纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株的筛选及液态发酵的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】中一种纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株筛选及液态发酵的方法。该发明筛选出一株纳豆激酶高产菌株YBNK-1，经广东省微生物分析检测中心检测为枯草芽孢杆菌，检测报告编号为粤微检2012ZD0175。经液态发酵配方及发酵工艺优化，所得平均纳豆激酶活性为每毫升2000尿激酶活性以上。为纳豆激酶产业化生产奠定了基础。
【专利说明】纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株的筛选及液态发酵的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】中一种纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株筛选及液态发酵 的方法。
【背景技术】
[0002] 今后30年，我国老年人口将越来越多，老年人的身体健康问题越来越受到人们的 关注和重视。心脑血管栓塞性疾病是危害老年人健康最严重而又常见的疾病之一。目前， 血栓症已逐渐成为死亡率最高的疾病之一，而溶解血栓是治疗这一类疾病的一种重要手 段。因此，对溶栓药物的研究已被广为重视。当前作为第一代溶栓药物链激酶（SK)、尿激酶 (UK)在临床上广为应用，但它们均为激活人体内血液中血纤维酶原，从而降解纤维蛋白，容 易引起全身性纤溶激活并伴有出血倾向。同时SK还具有抗原性并有过敏性反应。而作为 第二代纤溶药物的t-PA尽管对纤维蛋白有很高的选择性，但临床上为了取得较好的溶栓 效果而应用大剂量（l〇〇mg)从而部分失去了对纤维蛋白的选择性，因此依旧会导致出血等 副作用，并且具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺 点。鉴于此，开发新型溶栓药物已成为重要的研究热点之一。目前，纳豆激酶（NK)作为来 自于食品、高效安全并可直接由消化道吸收、起到溶解纤维蛋白作用的纤溶酶，具有安全性 好，体内作用时间长，药效时间长等优点。正在成为当今溶栓药研究的焦点。
[0003] 当今影响纳豆激酶产业化的最主要原因是，生产成本高，生产周期长。因此筛选出 一株高产纳豆激酶的菌株，以及建立一种合适的发酵工艺，对纳豆激酶的产业化具有重要 意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种用于纳豆激酶液态发酵的发酵培养基，其包括：大豆蛋白胨，可溶 性淀粉，Na 2HP04 · 12H20, KH2P04, CaCl2, MgS04 · 7H20。
[0005] 根据本发明，所述发酵培养基包括：大豆蛋白胨1. 0-2. 5%，可溶性淀粉2. 0-4%， Na2HP04 ·12Η200· 4-0. 5%，ΚΗ2Ρ040· 15-0. 25%，CaCl20. 01-0. 03%，MgS04 ·7Η200· 05-007%。
[0006] 本发明还提供一种纳豆激酶液态发酵的方法，其特征在于，所述方法包括以下步 聚：
[0007] (1)取保存于固体培养基上的菌种（优选半环），接种在种子培养基中（pH优选为 6. 8-7. 2),
[0008] (2)恒温培养（优选10-14小时），之后接种到所述发酵培养基中进行发酵。
[0009] 根据本发明，步骤（1)在已消毒的超净工作台上进行。
[0010] 根据本发明，其中接种到发酵培养基中的接种量为2-10%，优选2-4%。
[0011] 根据本发明，步骤⑴所述接种在种子培养基中的操作条件：优选的温度为 34-37°C，优选的转速为 160-300rpm。
[0012] 根据本发明，步骤（2)中的发酵为液态发酵，优选上述液态发酵可以在摇瓶中发 酵，也可以在发酵罐中发酵，例如5L的发酵罐。
[0013] 根据本发明，在摇瓶中发酵，培养基pH优选为6.9-7. 1，温度优选33-18°C，160rpm 恒温培养48-54小时。
[0014] 根据本发明，在发酵罐中发酵，采取随着发酵罐的溶解氧（D0)的变化而提高发酵 罐搅拌子的转速，即随着发酵时间的延长而调大搅拌速度，优选搅拌速度从300rpm提高到 700rpm，更优选从320rpm提高到700rpm。
[0015] 根据本发明，在发酵罐中发酵，发酵罐装液量为50-70%，接种量为2-4%，通气量 为0. 5-0. 8vvm，培养pH为6. 9-7. 1 (以氨水和乙酸调节pH)，温度为35-37°C，整个发酵周期 为28-32小时。
[0016] 根据本发明，所述种子培养基为营养肉汤培养基，包括蛋白胨1. 0 %，牛肉膏 0. 5%，NaClO. 5%，pH值7. 0,或者在其中加入一些缓冲液成份。
[0017] 本发明还提供一种高产纳豆激酶的芽孢枯草杆菌株YBNK-1，经广东省微生物分析 检测中心鉴定为枯草芽孢杆菌，检测报告编号为粤微检2012ZD0175。
[0018] 上述菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2013年04月 12日，保藏号为CGMCC N0. 7467,确定为枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis。
[0019] 本发明还提供了一种所述高产菌株的筛选方法：通过划线反复纯化及紫外诱变， 从市售纳豆中纯化出8株纳豆菌，选择经纤维平板检测活性最强的菌株YBNK-1。
[0020] 该技术方案的优点
[0021] 本技术方案所用的纳豆菌种经发酵罐液态发酵后，所得纳豆激酶活性达到每毫升 1800-2100尿激酶单位。经过多批次发酵试验，本技术方案具有操作简单，原料易得，发酵周 期短，酶活高，满足产业化生产的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为不同时间点纳豆激酶在两种碳源SDS-PAGE检测结果。
[0023] 图2为纳豆激酶溶圈法检测菌种在两种碳源培养基中活性检测结果（DF :可溶性 淀粉；PT :葡萄糖）。
[0024] 图3为种龄为（9/10/11)纳豆激酶在4%葡萄糖和4%可溶性淀粉的发酵培养基 中表达
[0025] SDS-PAGE检测结果（DF :可溶性淀粉；PTT :葡萄糖）。
[0026] 图4为种龄为（9/10/11)纳豆激酶在4%葡萄糖的发酵培养基中溶圈法活性检测 结果（DF :可溶性淀粉；PTT :葡萄糖）。
[0027] 图5为种龄为（9/10/11)纳豆激酶在4%可溶性淀粉的发酵培养基中溶圈法活性 检测结果（DF :可溶性淀粉；PTT :葡萄糖）。
【具体实施方式】
[0028] 斜面培养基的配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0. 5%，NaC10. 5%，琼脂2%，pH值7. 0。
[0029] 发酵培养基：蛋白胨1. 0 %，可溶性淀粉2. 0 %，Na2HP04 · 12H200. 4 %， ΚΗ2Ρ040· 15%，CaCl20. 01%，MgS04 · 7Η200· 05%。
[0030] 种子培养基：蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，NaCll.O%，pH值7.0，121°C下灭菌 20min〇
[0031] 实施例1 :高产菌株的筛选
[0032] 1)在已消毒的超净工作台中，取高纯度纳豆素胶囊，溶于已灭菌的10ml种子培养 基中，待其充分溶解后，取20(^1接种到3〇1111/25〇1111(三角瓶中） ；
[0033] 2) 160rpm，35°C 恒温振荡培养；
[0034] 3)培养10h后，在已灭菌的超净工作台中，取100 μ 1菌液，涂平板；
[0035] 倒置平板，35°C恒温培养；
[0036] 4) 35°C恒温培养24h，挑取长势良好的单菌落，接种到已灭菌30ml/250ml (三角 瓶）种子培养基中；
[0037] 5)以3% (V/V)接种量接种到已灭菌的30ml/250ml (三角瓶）发酵培养基中；
[0038] 6) 35°C，160rpm恒温振荡培养，在不同的时间点取样，检测纳豆激酶表达情况。
[0039] 实施例2 :纳豆激酶高产菌株在不同碳源中表达的情况
[0040] 1)在已消毒的超净工作台中，取上述筛选的纳豆菌高产菌株，接种到已灭菌的 30ml/250ml (三角瓶）种子培养集中；
[0041] 2)35°C，160rpm，培养8h后，以3%接种量分别接种到已灭菌的碳源为葡萄糖、可 溶性淀粉的发酵培养基中；
[0042] 3) 35°C，160rpm 恒温振荡培养；
[0043] 4)每隔一段时间取样，待用。
[0044] 结果如下：
[0045] 由图1、图2可知纳豆激酶在以淀粉为碳源的发酵培养基中，标准曲线为y = 0. 2724x+l. 4852(R2 = 0. 983)，最大活性为693U/ml，此时的碳源是可溶性淀粉。
[0046] 实施例3 :纳豆激酶高产菌株不同种龄菌种在4%可溶性淀粉基础发酵培养基中 表达情况
[0047] 1)在已消毒的超净工作台中，取上述筛选的纳豆菌高产菌株，接种到已灭菌的 30ml/250ml (三角瓶）种子培养基中；
[0048] 2)35°C，160rpm，培养9h，10h，llh后，以3%接种量分别接种到已灭菌的碳源为 4%可溶性淀粉和4%葡萄糖的发酵培养基中；
[0049] 3) 35°C，160rpm 恒温振荡培养；
[0050] 4)每隔一段时间取样，待用。
[0051] 由图3、图4、图5可知，种龄为10h，在表达后48h活性能接近2000U/ml，并且进一 步说明以可溶性淀粉作为碳源比以葡萄糖作为碳源更有利于纳豆激酶的表达。
[0052] 实施例4 :纳豆激酶500ml摇瓶试验
[0053] 取保存于斜面培养基上的YBNK-1菌种，接种于30毫升种子培养基中。37°C恒温 160-200印111培养12小时，以3%接种量卜八）接入装有601111发酵培养基的5001111三角瓶 中，160rpm恒温培养48-54小时。平均酶活达每毫升2000尿激酶单位。
[0054] 实施例5 :纳豆激酶在5L发酵罐中的表达情况
[0055] 取保存于斜面培养基上的YBNK-1菌种，接种于30毫升种子培养基中。37°C恒温 160-200rpm培养12小时。5L发酵罐中装入3L发酵培养基，121°C灭菌20分钟，搅拌转速 为300rpm，通气量为0. 5vvm，发酵罐温度降至37°C时，用氨水调pH为7. 0,然后以3% (v/ v)接种量，将菌种接种到发酵培养基中，发酵周期为28-32小时，其中搅拌速度随着发酵时 间的延长而增大，从初始搅拌速度为300rpm增加到700rpm。所得纳豆激酶的平均活性为每 毫升2000尿激酶单位。
【权利要求】
1. 一种用于纳豆激酶液态发酵的发酵培养基，其包括：大豆蛋白胨，可溶性淀粉， Na2HP04 · 12H20, KH2P04, CaCl2, MgS04 · 7H20〇
2. 根据权利要求1所述的发酵培养基，其包括：大豆蛋白胨1.0-2. 5%，可溶性 淀粉 2. 0-4 %, Na2HP04 · 12H200. 4-0. 5 %, ΚΗ2Ρ040. 15 -0 . 25 %, CaCl20. 01-0. 03 %, MgS04 · 7Η200· 05-0. 07%。
3. -种纳豆激酶液态发酵的方法，包括以下步聚：取保存于固体培养基上的菌种，接 种在种子培养基中（pH优选为6. 8-7. 2)，恒温培养（优选10-14小时），之后接种到如权利 要求1或2中的发酵培养基中进行发酵。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中接种量为2-10%，优选2-4%。
5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述的菌种是经中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏号为7467。
6. 根据权利要求3所述的方法，其中所述发酵是在发酵罐中进行。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中搅拌速度随着发酵时间的延长而增大，优选搅拌 速度从300rpm提高到700rpm，更优选从320rpm提高到700rpm。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，发酵罐装液量为50-70 %，接种量为2-4 %，通气量 为0. 5-0. 8vvm，培养pH为6. 9-7. 1 (以氨水和乙酸调节pH)，温度为35-37°C，，整个发酵周 期为28-32小时。
9. 一种枯草芽孢杆菌，该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保藏，保藏号为7467。
【文档编号】C12N9/56GK104152429SQ201310178561
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】戴东升, 王星星, 杨仁佳, 安俊, 郑慧, 周鹏, 姚振芳, 王斐, 陈婧, 禹玉洪, 任武贤 申请人:亚宝药业集团股份有限公司