专利名称：一株棘孢木霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一种能够高效防治植物病害的棘孢木霉菌及其用途，以及采用该棘孢木霉菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
木霉(Trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科,是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表面均可以分离到。木霉是自然界普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物。木霉菌生长繁殖速度快，能够迅速占领营养空间，可分泌产生抗生素抑制其他病原菌生长，还可以通过营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等作用机制，达到抑制病害的目的，是生防菌株中研究最为广泛的菌株之一。目前已经发现的木霉菌30多个种中的许多具有生防潜力，如哈茨木霉、绿木霉、康氏木霉、钩木霉和长枝木霉等，对18个属29种植物病原菌表现出拮抗活性。木霉对植物病原菌的生物防治机制是多样而复杂的，常常是多种机制共同作用的结果，不同的菌株生防机制的侧重点不同，其生防作用效果与菌株类型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的木霉菌株——棘孢木霉WSTr03。本发明的棘孢木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本发明所提供的菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) WS Tr03,是从山东省潍坊市潍北地区沿海滩涂地块的土壤中分离获得的，已于2013年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究`所)，保藏号为CGMCC N0.7503。其具有以下生物学特性:在PDA培养基上，25 °C黑暗条件下培养7天，菌落直径扩展80mm，初期白色稀疏，后变为灰绿色，絮状。反面无色。菌丝具隔，分枝。分生孢子梗便形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，6-10X 3-4.5 μ m。分生孢子椭球形、单个、近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑或稍粗糙，4-5.5 X 3-4 μ m。本发明棘孢木霉菌株WS Tr03的培养方法或繁殖方法包括:(I)普通培养保存采用PDA培养基，配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水 IOOOmL ；(2)实验室液体培养采用PDB培养基，配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水IOOOmL0(3)固体培养基配方:固料和无机盐溶液，按质量比1:1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为50:40:10的玉米芯、麸皮和稻壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。
( 4 )大量发酵培养配方:同(3 )中固体培养基配方。本发明还提供一种用于防治植物土传病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的棘孢木霉菌株WS Tr03。并且，本发明还提供了一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土传病害的植物施用上述棘孢木霉菌株WS Tr03或者上述生物防治制剂。本发明也提供了上述棘孢木霉菌株WS Tr03或者上述生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。就上述生物防治制剂、生物防治方法以及用途而言，所述植物病害可以选自棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黄瓜炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病等一种或几种。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤:(I)制备棘孢木霉菌株WS Tr03的种子液；(2)将步骤(I)制备的种子液接种到固体培养基中，28_30°C下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1:15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。其中，步骤(2 )中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1:1.8 ;所述固料由质量比为50:40:10的玉米芯、麸皮和稻壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤: (I)将棘孢木霉菌株WS Tr03的孢子移植到PDB液体培养基中，28_30°C摇床振荡培养3 5天得到种子液；(2)将步骤(I)制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28_30°C下振荡培养3 5天；(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1:15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1:6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8 9天。其中，步骤(I)中的所述TOB液体培养基同上；步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1:1.8 ;所述固料由质量比为50:40:10的玉米芯、麸皮和稻壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水；步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。实验表明，本发明的棘孢木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该棘孢木霉制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，包括棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黄瓜炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病等一种或几种。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11、棘孢木霉菌株WS Tr03的分离与纯化本发明的棘孢木霉菌株WS Tr03的分离方法为:(I)本发明的棘孢木霉菌株WS Tr03是从是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为:⑴分离:土样的采集，山东省潍坊市潍北地区沿海滩涂土壤(表层以下10 15cm)。采集样品均保存在无菌瓶中，标明采集地点、时间和采集人。称取Ig 土样于IOOmL无菌水中，置于30°C摇床中150rpm震荡lOmin，然后置于60°C水浴锅中孵育30min，取100yL10_2、10_3、10_4稀释液涂布于孟加拉红培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30°C培养3天后挑取孟加拉红培养基上的不同形态的微生物菌落于孟加拉红培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，分别编号保存。⑵棉花枯萎病高效拮抗木霉菌株的筛选①初筛:采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌、棉花枯萎病菌边缘打取直径为5_的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25°C恒温培养，逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。
②复筛:将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的棘孢木霉菌(T.asperellum)菌株WS Tr03。实验证明，该棘孢木霉原粉在防治棉花枯萎病都显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的棘孢木霉是具有广泛应用前景的棘抱木霉新囷株，可以用于制备防治多种植物病咅的生物防治制剂。2、菌株鉴定(I)微生物学特性:在PDA培养基上，25 °C黑暗条件下培养7天，菌落直径扩展80mm，初期白色稀疏，后变为灰绿色，絮状。反面无色。菌丝具隔，分枝。分生孢子梗便形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，6-10X 3-4.5 μ m。分生孢子椭球形、单个、近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑或稍粗糙，4-5.5 X 3-4 μ m。(2)分子生物学特性该菌株的rRNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-1TS2区)如下(SEQ-1):CATCGGGCTTCTACTGATCCGAGGTCACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGGACGT GGACGCGCCGCGCTCCGGTGCGGAGTTGCGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCG GCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGGTCCCGATCCCCAA CGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGC CAGAATACTGGCGGGCGGAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCA ATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCC GTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCG CGAGGGGATACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGC TGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATT GGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCT TGTTACGACTTTTTACTTCCC其中，PDA培养基配方:马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。孟加拉红培养基配方:马铃薯200g (去皮)，葡萄糖20g，l%孟加拉红溶液3.3mL，丙酸钠3.5g，链霉素 0.03g，水 IOOOmL, pH 自然。实施例21、棘孢木霉菌株WS Tr03发酵过程PDB培养基配方:马铃薯200g (去皮)，葡萄糖20g，蒸馏水lOOOmL。大量固体发酵培养基配方(质量百分含量):固料:玉米芯50%，麸皮40%，稻壳10%无机盐溶液:磷酸二氢钾3.5%，硫酸镁0.04%,硫酸铵4%，剩余为水。固液比为1:1.8 (质量比)棘孢木霉菌株WS Tr03大量固体发酵过程:①菌种种子液培养:将棘孢木霉菌株WS Tr03从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28°C摇床振荡培养3 5天，此为种子液。②固体生产菌种的培养:将种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28°C恒温培养3 5天，中间多次振荡。
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③大量固体发酵:将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，将过滤后的菌液按体积比1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28°C和相对湿度85%以上)中发酵培养8 9天，即可得到木霉菌原粉。活性菌达到25亿/克。实施例3本实施例提供了棘孢木霉WS Tr03可湿性粉剂对棉花枯萎病防治效果的相关实验。I)供试药剂棘孢木霉WS Tr03可湿性粉剂；50%多菌灵可湿性粉剂(市售)。棘孢木霉WS Tr03可湿性粉剂的配方(重量比):实施例2的原菌粉20%，CMC0.5%，拉开粉3%，十二烷基磺酸钠8%，葡萄糖2%，白炭黑1%，其余为凹凸棒土。该可湿性粉剂的菌活为5亿/克。2)供试作物与防治对象:供试作物为棉花；品种为中棉I号防治对象:枯萎病。3)试验地情况、试验设计及安排试验地设在山东省东营市棉花地，土壤为砂土地，往年枯萎病发生较重。试验地栽培条件均匀一致。本试验设棘孢木霉菌WS TR03可湿性粉剂药种比为1:150、1:300、1:450 ;50%多菌灵可湿性粉剂1:450;清水作对照共5个处理，重复4次。各小区随机区组排列。施药采用湿拌种,每个小区安排营养钵300个，每钵点2粒棉籽。
4)试验调查及计算方法(I)气象条件施药当日晴，微风，最高气温为30°C，最低气温为26°C，相对湿度为65%(2)药效及安全性调查药效调查:调查总共I次，在出苗30天进行，记载300个营养钵种棉花枯萎病发病数，计算病株率及防治效果。(3)药效计算方法药效按式(I)、(2)计算:
权利要求
1.棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株WS Tr03,所述菌株的保藏编号为CGMCCN0.7503。
2.权利要求1所述的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株WS Tr03在防治植物土传病害中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黄瓜炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病中的一种或几种。
4.一种生物防治制剂,包括权利要求1所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株 WS Tr03o
5.一种制备权利要求4所述的生物防治制剂的方法，其特征是，包括以下步骤: Cl)制备棘孢木霉菌株WS Tr03的种子液； (2)将步骤(I)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30°C下恒温培养； (3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是， (1)将棘孢木霉菌株WSTr03的孢子移植到PDB液体培养基中，28_30°C摇床振荡培养3 5天得到种子液； (2)将步骤(I)制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28-30°C下振荡培养3 5天；` (3)将步骤(2)培养的培养物加入其质量15倍的无菌水混合，过滤，将滤液按体积比I:6的比例接种至大量发酵培养基，恒温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8 9天； 所述步骤(I)中的PDB液体培养基为:马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水IOOOmL ； 所述步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1:1.8 ;所述固料由质量比为50:40:10的玉米芯、麸皮和稻壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水； 所述步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)中的固体培养基。
7.权利要求4所述的生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黄瓜炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病中的一种或几种。
9.一种植物土传病害的生物防治方法，其特征是，向具有土传病害的植物施用权利要求I的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株WS Tr03或者权利要求4的生物防治制剂。
全文摘要
本发明公开了一株棘孢木霉及其应用，属于生物防治植物病害领域。该菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)WSTr03，保藏编号为CGMCC No.7503。本发明还公开了含有上述菌株的生物防治制剂及其制备方法。本发明的棘孢木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该棘孢木霉制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，包括棉花枯萎病等。
文档编号C12N1/14GK103184162SQ20131014407
公开日2013年7月3日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者王清海, 李鹏, 刘幸红, 李泉涌, 李红梅, 牛赡光 申请人:牛赡光, 李鹏