0.2 % 巯基乙醇组成，即称取 CTAB 2g 加 ddH2040ml,加 lMTris-cllOml，PH8.0,0.5M EDTA4ml，PH 8.0 和 5M NaCl 28ml，待 CTAB 溶解后用 ddH20 定容到 100ml，提取前加入2%的巯基乙醇，即IOOml加0.2ml巯基乙醇；(3)制备 IM Tris-cl IOOml:在 80ml ddH20 中加入 12.1lg Tris 碱和 4.9mlHCl,三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0,定容至IOOml ；(4)制备 0.5M EDTAlOOml:在 80mlddH20 中加入 18.0lg EDTANa22H20 搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0，约2gNaOH颗粒，定容至IOOml ；(5)制备 5M NaCl IOOml:称取 29.22g NaCl，用 ddH20 定容到 IOOml ；(6)制备 3M NaAclOml:称取 2.46g NaAc，用 ddH20 定容到 IOml ；制备PCR反应试剂:Premix 反应液 2mL:由 IOXPCR 缓冲液 2mL，4 种 dNTP 各 0.2umol, rTaq 酶 2.5U,Mg2+ 0.015mmol 混合组成；制备PCR产物纯化试剂:4mol/L醋酸铵溶液:称取77g无水固体醋酸铵晶体，加入IOOml ddH20,待完全溶解均匀，再用ddH20定容至250ml。本发明的优点和效果在于将易获取的宏观物质转化至分子水平进行研究，且将细菌DNA的提取、扩增、纯化、酶切等步骤融合成整体完成，不仅能取得可靠的幽门螺杆菌对克拉霉素耐药结果，并且在检测标本获取上具备操作简便、费用低，病人痛苦小、依从性高等特点，同时检测流程规范、便捷，能够实现广泛应用于临床的幽门螺杆菌耐药性检测。
图1——本发明中从粪便提取DNA 0 后进行？0 反应，病人1，7，8，9，10，11，12，
13，15，16显示扩增条带示意图。图2-本发明中PCR反应阳性后分别用酶I和酶2进行酶切，病人I用酶2后发
现2142A-G突变，病人10，11，13用酶1后发现2143八-6突变PCR后酶切示意图。图3——本发明试剂盒结构原理示意图，I代表提取粪便DNA试剂，2代表PCR反应试剂。3代表PCR产物纯化试剂，4代表纯化产物酶切试剂。图4——本发明1，2，3，4各部分具体结构图。
具体实施例方式本发明的操作方法，如图1、2、3、4所示:实施例1:提取DNA:包括 PBS 缓中液、Tirs 碱、浓盐酸、EDTANa2.2H20、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、巯基乙醇、研钵、恒温水浴、离心机、离心管。2.PCR反应:包括引物I，引物2，引物3，引物4，琼脂糖，EB替代物,1 X TAE, Taq Premix (2 X) 0 3.PCR产物纯化:醋酸铵、异丙醇。4.纯化产物酶切:酶1，酶2，琼脂糖，EB替代物，1 XTAE。下面具体说明:粪便DNA提取:取新鲜粪便0.2-0.4g，加入装有6mL无菌PBS缓冲液(0.05mol/L,pH 7.4)试管中充分振荡摇勻5 10min后500rpm离心5min,收集上清液。此步骤重复3次。然后上清液5000rpm离心10min，收集沉淀置于EP管中。沉淀物在1mL ddH20中悬置，混和后14000rpm离心5min收集沉淀。将沉淀溶于200 μ L无水乙醇(_20°C预冷)，振荡混匀后14000rpm离心2min，弃上清，此步骤重复3次。将预处理后所得沉淀转入2mlEP管中，加入600uL,65°C预热的2 X CTAB溶液(用前加入2 %的巯基乙醇)，将装有CTAB和沉淀的EP管放入65 ℃水浴，约lh。冷却后，加入600ul的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)，混匀，12000rpm，离心15min。吸上清,装入一新的EP管。加入600ul氯仿:异戍醇(24:1), 12000rpm。离心15min。吸上清，转入一新的EP管中，加入1/3体积的NaAc(3mol/l)加入lml-20°C预冷的无水乙醇，混匀后置于-80°C，30min。离心12000rpm，10min弃上清。向EP管中加入75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干。加入ddH20 (10-20ul)溶解。放入_80°C保存。PCR 反应:向200ulEP管中加入上述提取的1ul DNAUul引物l、lul引物2、10ulTaqPremix (2 X )、7ul ddH20配成20ul反应体系后，进行第一次PCR:95°C变性2min，5个循环的变性94°C 30s，退火57°C 30s，延伸72°C 30s，30个循环的变性94°C 15s，退火57°C15s，延伸72°C 20s。再向新1.5mlEP管中加入5ul上述PCR反应产物、2.5ul引物3、2.5ul引物 4、25ul Taq Premix (2 X)、15ul ddH20配成 50ul 反应体系，进行第二次PCR反应:95°C变性2min，25个循环的变性94°C 10s，退火63°C 20s。取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示,病人1,7,8,9,10,11,12,13,15,16显示扩增条带，即表示上述患者粪便中幽门螺杆菌DNA阳性。PCR产物纯化:吸取200ul上述所得PCR产物置于1.5ml EP管中，加入等体积4mol/L醋酸铵溶液，振荡混勻，再加等体积的异丙醇，振荡混勻，室温静置lOmin, 12000r/min,离心10min,去上清，加70%乙醇Iml漂洗，振荡，离心l0min，弃上清，再加70%乙醇Iml振荡混匀，4°C下离心5min(12000r/min),吸弃上清,室温下干燥,加20ulddH20,置4°C冰箱备用。纯化产物酶切:分别取3ul纯化产物加入两个200ulEP管中，分别加入酶1，酶2，配成20ul反应体系，分别37°C，55°C水浴14h，取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图3所示，病人I用酶2后发现2142A-G突变，病人10，11，13用酶I后发现2143A-G突变，即可表示病人1、10、11、13对克拉霉素耐药。试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；1)提取粪便DNA试剂包括2 X十六烷基三甲基溴化铵即2 X CTAB，其作用是溶解细胞膜，并与核酸形成复合物混合；2%巯基乙醇，其作用是保护DNA，提高DNA提取成功率。PBS缓中液，其作用是洗脱非特异性吸附，维持细胞电解质平衡。2)PCR反应试剂包括引物1，引物2，引物3，引物4，均用于起始DNA复制；Taq Premix 2 X，其作用是延伸DNA复制；3)PCR产物纯化试剂包括醋酸铵，其作用是沉淀DNA，使其纯化；4)纯化产物酶切试剂:酶1，酶2，其中酶I为Mbo 11，酶2为Bsa 1，其作用是根据其酶切后条带判断幽门螺杆菌是否存在耐药位点。PCR反应试剂中含有四种引物，其中引物I序列为GGTCTCAGCAAAGAGTCCCT，弓I物 2 序列为 CCCACCAAGCATTGTCCT，引物 3 序列为 AGGATGCGTCAGTCGCAAGAT ;引物 4 序列为CCTGTGGATAACACAGGCCAGT。通过本发明试剂盒，有效地指导临床对反复幽门螺杆菌感染的患者临床用药。由以上实验结果知，1，10，11，13患者难以根除幽门螺杆菌的原因可能为克拉霉素的耐药导致；因此我们对1，10，11，13患者进行幽门螺杆菌根除的补救治疗方案(即PPI+左氧氟沙星+阿莫西林)后，患者幽门螺杆菌均得以成功根除。实施例2:1.制备DNA提取试剂:(1)制备无菌PBS 缓冲液:将 4gNaCl，0.1gKCl，1.7g Na2HPO4.12Η20，0.Ig KH2PO4加Λ 400ml ddH20中，调节Ph至7.4后用ddH20定容至500ml，分装成IOOml后置入试剂盒。(2)制备 2 X CTAB 提取液，其 PH 8.0:由 2 % CTAB, 1.4MNacl，0.02MEDTA,0.lMTris-cl,0.2 %巯基乙醇组成，即称取CTAB 2g加40ml ddH20至烧瓶，加IMTris-cl 10ml，PH8.0,0.5M EDTA4ml, PH 8.0 和 5M NaCl 28ml，充分搅拌后待 CTAB 溶解用ddH20定容至Ij 100ml，提取DNA前加入2%的巯基乙醇，即IOOml加0.2ml巯基乙醇；(3)制备 IM Tris-cl 100ml:12.1lg Tris 碱，80ml ddH20，4.9ml HCl 三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至IOOml ；(4)制备 0.5M EDTAlOOml:在 80mlddH20 中加入 18.0lg EDTANa22H20 搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0，约2gNa0H颗粒，定容至IOOm I ；(5)制备 5M NaCl IOOml:称取 29.22g NaCl，用 ddH20 定容到 IOOml ；(6)制备 3M NaAclOml:称取 2.46g NaAc,用 ddH20 定容到 10ml。2.制备PCR反应试剂:(1) Premix 反应液 2mL:由 10 X PCR 缓冲液 2mL，4 种 dNTP 各 0.2umol，rTaq 酶 2.5U,Mg2+ 0.015mmo I 组成；(2)引物1，2，3，4根据引物序列要求购自相应公司；3.PCR产物纯化试剂:4mol/L醋酸铵溶液:称取77g无水固体醋酸铵晶体，加入100ml ddH20,待完全溶解均匀， 再用ddH20定容至250ml ；4.纯化产物酶切试剂:根据制备需要购自相应公司。
权利要求
1.检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其特征在于该试剂盒由提取粪便DNA试齐U，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；具体在于: (1)其中所述的提取粪便DNA试剂包括2X十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2%巯基乙醇，PBS缓冲液； (2)其中所述的PCR反应试剂包括引物1，引物2，引物3，引物4，TaqPremix2X ； (3)其中所述的PCR产物纯化试剂包括4mol/L醋酸铵； (4)其中所述的纯化产物酶切试剂:酶1，酶2。
2.根据权利要求1所述的检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其特征在于PCR反应试剂中含有四种引物，其中引物I序列为GGTCTCAGCAAAGAGTCCCT，引物2序列为 CCCACCAAGCATTGTCCT，引物 3 序列为 AGGATGCGTCAGTCGCAAGAT ;引物 4 序列为CCTGTGGATAACACAGGCCAGT。
3.根据权利要求1所述的检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其特征是纯化产物酶切试剂含有酶I和酶2，其中酶I为Mbo 11，酶2为Bsa I。
4.一种如权利要求1所述的检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒操作方法,其特征在于试剂盒的操作方法包括以下步骤: (1)粪便DNA提取:取适量新鲜粪便，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物； (2)PCR反应:向离心管中加入上述提取的DNA、引物1、引物2、TaqPremix (2X)和ddH20,进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无幽门螺杆菌感染；`` (3)PCR产物纯化:吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积醋酸铵、异丙醇溶液后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，加20ulddH20，置4°C冰箱备用; (4)纯化产物酶切:向纯化产物中加入酶1，酶2，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无克拉霉素耐药存在。
5.—种如权利要求1所述的检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒制备方法,其特征在于试剂盒的制备方法包括以下步骤: 制备DNA提取试剂:(1)制备无菌PBS 缓冲液:将 4gNaCl，0.1gKCl，1.7g Na2HPO4.12Η20，0.Ig KH2PO4 加入400ml ddH20中，调节Ph至7.4后用ddH20定容至500ml，分装成IOOml后置入试剂盒；(2)制备2XCTAB 提取液，其 PH 8.0:由 2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.lMTris-cl,`0.2 % 巯基乙醇组成，即称取 CTAB 2g 加 40mlddH20,加 lMTris-cllOml，PH8.0,0.5MEDTA4ml, PH 8.0和5M NaCl 28ml，待CTAB溶解后用ddH20定容到100ml，提前加入2%的疏基乙醇，即IOOml加0.2ml疏基乙醇；(3)制备IM Tris-cl IOOml:12.1lg Tris碱，80ml ddH20,4.9ml HCl 三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至IOOml ；(4)制备0.5M EDTAlOOml:在 80ml 水中加入 18.0lg EDTANa22H20 搅拌溶解，用 NaOH调PH至8.0，约2gNaOH颗粒，定容至IOOml ；(5)制备5M NaCl IOOml:称取 29.22g NaCl，用 ddH20 定容到 IOOml ；(6)制备 3M NaAclOml:称取 2.46g NaAc，用 ddH20 定容到 IOml ； 制备PCR反应试剂:Premix 反应液 2mL:由 10XPCR 缓冲液 2mL，4 种 dNTP 各 0.2umol, rTaq 酶 2.5U, Mg2+0.01 Smmol 组成； 制备PCR产物纯化试剂: 4mol/L醋酸铵溶液:称取77g无水固体醋酸铵晶体，加入IOOml ddH20,待完全溶解均匀，再用ddH20定容至250ml。
6.一种如权利要求1所述的用于检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药试剂盒是在检测幽门螺杆阳性患者在进 行根除治疗中其对克拉霉素耐药情况的应用。
全文摘要
本发明涉及检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法。本发明试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；制备DNA提取试剂，制备PCR反应试剂。本发明克服了过去E-test法操作复杂，且稳定性差，易受外界条件干扰；胃粘膜提DNA法同样存在操作复杂，病人痛苦不愿配合等缺陷。本发明将易获取的宏观物质转化至分子水平进行研究.且将细菌DNA的提取、扩增、纯化、酶切等步骤融合成整体完成，不仅能取得可靠的幽门螺杆菌对克拉霉素耐药结果，并且在检测标本获取上具备操作简便、费用低，病人痛苦小、依从性高等特点，同时检测流程规范、便捷，能够实现广泛应用于临床的幽门螺杆菌耐药性检测。
文档编号C12Q1/68GK103103261SQ20131000063
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者张国新, 周晓颖, 苏静 申请人:张国新, 周晓颖, 苏静