专利名称：利用hva1基因的半定量pcr法鉴定青稞抗旱性的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种利用HVAl基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法。
背景技术：
高等植物胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesi s abundant proteins,LEA proteins)是种子发育后期产生的一类小分子特异多肽，这类蛋白与植物耐脱水性密切相关，受植物的发育阶段、ABA和脱水信号的调节(Sun et al.，2003 ;Ramanjulu，2002)。自1981年首次在胚胎发育后期的棉花子叶中分离到了一组丰富表达的mRNA，命名为IeamRNA,同时还分离到其表达产物，即LEA蛋白(Dure et al.,1981),目前已从各种植物中发现了许多新的LEA蛋白。根据蛋白中氨基酸序列的同源性及一些特殊基元序列，可将LEA蛋白分为6组(Bray, 1993 ；ffise et al.，2004 ;张改娜等，2005)。在LEA蛋白基因中LEA2蛋白基因和LEA3蛋白基因是麦谷类作物中研究最多的2类与抗旱和抗盐有关的基因(Riedand Walker-Simmons, 1993 ；Suprunova et al.,2004)。来自普通大麦(Hordeum vu IgareL.)的HVAl基因编码大麦类群第3组LEA蛋白(LEA3蛋白)，通常含有多拷贝的11个氨基酸构成的保守基元序列(TAQAAKEKAGE)，该基元序列可形成兼性α-螺旋结构，在植物细胞脱水时提供疏水区的亲水表面(Dure，1993 ;俞嘉宁，2002 ;Choi，1999)。大量研究表明，LEA蛋白在植物耐受干旱和盐胁迫过程中发挥着重要的功能。Xu(1996)和Sivamani (2000)等通过转基因分析表明，来源于大麦的L EA类基因HVAl过表达后可以显著提高转基因水稻和小麦的抗旱及耐 盐能力，这项研究为支持LEA蛋白在植物抗水分和盐胁迫时起保护作用的假说提供了直接的证据。余嘉宁(2005)等从小麦中克隆了 L EA3基因，转入酵母系统表达后与对照相比，其抵抗干旱和低温胁迫能力显著增强。该基因的抗旱、耐盐功能在烟草(李楠，2007)和桑树(Lai S et al，2008)中也得到了实验证实。但也有相反报道，如:从耐脱水复活植物Craterostigma Plantagineum分离出一个第3组LEA基因，PcC3_06,将其转到烟草中高效表达，但转基因烟草在抗旱性方面并没有得到提高(Bimei et al.，1992)。因此对于第3组LEA蛋白基因的在青稞细胞中的表达及其与与抗旱性的关系还有待进一步的深入研究。目前抗旱性鉴定多采用生理生化的方法，这种方法比较繁琐，仅靠一两个生理指标很难鉴定植物的抗旱性，因而耗时比较长，而且没有固定的生理生化指标可以确定植物的抗旱性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用HVAl基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法。本发明的技术方案如下:利用HVAl基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法，包括以下步骤:
(I)青稞两叶期时开始用0-30%的PEG胁迫处理4天；(2)采用上海生工总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒对叶片进行总RNA的提取及逆转录；(3)以大麦肌动蛋白(β-Actin)基因为内参基因对目标基因HVAl的扩增，引物如下:
权利要求
1.一种利用HVAl基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)青稞两叶期时开始用0-30%的PEG胁迫处理4天； (2)采用上海生工总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒对叶片进行总RNA的提取及逆转录; (3)以大麦肌动蛋白(β-Actin)基因为内参基因对目标基因HVAl的扩增；引物如下:
全文摘要
本发明公开了一种利用HVA1基因的半定量PCR法鉴定青稞抗旱性的方法，包括以下步骤(1)青稞两叶期时开始用0-30％的PEG胁迫处理4天；(2)采用上海生工总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒对叶片进行总RNA的提取及逆转录；(3)以大麦肌动蛋白(β-Actin)基因为内参基因对目标基因HVA1的扩增；(4)采用Gel-pro软件对所得HVA1基因相对表达量图进行二次函数的拟合；(5)根据拟合曲线计算HVA1基因的相对最高表达量或者对应的PEG浓度，其数值大者为抗旱性强的青稞品种。
文档编号C12Q1/68GK103184284SQ20131009132
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者姚晓华, 吴昆仑, 蒋礼玲, 王显萍, 任又成 申请人:青海省农林科学院