专利名称：一株柴油降解酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株柴油降解酵母菌株一解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica) KML,及其在降解柴油中的应用。
背景技术：
石油是目前环境中广泛存在的污染物之一，包括汽油、煤油、柴油、润滑油、石蜡和浙青等，是多种烃类(正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃)和少量其他有机物。随着经济的发展，人类对能源的需求不断扩大，石油已成为人类最主要的能源之一。随着石油产量和需求的不断提高，冶炼、储存、运输等环节泄漏所造成的水体、土壤和大气等环境污染相应突出。石油进入土壤后与土粒粘连，土壤结构被破坏，降低土壤的透气性和渗水性。目前，国内外石油污染土壤修复技术按其性质可分为3种:物理方法、化学方法和生物方法。石油污染的生物修复，是指利用处理系统中生物(主要是微生物)的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其无害化的过程，其最终产物是C02、H2O等物质。与物理、化学修复技术相比，具有多种优点:成本低；对人和环境造成的影响小；污染物氧化完全。微生物的生物降解效果受许多因素的影响，如温度，PH值，营养物，氧，培养基组成，污染物的浓度和生物利用度等。关于石油类降解微生物已有一些报道，但符合实际应用要求的菌株还有待不断的开发和研究。为研究适合非洲本土环境的石油类降解微生物，本发明从来自喀麦隆未受柴油污染土壤中，筛选分离出高效柴油降解酵母，分析了影响其降解能力的几种因素，为进一步应用打下基础。
发明内容
本发明目的是提供一株高效柴油降解酵母一解脂耶罗维亚酵母(Yairowialipolytica) KML 及其应用。
本发明采用的技术方案是:一株柴油降解酵母菌株-解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)KML,保藏
于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2013年I月10日，保藏编号为 CCTCC No:M2013011o该菌株从喀麦隆未被柴油污染的土壤样品中分离获得，经形态和生理生化特征鉴定及5.8S rDNA-1TS序列分析，该酵母菌株属于解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)。GC-MS分析可知,该菌种对柴油有很好的降解能力。本发明还涉及所述的解脂耶罗维亚酵母KML在降解柴油中的应用。优选的，所述降解在20 37°C、pH6.(Tl0.0条件下进行。更为优选的，所述降解在30°C、pH9.0条件下进行。具体的，所述降解可在无机盐培养基中进行，添加适量营养物和表面活性剂可以促进生物降解，优选在无机盐培养基中添加lg/L酵母膏和10g/L鼠李糖脂。本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一株可高效降解柴油的酵母菌，为柴油的生物降解提供了基础。
图1为基于5.8S rDNA-1TS构建的系统进化树；图2为初始pH (A)和培养温度(B)对柴油降解率的影响；图3为氮源(A)和鼠李糖脂(B)对降解率的影响；图4为柴油组分及其降解产物气相色谱-质谱图；A、对照；B、培养5天；C、培养 9 天。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:柴油降解菌株的筛选与鉴定材料与方法:1.菌株的来源降解柴油的菌株从来自喀麦隆的土壤中分离得到。2.培养基的配制无机盐培养基(MS M)=NH4Cl lg，K2HPO4Ig, Na2S042g，MgSO4.7H201g，CaCl2.6H200.0lg,蒸懼水1L, pH=6.0。121°C高压蒸汽灭菌20min。无机盐含柴油固体培养基:无机盐培养基，琼脂15 20g,柴油lmL。查氏固体培养基(Czapek agar medium):K2HPO4Ig;KCL0.5g,蔗糖 30g, FeSO40.0lg;MgSO40.5g, NaN032g,蒸馏水 1L，ρΗ6.8，琼月旨15 20g, 121°C高压蒸汽灭菌20min。3.仪器UV-1000紫外分光光度计；双层全温恒温培养摇床；AgilentTechnologies6890-5975气相色谱-质谱法联用仪等。4.柴油降解菌株的筛选吸取ImL 土壤悬液涂布于查氏固体培养基,30°C倒置培养72h。在培养后,将菌株在40%甘油-20°C保存为进一步利用。将甘油保藏菌重新转接到以柴油为唯一碳源的无机培养基中，30°C，180rpm摇床培养5d，待培养基变混浊后，用无机盐含柴油固体培养基培养，将纯化菌株于试管斜面培养后4°C保藏。5.柴油降解菌株的鉴定:对分离得到的柴油降解菌株应用5.8S rDNA-1TS序列分析进行酵母的分子鉴定，结合传统的鉴定方法，根据微生物的形态特征和生理生化特征，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》及相关文献，最终将菌株鉴定到属。酵母总DNA提取，用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取酵母的DNA。用PCR扩增仪进行扩增反应，体系总体积为50 μ I。采用通用引物(ITS1:5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增供试菌株的ITS1-5.8S rDNA-1TS片段，送至上海英俊生物技术公司测序。将测序结果进行BLAST比对分析并用软件MEGA5.0构建系统进化树。结果:
分别采用常规的土壤稀释法和平板涂布法从来自喀麦隆地区的土壤中分离出一高效柴油降解菌株，在含柴油平板和摇瓶中都能很好的生长。将菌接入液体柴油无机盐培养基摇床培养2天后，培养基开始逐渐变成乳白色，浮在液面上的柴油逐渐减少。通过稀释涂平板，最终得到一株能利用石油烃的酵母菌，命名为KML。将筛选出的进行菌体形态特征，菌落圆形，乳白色，大小为1.7^4.2X2.3 7.7 μ m。菌株的生理生化试验结果见表I。表1:柴油降解菌株KML的生理生化特征
权利要求
1.一株柴油降解酵母菌株-解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)KML,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2013年I月10日，保藏编号为 CCTCC No:M2013011o
2.权利要求1所述的解脂耶罗维亚酵母KML在降解柴油中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在2(T37°C、pH6.(Tl0.0条件下进行。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在30°C、pH9.0条件下进行。
全文摘要
本发明提供了一株柴油降解酵母菌株——解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)KML，及其在降解柴油中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2013年1月10日，保藏编号为CCTCC NoM2013011。GC-MS分析可知，该菌种对柴油有很好的降解能力。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一株可高效降解柴油的酵母菌，为柴油的生物降解提供了基础。
文档编号C12N1/20GK103114061SQ20131003171
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者钟卫鸿, 李烜桢, 邱乐泉, 玛丽, 谢观莲 申请人:浙江工业大学