专利名称：用于检测分枝杆菌的引物对和标准品以及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测分枝杆菌的引物对和标准品以及它们的应用。
背景技术：
大多数分枝杆菌均为机会致病菌，常存在于自然水体、工程供水系统及室内给排水管件中。目前从环境中分离出来的分枝杆菌已经超过150多种，而且数量还在不断增多，它们可在人群中弓I起多种感染性疾病。目前，培养法是检测分支杆菌的金标法，精确可靠，但所需时间较长(4-8周)，而且很多分支杆菌是无法培养的，目前培养法计数结果只有显微镜计数结果的十分之一。荧光定量PCR (qPCR)方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法方法，具有特异性更强、灵敏度更高、检测周期更短、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点。采用实时荧光定量PCR对分枝杆菌的定量证实了这个现象。采用qPCR定量基因拷贝数和细胞数的结果通常比培养法高10倍左右，与显微镜计数法的结果相一致。此外，用于分枝杆菌检测的实验室检测方法还包括气相质谱分析、液相质谱分析。气相质谱和液相质谱分析需要昂贵的仪器，不适合常规检测。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测分枝杆菌的引物对和标准品以及它们的应用。本发明提供了用于辅助鉴定分枝杆菌的特异引物对，由序列表的序列2所示的单链DNA片段和序列表的序列3所示的单链DNA片段组成。本发明还保护所述特异引物对在制备辅助鉴定分枝杆菌的试剂盒中的应用。本发明还保护一种辅助鉴定分枝杆菌的试剂盒，包括所述特异引物对和标准品；所述标准品为序列表的序列I所示的双链DNA分子或含有序列表的序列I所示的双链DNA分子的质粒。所述含有序列表的序列I所不的双链DNA分子的质粒具体可为将序列表的序列I所示的双链DNA分子插入pMD' 18-T Vector,得到的重组质粒pMD_18T_hsp65。本发明还保护所述特异引物对和所述标准品在制备辅助鉴定分枝杆菌的试剂盒中的应用。本发明还保护所述引物对在辅助鉴定分枝杆菌中的应用。本发明还保护一种辅助鉴定分枝杆菌的方法，包括如下步骤:以待测细菌的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到365±5bp (具体可为365bp)的PCR扩增产物待测细菌为候选的分枝杆菌，如果没有得到365±5bp(具体可为365bp)的PCR扩增产物待测细菌为候选的非分枝杆菌。本发明还保护所述特异引物对或所述试剂盒在定量检测分枝杆菌中的应用。本发明还保护所述特异引物对或所述试剂盒在检测待测水样中分枝杆菌的含量中的应用。
本发明还保护一种检测待测水样中的分枝杆菌含量的方法，包括如下步骤:(I)按照如下方法制作标准曲线；以所述标准品为模板，采用所述特异引物对进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的标准品的拷贝数和实时荧光定量PCR得到的Ct值制作标准曲线方程；(2)从待测水样中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行实时荧光定量PCRJf Ct值代入所述标准曲线方程，得到待测水样中的分枝杆菌含量。所述实时荧光定量PCR的初始体系中，所述特异引物对的每条引物的浓度具体可为0.2μπι01/1。所述实时荧光定量PCR的反应程序中，退火温度具体可为56° C。所述实时荧光定量PCR的反应程序具体可为:(95° C、5min)Xl个循环；(95° C、5s，56° C退火30s、72。C、30s) X40 个循环。以上任一所述的分枝杆菌具体可为偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、迪氏分枝杆菌和牦牛分枝杆菌中的至少一种。本发明提供了针对分枝杆菌特异性良好的特异引物对，并提供了对于分枝杆菌菌株具有通用性的标准品，可以辅助鉴定分枝杆菌，也可以借助荧光定量检测待测液体样本或待测固体样本溶液中的分枝杆菌含量，具有灵敏度高、特异性好、检测快速等优点、且可以检测到无法培养的细菌，从而检测结果更为准确。本发明为饮用水安全、再生水安全等提供了技术支持。
图1为实时定量PCR中优化退火温度的结果。图2为实时定量PCR中优化初始体系中的引物浓度的结果。
图3为实施例3的特异性实验中的扩增曲线。图4为实施例3的特异性实验中的琼脂糖凝胶电泳图。图5为实施例4中的扩增曲线。图6为实施例4中的标准曲线。图7为实施例4中的溶解曲线。图8为实施例4中的琼脂糖凝胶电泳图。图9为实施例6中步骤二和步骤三的方法检测分枝杆菌浓度的比较。图10为实施例6中的溶解曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、特异引物对和标准品质粒的制备一、标准品质粒的制备1、对NCBI中所有分枝杆菌的hsp65基因序列进行分析，基于分析结果，得到序列表的序列I所示的DNA片段。序列I与NCBI中各个分枝杆菌的hsp65基因的同源性均在98%以上，与其它基因没有同源性，部分同源性比对结果见表I。表I序列I与部分分枝杆菌的hsp65基因的同源性比对结果
权利要求
1.关于辅助鉴定分枝杆菌的引物对，由序列表的序列2所示的单链DNA片段和序列表的序列3所示的单链DNA片段组成。
2.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴定分枝杆菌的试剂盒中的应用。
3.一种辅助鉴定分枝杆菌的试剂盒，包括权利要求1所述引物对和标准品；所述标准品为序列表的序列I所不的双链DNA分子或含有序列表的序列I所不的双链DNA分子的质粒。
4.权利要求1所述引物对和标准品在制备辅助鉴定分枝杆菌的试剂盒中的应用；所述标准品为序列表的序列I所不的双链DNA分子或含有序列表的序列I所不的双链DNA分子的质粒。
5.按权利要求3所述的试剂盒或如权利要求4所述的应用，其特征在于:所述含有序列表的序列I所示的双链DNA分子的质粒为将序列表的序列I所示的双链DNA分子插入\Μ 18-T Vector，得到的重组质粒 pMD-18T-hsp65。
6.权利要求1所述引物对在辅助鉴定分枝杆菌中的应用。
7.一种辅助鉴定分枝杆菌的方法，包括如下步骤:以待测细菌的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果得到365±5bp的扩增产物待测细菌为候选的分枝杆菌，如果没有得到365±5bp的扩增产物待测细菌为候选的非分枝杆菌。
8.权利要求1所述引物对或权利要求 3所述试剂盒在定量检测分枝杆菌中的应用。
9.权利要求1所述引物对或权利要求3所述试剂盒在检测待测水样中分枝杆菌的含量中的应用。
10.一种检测待测水样中的分枝杆菌含量的方法，包括如下步骤: (1)按照如下方法制作标准曲线；以所述标准品为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的标准品的拷贝数和实时荧光定量PCR得到的Ct值制作标准曲线方程；所述标准品为序列表的序列I所示的双链DNA分子或含有序列表的序列I所不的双链DNA分子的质粒； (2)从待测水样中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行实时荧光定量PCRJfCt值代入所述标准曲线方程，得到待测水样中的分枝杆菌含量。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测分枝杆菌的引物对和标准品以及它们的应用。本发明提供的引物对由序列2所示的DNA和序列3所示DNA组成。本发明还提供了一种标准品，为序列表的序列1所示的双链DNA分子或含有序列表的序列1所示的双链DNA分子的质粒。本发明提供了针对分枝杆菌特异性良好的特异引物对，并提供了对于分枝杆菌菌株具有通用性的标准品，可以辅助鉴定分枝杆菌，也可以借助荧光定量检测待测液体样本或待测固体样本溶液中的分枝杆菌含量，具有灵敏度高、特异性好、检测快速等优点、且可以检测到无法培养的细菌，从而检测结果更为准确。本发明为饮用水安全、再生水安全等提供了技术支持。
文档编号C12N15/11GK103088139SQ20131003178
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者李丹, 林怡雯, 何苗 申请人:清华大学