水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于转基因【技术领域】，具体为水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用。本发明利用来自普通野生稻的Bph28基因改良水稻抗褐飞虱性状,将栽培稻中的Bph28等位显性基因转化抗虫品种，覆盖隐性基因Bph28的表达，使抗虫品种的抗虫性状发生显著弱化，提供了该基因在水稻抗虫性状方面的重要功能。本发明还涉及改良水稻的褐飞虱抗性的方法、Bph28等位基因的表达载体、其制备方法及应用。
【专利说明】水稻办/^<9基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因【技术领域】，具体涉及基因的一种新的应用。本发明还涉 及基因的的表达载体和一种改良水稻抗褐飞虱性状方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界主要粮食作物，控制各种的水稻病虫害是亟待解决的严峻问题。在草 食性水稻害虫中，对产量破坏性最强的就是褐飞虱。轻度的褐飞虱感染会导致作物株高降 低，生长活力受抑，分蘖数亦受到抑制。而严重的褐飞虱感染会使作物完全枯萎，产生"叶蝉 烧"现象。褐飞虱也可以成为水稻草矮病毒和水稻锯齿叶矮缩病毒的传播载体，在一些区域 造成严重的疾病传播。
[0003] 近年来，褐飞虱感染问题在亚洲地区日渐严峻，农民多依赖化学杀虫剂来控制虫 害，费工费时，极大的加重了环境的负担。最经济有效且环保可持续的虫害控制方法，是培 育对褐飞虱具有广泛抗性的水稻品种并加以推广。多数研究表明，具有抗性的水稻品种能 够抑制虫害的重量增长，并且大范围的几个世代后，可以显著降低褐飞虱的种群水平。
[0004] 迄今为止，有27个褐飞虱抗性基因在水稻栽培种及野生种中进行了定位，仅有一 例被精确克隆到，水稻抗虫性的分子机理也不甚明了。而且，对于褐飞虱的抗性资源大多来 自陆生籼稻，而来自粳稻的种质资源十分有限。同时，已有的提供抗性的野生稻品系均非栽 培稻的AA基因组背景，因此在基因渗入之后，由于缺少与其原有的非AA基因组遗传背景的 互作，转基因的抗性特征大大减弱。因此，发掘来自普通野生稻的新的抗性资源中的抗性基 因十分重要。在未来，通过多基因互作来抵制褐飞虱的抗性也是十分重要的方向。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提出水稻功基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用及方 法。
[0006] 本发明利用来自普通野生稻的基因改良水稻抗褐飞虱性状。实施例中，将 栽培稻中的等位显性基因转化抗虫品种，覆盖隐性基因3#1的表达，使抗虫品种的 抗虫性状发生显著弱化，提供了该基因在水稻抗虫性状方面的重要功能。
[0007] 本发明提供了 基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用。
[0008] 例如，将你力忽基因转化水稻品种，以改良水稻抗褐飞虱性状。
[0009] 其中，所述的你公^基因的序列如SEQ ID NO 1所示。
[0010] 本发明可以用于培育具有褐飞虱抗性的水稻，依次包括如下步骤： (1) 构建功等位基因表达载体； (2) 功等位基因表达载体转化水稻受体； (3 )播种功等位基因转化植株。
[0011] 其中，步骤（2)中采用抗虫野生稻BPHR54为转基因水稻受体，构建功7力忽等位基 因的过表达转基因植株。
[0012] 本发明提供了改良水稻的褐飞虱抗性的一种方法，该方法依次包括如下步骤： (a) 构建功等位基因表达载体； (b) 功等位基因表达载体转化水稻受体； (c) 播种功等位基因转化植株。
[0013] 其中，步骤（b)中采用抗虫野生稻作为转基因水稻受体。
[0014] 本发明还提供了 一种功等位基因的表达载体，是在pCAMBIA1304载体35S组 成型启动子下游插入等位基因。
[0015] 上述的表达载体的制备方法，是根据基因工程的常规操作，将感虫籼稻118S的 功等位基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游。
[0016] 本发明还提供了上述的表达载体的应用，即将该表达载体应用于改良水稻抗褐飞 風性状。
[0017] 本发明所述的你力忽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明所述的 功基因还包括指编码具有水稻Bph28活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1的简 并序列。
[0018] 在本发明的另一方面，提供了一种表达水稻谷#1基因的方法，该方法包括： (a) 将基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成基因表达载 体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列有至少70%的同源性； (b) 将步骤（a)中的表达载体转入宿主细胞，形成含有功基因的重组细胞； (c) 在适合表达基因的条件下，培养步骤（b)中的重组细胞； (d) 分离出目的蛋白。
[0019] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。如，选用市售的载 体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达 载体。
[0020] 如本文所用，"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影 响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的 分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列 的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置 时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻近，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0021 ] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动 物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CH0细胞、C0S细胞等。
[0022] 本发明还包括：水稻基因的分离、克隆与转基因功能研究等。
[0023] 1)φΑ忽基因与蛋白结构组成 水稻你 Α忽基因，基因序列全长612bp，无内含子。序列如SEQ. ID Ν01.所示。cDNA genbank登录号为KC019173,该登陆编码区序列全长612bp。编码203个氨基酸，序列如 SEQ. ID N02.所示。该基因的结构与其编码的蛋白质组成如下： 水稻你基因结构见图1所示。
[0024] 蛋白结构见图2所示，含有一个B3 DNA-binding结构域。 2 )功等位基因表达载体的构建 米用 pCAMBIA1304 (Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia)为表达载体，将籼稻 118S 的 功等位基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游，得到含功等位基因的 表达载体。其结构图如图3所示。
[0025] 3)功也等位基因转化实验 采用具有高级别抗褐飞虱性状的野生稻品种BPHR54为转基因受体，构建/?等位基 因表达的转基因植株。将BPHR54成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱 导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含等位基因的经 纯化的PCAMBIA1304质粒DNA导入BPHR54愈伤组织细胞。在添加30ppm潮霉素的MS培养 基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和 生根。
[0026] 4)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测 将功等位基因转化处理的BPHR54试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取DNA采 用PCR扩放技术进行分子检测，于2011年夏获得阳性T0代植株。2011年冬，在海南岛加代 繁殖，获得转基因 T1代，共计7个株系。
[0027] 5)功7力忽等位基因转化野生稻BPHR54转基因植株的PCR检测 目的基因在野生稻BPHR54对照植株中不表达，而在转基因植株中表达。见图4所示。
[0028] 6)功也货转基因T1代群体抗虫性状的调查与统计 将转基因 T1代于2012年夏播种，种植在广西农科院植保所网室。三叶期时对其进行 抗虫鉴定。取5个转基因株系，每个株系约种植20株，10株X 2列。同时设立野生型敏感 亲本与BPHR54抗虫亲本作为对照，统计各株系的抗虫级数，统计结果如下：
【权利要求】
1. Bph28基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，将基因转化水稻品种，以改良水稻抗 褐飞虱性状。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的功也货基因的序列如SEQ ID NO 1所 /_J、1 ο
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，培育具有褐飞虱抗性的水稻，依次包括如下 步骤： (1)构建功等位基因表达载体； 等位基因表达载体转化水稻受体； (3)播种功等位基因转化植株。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2)中采用抗虫野生稻BPHR54为转基 因水稻受体，构建功等位基因的过表达转基因植株。
6. 改良水稻的褐飞虱抗性的一种方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤： (a)构建功等位基因表达载体； 必;功等位基因表达载体转化水稻受体； (c)播种功等位基因转化植株。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（b)中采用抗虫野生稻作为转基因水稻 受体。
8. -种功也货等位基因的表达载体，其特征在于，感虫籼稻118S的功也货等位基因插 入到PCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游。
9. 如权利要求8所述的表达载体的制备方法，其特征在于，将感虫籼稻118S的功7力忽 等位基因插入到PCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游而获得。
10. 权利要求8所述的表达载体的应用，其特征在于，将该表达载体应用于改良水稻抗 褐飞虱性状。
【文档编号】C12N15/82GK104099342SQ201310112700
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月2日 优先权日:2013年4月2日
【发明者】罗小金, 王莹, 杨金水 申请人:复旦大学