一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法

专利名称：一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法。
背景技术：
过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又称触酶(Catalase, CAT),是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶。真核生物的过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%。哺乳动物组织中过氧化氢酶含量差异很大，以肝脏中含量最高，结缔组织中含量最低。过氧化氢酶的主要作用就是催化H2O2分解为H2O和02，使H2O2不致于和O2在铁螯合物的作用下反应生成非常有害的-0H，从而使细胞免于遭受毒害，它是生物防御体系的关键酶之一。鉴于含有过氧化物酶的抗氧化复合物可用于治疗，故认为过氧化氢酶也可用于治疗氧化损伤疾病。过氧化氢酶自1950年就开始应用在工业生产中，广泛用于生物、医药、临床医学和食品领域中的某些分析测定，以及食品和乳制品工业、纺织工业、环保产业、制浆和造纸工业，在医疗器械的消毒、葡萄糖酸的生产等方面也有越来越多的应用。目前商业化的动物源过氧化氢酶，主要以牛肝提取物为主。梅花鹿为我国 传统的珍贵药用动物，其产品在我国拥有悠久的药用历史。例如鹿茸，入药已有2000多年的历史，是一味名贵的滋补强壮的中药。明代李时珍《本草纲目》中记载有“鹿茸能生津补髓，养血益阳，强筋健骨，益气强志”。随着科学技术的发展，进一步证明了鹿茸的药理作用非常广泛，具有调节机体新陈代谢、促进各种生理机能活动的作用。目前，梅花鹿过氧化氢酶基因为未知序列，尚未见报道。克隆鹿源过氧化氢酶，并对其基因序列进行分析，并表达重组蛋白，无论是在工业化应用领域，还是探究其药理价值，都具有重要意义。

发明内容
为获得梅花鹿过氧化氢酶基因序列并表达其重组蛋白，本发明提供了一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法，本发明成功的克隆得到梅花鹿过氧化氢酶基因，对其基因序列进行分析并表达了其重组蛋白，无论是在工业化应用领域，还是探究其药理价值，都具有重要意义。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明首先提供了一种梅花鹿过氧化氢酶基因，所述梅花鹿过氧化氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述梅花鹿过氧化氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 所述梅花鹿过氧化氢酶基因来源于梅花鹿。本发明还提供了一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于所述梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法如下(1)从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因；
(2)将步骤(I)所得目标基因进行DNA序列测定，并对该目标基因进行序列和功能分析，最终确定梅花鹿过氧化氢酶基因；
步骤(I)中所述的从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA的具体步骤如下
A.从低温中取出新鲜梅花鹿的肝脏组织，在液氮中将IOOmg组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1. 5ml Ep管中，加入1. Oml的Trizol ；
B.用Iml针筒，26-G号针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1. 5ml Ep管中；
C.加入200ml氯仿/异戊醇或氯仿，剧烈振荡混匀30秒；所述氯仿/异戊醇的体积比为 24 :1 ；
D.台式离心机上，12,OOOrpm,室温离心5 min ；
E.转移上清液到RNase-free1.5ml Ep管里，加入等体积异丙醇，室温放置5 min ；
F.台式离心机上，12,OOOrpm,室温离心5min ； G.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失；
H.用70%酒精洗涤两次，每次700μ 1，12，OOOrpm,室温离心2min ；1.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失；
J.真空离心干燥3-5 min，或在室温下使酒精完全挥发；
K.沉淀用30-50 μ I DEPC-H2O溶解。若沉淀难溶，68°C处理10 min ；
L.凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况；
步骤(I)中所述的mRNA反转录为cDNA的具体步骤如下
a.在PCR管中配制如下混合液共10μ1:
总 RNA I μ I
50 μ M Oligo dT (18) Primer I μ IdNTPs Mixture I μ I
其余为RNase free ddH20 ;所述dNTPs Mixture中各喊基的浓度为IOmM ；
b.65°C保温5min后迅速在冰上冷却2min以上；
c.离心数秒钟使模版RNA和弓I物等物质的混合液聚集于PCR管底部；
d.在上述PCR管中配置如下反转录反应液,总体积为20μ1:
上述混合液10 μ I
5Χ PrimeScript Buffer 4 μ I40U/μ I RNase Inhibitor O. 5 μ I
200U/μ I PrimeScript Reverse Transcriptase 100 200untis 其余为 RNase free ddH20 ；
e.42°C 保温 30 60min ；
f.70°C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增；
所述PCR扩增时所设计的引物为
Cat+ :5，-GCATCGCCACTCAGACAT-3，
Cat- :5’ - CGATCCGTGGGTACAGG-3’。
本发明还提供了一种梅花鹿过氧化氢酶，所述梅花鹿过氧化氢酶是由所述的梅花鹿过氧化氢酶基因编码翻译而成。本发明另外还提供了一种梅花鹿过氧化氢酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤1.梅花鹿过氧化氢酶基因的亚克隆；
.梅花鹿过氧化氢酶基因的表达采用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达，构建梅花鹿过氧化氢酶基因的重组表达载体，转化毕赤酵母菌后，提取毕赤酵母菌基因组DNA，PCR验证转化结果，培养阳性毕赤酵母菌，发酵并用甲醇诱导梅花鹿过氧化氢酶的表达；对表达产物进行功能测定，最终确定成功获得梅花鹿过氧化氢酶；构建重组载体所选用的质粒是pPICZaC，所述毕赤酵母菌为GSl 15。所述步骤(i)中梅花鹿过氧化氢酶基因的亚克隆所用的引物如下
Pcat2+ CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATC
Pcat- TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT ；
所述引物Pcat2+带有Clal酶切位点，即上述序列的下划线部分；
所述引物Pcat-带有Xbal酶切位点，即上述序列的下划线部分；
所述步骤(ii)中重组表达载体转化毕赤酵母菌的具体步骤如下
a.将毕赤酵母宿主菌株于100mlYPD培养基中振荡培养至0D600为1. 1-1. 3 ；
b.1500g-1700g离心5min收集菌体，将离心管倒置在吸水纸上轻拍数下，充分弃上
清；·
c.加入IOOml冰浴的高纯水，于振荡器上振荡混匀；
d.离心，弃上清，再加IOOml高纯水洗涤一次；
e.离心，弃上清，加20ml冰浴的IM山梨醇洗涤一次；
f.离心,弃上清,菌体置于冰浴中,加入约100- 200 μ I山梨醇，并混匀；
g.吸取100- 150 μ I感受态细胞添加到线性化的DNA中，用移液器吹吸混匀；
h.将上述样品于冰浴中静置5min,转移入2mm电转化杯中，放置于BioradMicropluser电转仪上,使用仪器内嵌的预设毕赤酵母电转化程序“Pic”电击一次；1.立即向电击杯中加入Iml山梨醇，将全部液体转入IOml离心管中，30°C静置lh，然后加入Iml YPD培养基，300C，200rpm振荡培养lh，取50 — 200 μ I菌液涂布于添加有终浓度100 μ g/mL的Zeocin抗生素的YPD培养基平板；培养3天，至单菌落形成；所述YPD培养基配方为1%酵母浸膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
所述毕赤酵母菌基因组DNA的提取步骤如下
使用裂解液提取基因组，裂解液配方2% (v/v)Triton X-100, 1% (w/v)SDS, IOOmMNaCl，pH8. O IOmM Tris base, pH8. 0 ImM EDTA ;具体实验操作步骤如下
a.过夜培养IOml重组毕赤酵母菌液至0D600值为2_3；
b.2000rpm/min离心沉降细胞，然后以等体积的无菌蒸馏水洗涤，所述无菌蒸馏水预
先4°C保存；
c.将细胞沉淀在200μ I裂解缓冲液中重悬，然后加入约200 μ I的1:1苯酚/氯仿混和液；
d.漩涡震荡l_2min;e.加入200μ I的TE缓冲液，倒置混合6-10次；
f.在微型离心机中以13000rpm/min的速度离心样品5min；
g.将上层的水相转移到干净的微量离心管中；
h.加入400μ I氯仿；1.同步骤f离心；
j.将上层的水相转移到新的微量离心管中； k.加Iml乙醇,翻转混勻；1.在微型离心机中以13000rpm/min的速度离心2min ； m.弃上清液，用Iml的70%乙醇洗涤沉淀； η.完全弃去上清液，并将沉淀在室温下干燥；
ο.在400 μ I含有终浓度为2 μ g/ml的核糖核酸酶的TE缓冲液中重悬浮沉淀； p. 37°C孵育 IOmin ； q.重复步骤i一 I ； r.在50 μ I TE缓冲液中重悬沉淀；
所述毕赤酵母菌发酵诱导梅花鹿过氧化氢酶表达的具体步骤为
a.将Zeocin抗性平板上的毕赤酵母单克隆接种于5mL的YPD培养基中，于恒温摇床上30°C，220rpm振荡培养12 16h ；
b.将上述培养液接种于50mL的YP培养基中，30°C，220rpm振荡培养2h；
c.向培养物中添加100%的甲醇，使其终浓度达到O.5% ；甲醇每隔24h添加一次；
d.每隔24小时取出ImL的培养液，冷冻于_80°C冰箱；
e.发酵培养96h后，结束发酵，`取出培养液，离心，去除沉淀，SDS-PAGE电泳分析上清
液；
所述YP培养基配方为1%酵母浸膏，2%蛋白胨；
所述表达产物进行功能测定的步骤如下
使用市售双氧水进行活性的定性检测取一定体积的上述表达后的发酵上清液，滴加入双氧水中；以未诱导的不添加甲醇的重组子发酵上清液、空宿主毕赤酵母GS115的发酵上清液以及空白的YP液体培养基为对照，以等体积同样滴加入双氧水中，观察现象。有过氧化氢酶活性的样品组产生气泡。本发明的显著优点本发明提供了一种过氧化氢酶及其制备方法，本发明首次成功表达了梅花鹿过氧化氢酶，无论是在工业化应用领域，还是探究其药理价值，都具有重要意义。本发明毕赤酵母菌基因组DNA的提取步骤的优点在于不需要使用物理方法(超声波处理、液氮研磨、反复冻融等)或者酶法(蜗牛酶、几丁质酶、溶壁酶、溶菌酶处理等等)来破碎酵母细胞，更加简便，节约时间，节约成本。


图1为梅花鹿总RNA提取电泳 图2为过氧化氢酶基因PCR电泳结果；其中泳道I为过氧化氢酶基因PCR结果；泳道M 为 TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；
图3为核酸测序得到的DNA序列所翻译出的氨基酸序列编码蛋白的保守结构域分析结
果;
图4为核酸测序得到的DNA序列所翻译出的氨基酸序列的亲疏水性分析结果；
图5为核酸测序得到的目的基因核酸序列进化树；
图6为核酸测序得到的DNA序列所翻译出的氨基酸序列进化树；
图7为鹿源与牛源的过氧化氢酶蛋白质序列比对分析结果；其中CatD为梅花鹿过氧化氢酶蛋白质序列；Bos Taurus为黄牛过氧化氢酶蛋白质序列；
图8为质粒与PCR产物酶切电泳图；其中M为TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；1为Clal和Xbal酶切后并纯化的亚克隆cat基因片段；2为Clal和Xbal酶切后并纯化的pPICZ a C 质粒；
图9为菌落PCR电泳结果；其中M为TaKaRa 250 bp DNA ladder marker ； 1-5为菌落PCR产物；
图10为重组质粒单酶切电泳结果；其中M为TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；I为Sacl单酶切重组质粒；
图11为基因组模板PCR扩增结果；其中M为TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；1为cat基因；
图12为发酵上清液SD S-PAGE电泳结果；其中M为TaKaRa broad protein marker ；1为pPICZ a C-cat-GS115发酵上清液；
图13为过氧化氢酶活性测定标准曲线。
具体实施例方式下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。实施例1
本实施例的供试材料为新鲜梅花鹿QCervus)肝脏,购自福州市西营里市场。本
发明所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。I梅花鹿过氧化氢酶基因(cat)序列的克隆和测序.1.1梅花鹿Total RNA的提取,具体步骤如下
A.从低温中取出鹿的肝脏组织，在液氮中将约IOOmg组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1. 5ml Ep管中，加入1. Oml的Trizol。B.用Iml针筒，26-G号(6#)针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml Ep管中。C.加入200ml氯仿/异戊醇(24 I)或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。D.台式离心机上，12, OOOrpm,室温离心5分钟。E.转移上清液到RNase-free 1.5ml Ep管里，加入等体积异丙醇，室温放置5分钟。F.台式离心机上，12，OOOrpm,室温离心5min。G.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
H.用70%酒精洗涤两次，每次700 μ 1，12，OOOrpm,室温离心2min。1.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。J.真空离心干燥3-5分钟，或在室温下使酒精完全挥发。K.沉淀用30-50 μ I DEPC-H20溶解。若沉淀难溶，68°C处理10分钟。L.凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况。梅花鹿肝脏Total RNA提取的凝胶电泳图像如图1所示，其中28SrRNA、18S rRNA条带清晰可见，泳道前沿隐约能见5S rRNA条带，说明Total RNA提取质量较好，无明显降解，可直接用于逆转录。1. 2逆转录生成cDNA第一链
逆转录体系包括dNTPs、mRNA、RNA抑制剂、引物及逆转录酶，根据酶(MMLV或AMV)种类不同决定反应温度、pH值和时间。参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTPs、模板和缓冲液(其中需要添加Mg2+)。PCR反应共分3个步骤进行
A. DNA变性(90°C -96°C ):双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。B.退火(25°C -65°C):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。C.延伸(70°C -75°C):在Taq酶(在72°C左右Taq酶具有最高活性)的作用下，以dNTPs为原料，从引物的5'端一3'端延伸，合成与模板互补的DNA链。

本研究中RT-PCR的具体操作如下
a.在PCR 管中配制如下混合液共 10 μ1:Total RNA I μ I, Oligo dT (18) Primer(50 μ Μ) I μ I>dNTPs Mixture (IOmM each) I μ I>RNase free ddH20 Up to 10 μ I ；
b.65°C保温5min后迅速在冰上冷却2min以上。c.离心数秒钟使模版RNA和引物等物质的混合液聚集于PCR管底部。d.在上述PCR管中配置如下反转录反应液
上述模版RNA/引物等的混合液10μ1、5Χ PrimeScript Buffer 4μ1、
RNase Inhibitor (40U/ μ1)0. 5μ1> PrimeScript Reverse Transcriptase (200U/μ I) 100 200untis
Rnase free ddH20 Up to 20 μ I ；
e.42°C 保温 30 60min。f. 70°C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增。1. 3 cDNA的PCR扩增按下述组成配制PCR反应液，全量50μ1。本研究中所有的PCR实验，引物均用高纯水配置为10 μ M工作液浓度。PCR 反应液体系上述 cDNA 溶液 2μ1 ;dNTPs Mixture (2. 5mM each) 8M-1 ；Forward Primer (10 μ M)lM-l ；Reverse Primer (10 μ M)lM-l ； 10X PCR Buffer (Mg2+ Plus)5M-1 ；DNA polymerase (5U/M-1) 0. 5M-1 ;其余为水。PCR 程序如下94°C，4min、94°C，45s ；50 6(TC，30s ；72°C，90s,72°C，lOmin、
4°C ;循环数为35。根据Genbank报道的部分哺乳动物过氧化氢酶基因序列(ΝΜ_001035386，AB038231，NM_001752, NM_012520)，通过ClastalW进行序列对位排列，查找保守区，设计如下引物
Cat+ (SEQ ID NO. 3) :5’ GCATCGCCACTCAGACAT 3’，Cat- (SEQ ID NO. 4):5’ CGATCCGTGGGTACAGG 3’ 进行 PCR。RT-PCR 最终结果如图 2所示，成功扩增出一条大约1. 5KB的目的条带。1. 4纯化回收目的DNA :本研究采用TIANGEN公司的双功能DNA纯化回收试剂盒纯化回收目的DNA，具体步骤参照该产品的使用说明书TIANGEN公司双功能DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN公司双功能DNA纯化回收试剂盒)。1. 5目的DNA与T载体连接T载体连接反应液体系如下Τ载体50ng ;纯化的DNA片段 10-50ng ;T4 DNA 连接酶 2-3weiss units ; IOX 连接缓冲液 Ιμ ；ddH20Up to10 μ I ;在PCR管中混合各种物质，16°C保温30min即可。1. 6转化与测序将T载体连接反应液转化大肠杆菌T0P10，挑取单菌落，并将其命名为pGEM-cat,送交测序公司(Invitrogen Custom Service)使用T7和SP6测序引物测序。2梅花鹿过氧化氢酶基因的核酸序列和氨基酸序列的的特征和功能分析
上述PCR产物测序结果全长1717bp序列详见序列表(SEQ ID NO.1)，通过Blast比对，确定其中1584bp为梅花鹿过氧化氢酶基因编码区(CDS)。梅花鹿过氧化氢酶基因编码527个氨基酸(氨基酸序列详见序列表SEQ ID NO. 2),其中61个Strongly Basic (+) AminoAcids (K, R)，65 个 Strongly Acidic(-) Amino Acids (D, E)，167 个 Hydrophobic AminoAcids (A, I, L, F, ff, V)，以及 127 个 Polar Amino Acids (N, C, Q, S, T, Y)。使用Expasy对梅花鹿过氧化氢酶的蛋白质序列进行分析，其编码蛋白的理论计算分子量为60027. 4 Da ltons，理论计算等电点为6. 67，预测蛋白质结构中不含有二硫键，在蛋白质序列中，如图3所示，有一段FdReripERvvHakGAG序列具有过氧化氢酶家族活性中心的显著特征，另有一段序列RLFAYpDTH具有过氧化氢酶家族亚铁血红素的显著特征。使用Kyte&Doolittle算法对梅花鹿过氧化氢酶的蛋白质序列进行亲疏水性分析，结果如图4所示，表明在第140-160位残基和第310-320位残基附近有典型的疏水性区域。在第1-20位残基附近有一个典型的亲水性区域。此蛋白整体是亲水性的。亲水性的蛋白一般适合采用异源蛋白表达系统进行重组蛋白表达。过氧化氢酶蛋白二级结构的预测采用PHD方法，梅花鹿过氧化氢酶预测结果如表I所示。蛋白质序列中440位 500位的序列为alpha-螺旋，大部分结构呈无规卷曲，出现少量的beta折叠。表I 二级结构分析结果
二级结构a-螺旋beta折叠无规卷曲
预测百分比C5/。) 20 Ι β ο
对梅花鹿过氧化氢酶的核酸序列进行分子进化分析，构建核酸进化树，采用NJ算法，其结果如图5所示，由图可知，梅花鹿过氧化氢酶的核酸序列与NM_001035386.1 (Bostaurus catalase)以及 GQ204786.1 (Capra hircus catalase)的同源关系最近，说明过氧化氢酶的基因序列，在鹿、牛、羊等反刍动物中高度保守，而与NM_130912. KDanio reriocatalase)的同源关系相去甚远，由此可见，在该基因的分子进化过程中，陆生哺乳动物与鱼类具有很大的分化，这与自然界物种进化的规律是相一致的。图6为梅花鹿过氧化氢酶蛋白质序列NJ进化树，由此图同样可知，ΝΡ_001030463.1 (catalase [Bos taurus])>ACS88258.1 (catalase [Capra hircus])与本课题所克隆的基因同源关系最近，和上述核酸进化树的结论相一致。与其同源关系最远的是家蚕的过氧化氢酶蛋白序列NP_001036912.1 (catalase [Bombyx mori])。对梅花鹿过氧化氢酶蛋白质序列和与其序列同源性关系最接近的Bos taurus(黄牛)过氧化氢酶蛋白质序列进行比对，结果如图7所示，二者具有98%的同源性，但是在序列内部，有9个位点的氨基酸组成存在差异。3梅花鹿过氧化氢酶蛋白质的基因工程表达和功能(酶活性)的测定。3.1梅花鹿过氧化氢酶基因的表达
梅花鹿过氧化氢酶基因采用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达，选用的质粒是pPICZ α C，宿主酵母菌为GS115。首先，设计以下一对PCR引物进行过氧化氢酶基因亚克隆(产物大小为1600bp)
Pcat2+ (SEQ ID NO. 5) CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATC (Clal)
Pcat- (SEQ ID NO. 6) TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT (Xbal)；
引物分别带有Clal和Xbal酶切位点，以之前构建的pGEM_cat质粒作为模板，PCR扩增之后，使用Clal和Xbal内切酶对PCR产物进行酶切，pPICZ a C质粒也用这两种酶进行双酶切，纯化回收酶切产物，电泳检测结果如图8所示，条带分子量大小均正确，梅花鹿过氧化氢酶基因长度约1. 6Kb，线性化pPICZ a C质粒长度约3. 6Kb。之后，使用T4 DNA连接酶连接上述基因和质粒，再转化大肠杆菌。3. 2菌落PCR筛选 本研究采用了一种简便快速的方法来鉴定重组子，即菌落PCR，该方法直接以大肠杆菌单菌落或者菌液作为模板进行PCR扩增，以扩增条带的有无以及分子量大小判断重组子的正确性。菌落PCR的具体步骤如下，首先，在PCR管中配置如表2所示的反应液。表2菌落PCR反应液成分
权利要求
1.一种梅花鹿过氧化氢酶基因，其特征在于所述梅花鹿过氧化氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因，其特征在于所述梅花鹿过氧化氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根据权利要求1所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因，其特征在于所述梅花鹿过氧化氢酶基因来源于梅花鹿。
4.一种如权利要求1所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于所述梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法如下 (1)从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNAJfmRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因； (2)将步骤(I)所得目标基因进行DNA序列测定，并对该目标基因进行序列和功能分析，最终确定梅花鹿过氧化氢酶基因。
5.根据权利要求4所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于步骤(O中所述的从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA的具体步骤如下 A.从低温中取出新鲜梅花鹿的肝脏组织，在液氮中将IOOmg组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1. 5ml Ep管中，加入1. Oml的Trizol ； B.用Iml针筒，26-G号针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1. 5ml Ep管中； C.加入200ml氯仿/异戊醇或氯仿，剧烈振荡混匀30秒；所述氯仿/异戊醇的体积比为 24 :1 ; D.台式离心机上，12000rpm,室温离心5min ；E.转移上清液到RNase-free1.5ml Ep管里，加入等体积异丙醇，室温放置5 min ； F.台式离心机上，12000rpm,室温离心5min； G.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失； H.用70%酒精洗涤两次，每次700μ 1，12000rpm,室温离心2min ；1.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失； J.真空离心干燥3-5 min，或在室温下使酒精完全挥发； K.沉淀用30-50 μ I DEPC-H2O溶解；若沉淀难溶，68°C处理10 min ； L.凝胶电泳检测，确定RNA的完整性和污染情况； 步骤(I)中所述的mRNA反转录为cDNA的具体步骤如下 a.在PCR管中配制如下混合液共10μ1:总 RNA I μ I ` 50 μ M Oligo dT (18) Primer I μ IdNTPs Mixture I μ I 其余为RNase free ddH20 ;所述dNTPs Mixture中各脱氧核糖核苷三磷酸浓度为`1OmM ； b.65°C保温5min后迅速在冰上冷却2min以上； c.离心数秒钟使模版RNA和弓I物等物质的混合液聚集于PCR管底部； d.在上述PCR管中配置如下反转录反应液,总体积为20μ1:上述混合液10 μ I `5 X PrimeScript Buffer 4 μ I `40U/μ I RNase Inhibitor O. 5 μ I`200U/μ I PrimeScript Reverse Transcriptase 100 200untis其余为 RNase free ddH20 ； e.42°C 保温 30 60min ； f.70°C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增。
6.根据权利要求4所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于所述PCR扩增时所设计的引物为Cat+ :5，-GCATCGCCACTCAGACAT-3，Cat- :5’ - CGATCCGTGGGTACAGG-3’。
7.一种梅花鹿过氧化氢酶，其特征在于所述梅花鹿过氧化氢酶是由如权利要求1-3中任一所述的梅花鹿过氧化氢酶基因编码翻译而成。
8.如权利要求7所述的一种梅花鹿过氧化氢酶的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤 (i)梅花鹿过氧化氢酶基因的亚克隆； ( )梅花鹿过氧化氢酶基因的表达采用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达，构建梅花鹿过氧化氢酶基因的重组表达载体，转化毕赤酵母菌后，提取毕赤酵母菌基因组DNA，PCR验证转化结果，培养阳性毕赤酵母菌，发酵并用甲醇诱导梅花鹿过氧化氢酶的表达；对表达产物进行功能测定，最终确定成功获得梅花鹿过氧化氢酶；构建重组载体所选用的质粒是pPICZaC，所述毕赤酵母菌为GSl 15。
9.根据权利要求8所述的一种梅花鹿过氧化氢酶的制备方法，其特征在于所述步骤(i)中梅花鹿过氧化氢酶基因的亚克隆所用的引物如下Pcat2+ CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATCPcat- TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT ； 所述引物Pcat2+带有Clal酶切位点，即上述序列的下划线部分； 所述引物Pcat-带有Xbal酶切位点，即上述序列的下划线部分。
10.根据权利要求8所述的一种梅花鹿过氧化氢酶的制备方法，其特征在于所述步骤( )中重组表达载体转化毕赤酵母菌的具体步骤如下 a.将毕赤酵母宿主菌株于100mlYPD培养基中振荡培养至0D600为1. 1-1. 3 ； b.1500g-1700g离心5min收集菌体，将离心管倒置在吸水纸上轻拍数下，充分弃上清； c.加入IOOml冰浴的高纯水，于振荡器上振荡混匀； d.离心，弃上清，再加IOOml高纯水洗涤一次； e.离心，弃上清，加20ml冰浴的IM山梨醇洗涤一次； f.离心,弃上清,菌体置于冰浴中，加入约100- 200 μ I山梨醇，并混匀； g.吸取100- 150 μ I感受态细胞添加到线性化的DNA中，用移液器吹吸混匀； h.将上述样品于冰浴中静置5min,转移入2mm电转化杯中，放置于BioradMicropluser电转仪上,使用仪器内嵌的预设毕赤酵母电转化程序“Pic”电击一次；i.立即向电击杯中加入Iml山梨醇，将全部液体转入IOml离心管中，30°C静置lh，然后加入Iml YPD培养基，300C，200rpm振荡培养lh，取50 — 200 μ I菌液涂布于添加有终浓度100 μ g/mL的Zeocin抗生素的YPD培养基平板；培养3天，至单菌落形成；所述YPD培养基配方为1%酵母浸膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖； 所述毕赤酵母菌基因组DNA的提取步骤如下使用裂解液提取基因组，裂解液配方2% (v/v) Triton X-100，1% (w/v) SDS, IOOmM NaCl, ρΗ8. O IOmM Tris base, ρΗ8· O ImMEDTA ;具体实验操作步骤如下 a.过夜培养IOml重组毕赤酵母菌液至0D600值为2_3； b.2000rpm/min离心沉降细胞，然后以等体积的无菌蒸馏水洗涤，所述无菌蒸馏水预先4°C保存； c.将细胞沉淀在200μ I裂解缓冲液中重悬，然后加入约200 μ I的1:1苯酚/氯仿混和液； d.漩涡震荡l_2min； e.加入200μ I的TE缓冲液，倒置混合6-10次； f.在微型离心机中以13000rpm/min的速度离心样品5min； g.将上层的水相转移到干净的微量离心管中； h.加入400μ I氯仿；1.同步骤f离心； j.将上层的水相转移到新的微量离心管中； k.加Iml乙醇,翻转混勻；1.在微型离心机中以13000rpm/min的速度离心2min ； m.弃上清液，用Iml的70%乙醇洗涤沉淀； n.完全弃去上清液，并将沉淀在室温下干燥； ο.在400 μ I含有终浓度为2 μ g/ml的核糖核酸酶的TE缓冲液中重悬浮沉淀； p. 37°C孵育 IOmin ； q.重复步骤i一 I ； r.在50 μ I TE缓冲液中重悬沉淀； 所述毕赤酵母菌发酵诱导梅花鹿过氧化氢酶表达的具体步骤为 a.将Zeocin抗性平板上的毕赤酵母单克隆接种于5mL的YPD培养基中，于恒温摇床上30°C，220rpm振荡培养12 16h ； b.将上述培养液接种于50mL的YP培养基中，30°C，220rpm振荡培养2h； c.向培养物中添加100%的甲醇，使其终浓度达到O.5% ；甲醇每隔24h添加一次； d.每隔24小时取出ImL的培养液，冷冻于_80°C冰箱； e.发酵培养96h后，结束发酵，取出培养液，离心，去除沉淀，SDS-PAGE电泳分析上清液； 所述YP培养基配方为1%酵母浸膏，2%蛋白胨； 所述表达产物进行功能测定的步骤如下 使用市售双氧水进行活性的定性检测取一定体积的上述表达后的发酵上清液，滴加入双氧水中；以未诱导的不添加甲醇的重组子发酵上清液、空宿主毕赤酵母GS115的发酵上清液以及空白 的YP液体培养基为对照，取同体积滴加入双氧水中，观察现象；有过氧化氢酶活性的样品组产生气泡。
全文摘要
本发明提供了一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法，本发明提供的梅花鹿过氧化氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，梅花鹿过氧化氢酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明成功克隆得到此前未见报道的梅花鹿过氧化氢酶基因序列。通过序列比对，可以知道，梅花鹿过氧化氢酶基因在哺乳动物中是高度保守的，通过生物信息学分析，可知该基因长度适中，带有典型的过氧化氢酶结构域，对应的蛋白质序列具有较好的亲水性，适合异源重组蛋白表达，之后采用毕赤酵母表达系统，成功实现了该基因的重组表达。梅花鹿过氧化氢酶的获得无论是在工业化应用领域，还是探究其药理价值，都具有重要意义。
文档编号C12N9/08GK103060344SQ20131003180
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者林峻 申请人:福州大学