专利名称：一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，属于生物技术领域。
背景技术：
现有的大鼠脑血管内皮细胞原代培养，取材来源均为新生鼠(〈10天，35 50g)，幼年鼠(〈3weeks，80 IOOg)或2_3月年轻成年鼠(200g 300g)，而且培养的脑血管内皮细胞只能传代一次，不能冻存，利用大鼠脑血管内皮细胞作为实验材料导致时间长、实验成本高的缺点。如Bowman PD, Betz AL, Ar D, Wolinsky JS, Penney JB, Shivers RR,Goldstein GW. 1981. Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.1NVITR0. 17(4),353-362。老年大鼠(19 22月，900g 1200g)脑血管内皮细胞培养成功的先例至今未见报道；现有的取材对象和培养技术不能满足体外建立老年血脑屏障模型，研究老年血脑屏障的生理特性，以及老年神经系统疾病与血脑屏障相关的退行性病变的要求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液。本发明技术方案如下一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分20ml-30ml血浆来 源的血清，IOOul青霉素-链霉素溶液，1.0-1. 5ml L-谷氨酰胺，50-150 μ I硫骏庆大霉素，1. 0-1. 5ml肝素，150-300 μ I碱性纤维生子因子，1. 0-1. 5ml内皮细胞生长补充因子，200-400 μ I维生素C，100-200 μ I血管内皮生长因子，100-200 μ I胰岛素样生长因子-1，100-200 μ I内皮生子因子。向DMEM培养基中加入上述组分即可。根据本发明优选的，所述在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分20ml血浆来源的血清，IOOul青霉素-链霉素溶液，1. 0ml L-谷氨酰胺，100 μ I硫骏庆大霉素，1. Oml肝素，150 μ I碱性纤维生子因子，1. Oml内皮细胞生长补充因子(ECGS)，300 μ I维生素C，150 μ I血管内皮生长因子(VEGF) ,150 μ I胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)，150 μ I内皮生子因子(EGF)。 上述试剂均为本领域常用市售产品。有益效果1、本发明所述内皮细胞培养液采用PDS (血浆来源的血清)代替了传统培养液中的FBS (胎牛血清)、小牛血清(BCS)或马血清(HS)，使培养的脑血管内皮细胞纯度增加30%;主要原因是由于FDS中不含TOGF (血小板源性生长因子)，而I3DGF有利于混入脑血管内皮细胞中的平滑肌细胞，纤维细胞和胶质细胞的分裂和增殖；用PDS消除了这一影响。2、本发明在内皮细胞培养液中加入了维生素C和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞生长更快更纯。3、本发明在内皮细胞培养液中还加入了血管内皮生长因子，胰岛素样生长因子-1，内皮生子因子，这些因子可使脑血管内皮细胞生长得更快更健康，尤其是对老年大鼠脑血管内皮细胞的生长更为重要。
图1、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞经原代培养传3代与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养传3代的存活率的柱状比较图；图2、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞经冻存复苏后与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞经冻存复苏后的存活率的柱状比较图；图3:本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞细胞纯度的柱状比较图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。原料来源19-22月的老年大鼠购自北京维通利华实验动物技术中心；配制老年大鼠脑血管内皮细胞培养基各种试剂的来源
DMEM培养基，购自Gibico公司，商品号11995-065 ；血衆来源的血清(PDS, Plasma-Derived Serum),购自Bioquote公司，商品号BT-214-10 ；青霉素-链霉素溶液，购自sigma公司，商品号p0718 ;L-谷氨酰胺,购自Sigma公司，商品号G7513 ;硫骏庆大霉素，购自sigma公司，商品号G1397 ；肝素,购自Sigma公司，商品号H3149 ;碱性纤维生子因子(bFGF)，购自Sigma公司，商品号F9786 ；内皮细胞生长补充因子(ECGS)，购自Sigma公司，商品号E2759 ;维生素C，购自Sigma公司，商品号C1768 ;血管内皮生长因子(VEGF),购自Lonza公司，商品号cc4176 ；胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)购自Lonza公司，商品号cc4176 ;内皮生子因子(EGF)购自Lonza公司，商品号cc4176 ；嘌呤霉素(Puromycin),购自Sigma公司，商品号p8833。各种酶及其他相关试剂的来源胎牛血清(FBS)购自Invitrogen公司，商品号10437-028 ；胶原酶(Collagenase)购自Invitrogen 公司，商品号 17101 ；DNA 酶(DNase)购自 Sigma-Aldrich 公司，商品号 D4263 ;胰酶(Typsin)购自Sigma-Aldrich 公司，商品号 T3053 ;牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich公司，商品号a3059 ;
胶原IV (Collagen IV)购自 Sigma-Aldrich 公司，商品号 C5533 :纤连蛋白(Fibronectin)购自Sigma-Aldrich 公司，商品号 F1141 ；Percoll 购自 Sigma-Aldrich 公司，商品号 4937 ；腰椎穿刺针(Lumbarpuncture needle)购自 BD 公司，商品号 405182。实施例1一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分30ml血浆来源的血清，100 μ I青霉素-链霉素溶液，1. Oml L-谷氨酰胺，100 μ I硫骏庆大霉素，1. 5ml肝素，150 μ I碱性纤维生子因子，1. Oml内皮细胞生长补充因子，400 μ I维生素C，200 μ I血管内皮生长因子，200 μ I胰岛素样生长因子-1，200 μ I内皮生子因子；向DMEM培养基中加入上述组分即可。
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实施例2 一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分20ml血浆来源的血清，100 μ I青霉素-链霉素溶液，1. Oml L-谷氨酰胺，100 μ I硫骏庆大霉素，1. Oml肝素，100 μ I碱性纤维生子因子，1. Oml内皮细胞生长补充因子，200 μ I维生素C，100 μ I血管内皮生长因子，100 μ I胰岛素样生长因子-1，100 μ I内皮生子因子；向DMEM培养基中加入上述组分即可。对比例传统脑血管内皮细胞培养液为在每100ml F12培养基(Ham’ s_F12培养基)的基础上加入如下成分10_20ml小牛血清(BCS), 100 μ I青霉素-链霉素溶。(该配方记载于Bowman PD, etal. Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.1NVITRO. 1981. 17(4),353-362 中)。或者是44ml DMEM 培养基，44ml Ham，s_F12 培养基，10ml 胎牛血清(FBS)，100 μ I 青霉素-链霉素溶，1. Oml肝素钠，1. Oml内皮细胞生长补充因子。(该配方记载于Tunkel AR etal. Blood—brain barrier alterations in bacterial meningitis development of an invitro model andobservations on the effects of lipopolysaccharide.1n Vitro CellDev Biol. 199127A(2) :113_20)。试验例将上述培养液按如下步骤实验培养(I)将20月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0°C的含2% (体积百分数)胎牛血清(FBS)分离液中5分钟，取出，切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分，制得样品组织；分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分1ml青霉素-链霉素溶液；100 μ I硫骏庆大霉素；(2)把样品组织置于5ml冰冷的含2% (体积百分数)FBS分离液的培养皿中剪成I 2mm3的样品组织小块，补加2% (体积百分数)FBS分离液至25ml，经吹打分散，然后将吹打分散的样品组织小块加入2. 5ml的胶原酶和250 μ I的DNA酶溶液，在36°C的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟，制得分散细胞；(3)向步骤(2)制得的分散细胞补加10ml2% (体积百分数)FBS的分离液，混匀后在4°C，600g离心8分钟；移去上清，加20ml含20% (体积百分数)BSA的DMEM培养基，吹打混匀后，4°C，IOOOg离心20分钟；取最下层的沉淀，制得毛细血管细胞；(4)将步骤(3)制得的毛细血管细胞重悬于Iml的分离液中，再加入7. 9ml的分离液，Iml的胶原酶和100 μ I的DNA酶溶液，混匀后在37°C水浴摇床中(100rpm/min)消化90分钟，制得毛细血管悬液；(5)将步骤(4)制得的毛细血管悬液在4°C，600g离心5分钟；移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；4°C，IOOOg离心10分钟，分为六层(第一层透明的分离液；第二层透明的Percoll但在靠分离液处有些浮渣；第三层消化好的脑血管内皮细胞层；第四层透明的Percoll ;第五层红细胞层；第六层=Percoll晶体)，用长的腰椎穿刺针取第三层液体，第三层液体即为脑血管内皮细胞；(6)将步骤(5)制得的脑血管内皮细胞溶于Iml的内皮细胞培养液中，然后转移到IOcm的培养板或6孔板中，正常条件下培养I天，然后用IXPBS缓冲液洗两次除去死亡的细胞，用含3 μ M/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2天后,更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7天，用O. 01%胰酶(Typsin)消化传代或冻存即可；
所述培养板或6孔板制备方法如下先用IXCollagen IV铺板30分钟,然后再用I XFibronectin 铺板 30 分钟。结果分析1、本发明在脑血管内皮细胞培养液中除了加入内皮细胞生长补充因子(ECGS)夕卜，还加入了碱性纤维生子因子(bFGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)，内皮生子因子(EGF)及维生素C。这些因子可保证脑血管内皮保持健康的细胞形态、生物特性及生理功能和较快的生长速度；尤其是对老年大鼠脑血管内皮细胞的生长更为重要。如果不加这些因子，老年大鼠脑血管内皮细胞生长速度缓慢，细胞比较脆弱，容易死亡，只能传一代，不能冻存和复苏。2、本发明所述内皮细胞培养液采用PDS (血浆来源的血清)代替了传统培养液中的FBS (胎牛血清)、小牛血清(BCS)或马血清(HS)，使培养的脑血管内皮细胞纯度增加30%;主要原因是由于FDS中不含TOGF (血小板源性生长因子)，而I3DGF有利于混入脑血管内皮细胞中的平滑肌细胞，纤维细胞和胶质细胞的分裂和增殖；用PDS消除了这一影响。3、本发明在内皮细胞培养液中加入了维生素C，肝素和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞生长得更快更纯；主要原因是维生素C和肝素刺激内皮细胞的生长，抑制平滑肌细胞的生长；嘌呤霉素可抑制成纤维细胞的生长，这些因子保证了培养的内皮细胞的纯度。实施例1所述更新培养液与传统培养液培养的老年大鼠脑血管内皮细胞传3代存实施例1对比例
原始代的存活率 100%100%
活率的比较(见图1)第_代的丨7:沽.中.(80.12±6.5)%(40.24±7.3)%
笫.代的忭沾■申.(70.34±7.1)%(20.34±4.7)%
第三代的存活率(65.78±5.8)%(10.12±6.1)%实施例2所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统方法冻存/复苏后存活率的比较(见图2)实施例2对比例原始代的存活率100%冻存/ 复苏存活率 (78. 53 ±7. 76) %(12. 45 ±5. 9)%实施例1所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统培养液及方法细胞纯度比较(见图3)实施例1对比例细胞纯度(98. 26 ±1. 8) %(68. 32 ±3.2)%由上述结果可知，本发明所述的老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法无论在传3代存活率、冻存/复苏后存活率和细 胞纯度均较现有技术有大幅提高。
权利要求
1.一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，其特征在于，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分20ml-30ml血浆来源的血清，IOOul青霉素-链霉素溶液，1. 0-1. 5ml L-谷氨酰胺， 50-150 μ I硫骏庆大霉素，1. 0-1. 5ml肝素，150-300 μ I碱性纤维生子因子，1. 0-1. 5ml内皮细胞生长补充因子，200-400 μ I维生素C，100-200 μ I血管内皮生长因子，100-200 μ I胰岛素样生长因子-1，100-200 μ I内皮生子因子。
2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分20ml血浆来源的血清，IOOul青霉素-链霉素溶液，1. Oml L-谷氨酰胺，100 μ I硫骏庆大霉素，1. Oml肝素，150 μ I碱性纤维生子因子，1. Oml内皮细胞生长补充因子，300 μ I维生素C, 150 μ I血管内皮生长因子，150 μ I胰岛素样生长因子_1，150 μ I内皮生子因子。
全文摘要
本发明涉及一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分血浆来源的血清，青霉素-链霉素溶液，L-谷氨酰胺，硫骏庆大霉素，肝素，碱性纤维生子因子，内皮细胞生长补充因子，维生素C，血管内皮生长因子，胰岛素样生长因子-1，内皮生子因子。本发明所述内皮细胞培养液采用PDS代替了传统培养液中的FBS、小牛血清或马血清，使培养的脑血管内皮细胞纯度增加30％；并且加入了维生素C和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞生长更快更纯。
文档编号C12N5/071GK103045534SQ20131002594
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者王丽梅, 崔敏, 王越, 陈哲宇 申请人:山东大学