专利名称：一种核酸适配体及其衍生物、核酸适配体的筛选方法及在检测人胆管癌细胞株中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测人胆管癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术：
核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能特异结合祀物质的单链寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸适配体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，成本低；可进行标记；稳定性好，易于保存等优点。核酸适配体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适配体具有广泛的应用前景。人胆管癌细胞株QBC-939属于肝门部胆管癌(HCCA)，肝门部胆管癌是胆道系统常见的恶性肿瘤。肝门部胆管癌因其发生部位特殊、呈浸润性生长及与肝门部血管关系密切等特点给手术切除造成极大的困难。长期以来，肝门部胆管癌被认为是无法用手术根治性切除的癌肿。近20年来，随着影像学和手术技术的进步，使肝门部胆管癌的诊断和治疗取得重大进展，但肝门部胆管癌有关的发病原因或危险因素尚不清楚，因此筛选出它的aptamer对于临床检测、肿瘤标志物的寻找、肿瘤发病机理的发现都有很重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体及其衍生物，还相应提供前述核酸适配体的筛选方法和应用。 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包含以下序列1、序列2中任意一条序列所示的DNA片段:
序列1:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAGAAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’ ；
序列2:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGGATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。上述的核酸适配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述的核酸适配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列上可结合有生物素、地高辛、荧光物质(如FITC)、纳米发光材料或酶标记(甚至连接上放射性和治疗性物质等)。
以上不论是经部分取代或者经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于检测人胆管癌细胞株QBC-939。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种:
(1)与上述所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可将上述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸);
(2)与上述所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
(3)上述所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种核酸适配体衍生物，所述衍生物是上述所列核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述所列核酸适配体改造成的相应肽核酸。以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即都可用于检测人胆管癌细胞株QBC-939。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤:
(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:
随机文库 RS40:5’ -AGAAGGATGGAGAGGAGCAC(40N)GTCCTCGTCTCCTTCCTACT ；
5，引物:5，-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’ ；3，引物:5，-Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3，；
(2)Cel1-SELEX筛选:培养人胆管癌细胞株QBC-939细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与上述随机序列在冰上孵育后，弃溶液；再将上述随机文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的QBC-939细胞在冰上孵育；孵育完成后弃掉孵育瓶内的液体，并用缓冲液冲洗孵育瓶，然后用无菌水刮取孵育瓶内的QBC-939细胞并置于沸水浴中加热，加热完成后再离心取上清，即为筛选所得的QBC-939特异核酸适配体文库；
(3)PCR扩增文库:将步骤(2)中筛选所得的QBC-939特异核酸适配体文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (4)制备DNA单链文库:将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将步骤(3)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，洗涤后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清；将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库；
(5)重复筛选:将步骤(4)得到的DNA单链文库替代步骤(2)中的随机文库，并重复上述步骤(2) (4)的过程至少一次；
(6)阴性筛选:以人肝癌细胞SMMC-7721为对照，将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为:培养人肝癌细胞SMMC-7721至基本铺满瓶底，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人肝癌细胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液；
(7)多轮筛选:将步骤(6)所收集的溶液替代步骤(5)中的DNA单链文库，继续重复上述步骤(5) 步骤(6)的操作过程至少一次；重复筛选过程中用流式细胞术监测DNA单链文库对QBC-939细胞识别能力的增强情况，直至DNA单链文库对QBC-939细胞的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，最终得到核酸适配体。上述的筛选方法中，所述PCR扩增时的工艺条件优选为:94°C 3min，94°C 30sec,58.5V 30sec,72°C 30sec，经13轮循环轮数(可在PCR扩增前进行循环轮数的优化，选取能够满足条带亮度及特异性好的循环轮数作为PCR反应循环数)，720C 3min。上述的筛选方法，所述步骤(2)中，与随机序列在冰上孵育的时间优选控制在15min ;与所述QBC-939细胞在冰上孵育的时间优选控制在30min，所述沸水浴中的加热时间优选控制在lOmin。上述的筛选方法，所述步骤(4)中，与琼脂糖微球在常温下孵育的时间优选控制在
0.5h,加入碱液后的反应时间优选控制在15min。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在识别人胆管癌细胞株QBC-939或者制备检测人胆管癌细胞株QBC-939的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明通过SELEX筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。采用本发明的核酸适配体进行胆管癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，由于核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。本发明的可识别人胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体均能特异性且高亲和力的识别人胆管癌细胞株QBC-939，且结合能力强，解离常数均在纳摩尔范围 以内。利用本发明的核酸适配体对其结合的靶分子进行研究，可以得到其肿瘤标志物，这对于肝癌的早期检测具有重要意义，在肝癌的诊断方面有良好的应用前景。
图1为本发明实施例中利用Valfold软件模拟的FAM_yll9核酸适配体的二级结构示意图。图2为本发明实施例中利用Valfold软件模拟的FAM_yl23核酸适配体的二级结构示意图。图3为本发明实施例中流式细胞仪检测两条核酸适配体对人胆管癌细胞株QBC-939的结合能力的检测结果。图4为本发明实施例中流式细胞仪检测两条核酸适配体对人肝癌细胞株SMMC-7721的结合能力的检测结果。图5为本发明实施例中激光共聚焦检测两条核酸适配体对人胆管癌细胞株QBC-939的结合能力及特异性的检测结果(图中的两组图片，一个是荧光通道的成像，一个是荧光通道和明场的叠加成像，是同一个照片不同通道的信息)。图6为本发明实施例中流式细胞仪测定FAM_yll9核酸适配体结合QBC-939的解离常数绘制曲线。图7为本发明实施例中流式细胞仪测定FAM_yl23核酸适配体结合QBC-939的解离常数绘制曲线。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例:
一种可用于检测人肝门部胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体，该核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列I 序列2中的任意一条序列所示的DNA片段(5’端标记有FAM):序列 lFAM_yll9:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAGAAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’ ；
序列 2FAM-yl23:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGGATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。序列3FAM-RS80:
5，-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3，
注:N代表A、T、G、C中任一碱基(序列3作为对照序列，即阴性探针，也即图3、图4中的 Random)。上述的各核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述各核酸适配体的核苷酸序列上可结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标。上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架还可衍生出可用于检测人肝门部胆管癌细胞株QBC-939的硫代磷酸酯骨架，上述核酸适配体还可改造成的相应肽核酸，还可衍生出的其他的核酸适配体，衍生出的核酸适配体的核苷酸序列可以为以下三种序列中的任意一种:
Cl)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可将上述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)；
(2)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
(3)上述所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。本实施例的上述两条可用于检测人胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体主要采用以下筛选方法筛选得到，具体包括以下步骤:
1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物。随机文库 RS40: 5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC (40N) GTCCTCGTCTCCTTCCTACT ；
5，引物:5，-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’
3，引物:5’ -Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3，。2.Cell-SELEX筛选获得QBC-939特异核酸适体文库。2.1细胞预处理:1640培养基加15%小牛血清培养人胆管癌细胞株QBC-939细胞至铺满瓶底95%，去除培养基后用IOmL washing buffer洗涤，与ImL含InM随机序列的binding buffer在冰上孵育15min,弃溶液；
2.2孵育:用30(^1^ binding buffer溶解IOnmol上述的随机文库,95°C恒温振荡5min,迅速放入冰中；在随机文库中补充binding buffer至终体积为ImL,与步骤2.1中已经处理好的QBC-939细胞在冰上孵育30min。2.3解离:孵育完成后倒出孵育培养瓶内的液体，用IOmL washing buffer洗涤孵育培养瓶中的细胞；用ImL无菌水刮取孵育培养瓶内细胞，置于EP管中沸水浴加热lOmin，12000 rmp离心取上清，即为筛选所得QBC-939的特异核酸适配体文库。3.进行PCR扩增文库:取100 μ L筛选所得的QBC-939特异核酸适配体文库进行常规 PCR 扩增，扩增条件为:94°C 3min,94°C 30sec,58.5°C 30sec,72°C 30sec，经合适循环轮数，72°C 3min ;第一轮筛选后需将全部所得的QBC-939特异核酸适体文库预扩增10个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。4.制备DNA单链文库:将100 μ L链霉亲和素修饰的琼脂糖微球5000rmp离心去上清，再用500 μ L PBS洗涤，离心去上清；重复洗涤一次。将步骤3中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育半小时，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面；5000rmp离心去上清，用PBS离心洗涤两次；然后加入200mM NaOH溶液500 μ L至琼脂糖微球中用于双链DNA的变性处理，常温反应15min, 5000rmp离心5min,收集上清；除盐柱用IOmL无菌水洗漆后,加入碱变性后收集得到的上清液，自然滴完。加入ImL无菌水，收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库。5.重复筛选:将步骤4得到的DNA单链文库替代步骤2.2中的随机文库，重复上述步骤2 4所示的阳性筛选(即步骤2)、PCR扩增及制取单链DNA文库过程。6.阴性筛选:在 第三轮筛选及以后，以人肝癌细胞SMMC-7721为对照，将步骤5后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为:培养人肝癌细胞SMMC-7721至铺满瓶底95%，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将步骤5筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人肝癌细胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液。7.多轮筛选:将步骤6所收集的溶液替代步骤5中的DNA单链文库，继续重复进行上述步骤5 6的操作过程，在第一轮筛选以后，用于细胞孵育筛选的文库量约为200pmol，从第三轮筛选开始，阳性筛选细胞预处理的孵育溶液中需加入胎牛血清，随着筛选轮数的增加，添加量从5%增加至20% ;重复筛选过程中用流式细胞术监测所得DNA单链文库对QBC-939细胞识别能力的增强情况，直至13轮筛选后DNA单链文库对QBC-939细胞的识别能力满足要求，将所得产物(产物中含有23条序列)经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到富集度高的两条序列，这两条序列即为上述本实施例的可用于检测人胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体。考察1:用Valfold软件对该本实施例两条序列进行二级结构模拟。用Valfold软件对本实施例的两条序列进行二级结构模拟后的结构示意图如图1 图2所示。考察2:流式细胞仪检测本实施例两条核酸适配体与QBC-939细胞的结合效果及其特异性。将处于对数期生长的QBC-939细胞用无酶消化液消化后打散，2000rpm离心去上清，用5mL PBS离心洗涤两次。细胞与含250nM DNA序列(包括序列lFAM_yll9、序列2FAM-yl23和序列3FAM-RS80阴性探针Random)的binding buffer冰上孵育半小时，2000rmp 去上清，用 ImL binding buffer 洗漆两次,最后加入 400 μ L binding buffer,用于流式细胞仪检测，以人肝癌细胞株SMMC-7721作为对照，检测结果如图3、图4所示。由图
3、图4流式细胞术的检测结果证明，本实施例的yll9、yl23两条核酸适体均对靶细胞人胆管癌细胞QBC-939具有较强的特异性识别能力，而对对照细胞人肝癌细胞株SMMC-7721无识别，与阴性探针(即上述的序列3:FAM-RS80)也无识别。考察3:激光共聚焦检测本实施例两条核酸适配体与QBC-939细胞的结合效果及其特异性。在激光共聚焦小皿中分别培养人胆管癌细胞QBC-939和人肝癌细胞株SMMC-7721，倒出培养基，用PBS将细胞洗涤三次。细胞与含250nM上述本实施例两条核酸适体的binding buffer冰上孵育半小时，倒出反应液,用binding buffer洗漆两次，最后加入200yL binding buffer用于检测,检测结果如图5所示。检测结果表明:本实施例的两条核酸适体均能识别原位生长状态下的靶细胞QBC-939，而不能识别对照细胞SMMC-7721ο考察4:流式细胞仪测定本实施例两条核酸适配体对QBC-939细胞的解离常数。特异性检测的操作与考察2的操作基本一致，平行配制不同浓度的含本实施例核酸适配体的反应液与QBC-939细胞孵育，以流式细胞仪的荧光几何平均值为纵坐标，以核酸适配体的浓度为横坐标，由Y=Bmax*X/(Kd+X)方程模拟曲线，得到本实施例两条核酸适配体的解离常数绘制曲线如图6 图 7，由此可得到解离常数Kd如下表I所示。图6 图7及表I的检测结果表明:yll9、yl23与靶细胞QBC-939细胞的结合能力很强，解离常数均在纳摩尔级别。表1:解离常数结果 ^_
权利要求
1.一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包含以下序列1、序列2中任意一条序列所示的DNA片段: 序列1:5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAGAAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’ ； 序列2:5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGGATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
3.根据权利要求 1或2所述的核酸适配体，其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。
4.一种核酸适配体，其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种: (O与权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)与权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列； (3)权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
5.一种核酸适配体衍生物，其特征在于:所述衍生物是权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是权利要求1或2或3中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。
6.一种如权利要求1所述的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤: (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:随机文库 RS40:5’ -AGAAGGATGGAGAGGAGCAC(40N)GTCCTCGTCTCCTTCCTACT ； .5，引物:5，-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’ ； .3，引物:5，-Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3，； (2)Cel1-SELEX筛选:培养人胆管癌细胞株QBC-939细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与上述随机序列在冰上孵育后，弃溶液；再将上述随机文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的QBC-939细胞在冰上孵育；孵育完成后弃掉孵育瓶内的液体，并用缓冲液冲洗孵育瓶，然后用无菌水刮取孵育瓶内的QBC-939细胞并置于沸水浴中加热，加热完成后再离心取上清，即为筛选所得的QBC-939特异核酸适配体文库； (3)PCR扩增文库:将步骤(2)中筛选所得的QBC-939特异核酸适配体文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (4)制备DNA单链文库:将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将步骤(3)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，洗涤后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清；将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库； (5)重复筛选:将步骤(4)得到的DNA单链文库替代步骤(2)中的随机文库，并重复上述步骤(2) (4)的过程至少一次；(6)阴性筛选:培养人肝癌细胞SMMC-7721至基本铺满瓶底，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人肝癌细胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液； (7)多轮筛选:将步骤(6)所收集的溶液替代步骤(5)中的DNA单链文库，继续重复上述步骤(5) 步骤(6)的操作过程至少一次；重复筛选过程中用流式细胞术监测DNA单链文库对QBC-939细胞识别能力的增强情况，直至DNA单链文库对QBC-939细胞的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，最终得到核酸适配体。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增时的工艺条件为:94°C3min,94°C 30sec,58.5°C 30sec,72°C 30sec，经 13 轮循环轮数，72°C 3min。
8.根据权利要求6或7所述的筛选方法，其特征在于:所述步骤(2)中，与随机序列在冰上孵育的时间控制在15min，与所述QBC-939细胞在冰上孵育的时间控制在30min，所述沸水浴中的加热时间控制在IOmin ;所述步骤(4)中，与琼脂糖微球在常温下孵育的时间控制在0.5h,加入碱液后的反应时间控制在15min。
9.一种如权利要求1 4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在识别人胆管癌细胞株QBC-939或者制备检测人胆管癌细胞株QBC-939的试剂盒中的应 用。
全文摘要
本发明公开了一种核酸适配体，其序列包含序列1、序列2中任意一条序列所示的DNA片段。本发明的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明还公开了该核酸适配体的筛选方法，先合成随机单链DNA文库和引物，再Cell-SELEX筛选，PCR扩增文库，制备DNA单链文库，最后经重复筛选、阴性筛选和多轮筛选得到核酸适配体。本发明的核酸适配体及其衍生物可在识别人胆管癌细胞株QBC-939或者制备检测人胆管癌细胞株QBC-939的试剂盒中应用，具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。
文档编号C12Q1/04GK103205431SQ20131009911
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者王柯敏, 羊小海, 叶玲, 郭秋平, 谭誉宇, 何晓晓 申请人:湖南大学