一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途

一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途
【专利摘要】本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-力达霉素辅基蛋白-连接肽2-(促吞噬肽)n；其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列，所述力达霉素辅基蛋白具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列，所述促吞噬肽具有SEQ?ID?NO:3所示的氨基酸序列，并且n=1-3。该融合蛋白为靶向EGFR且含有LDP和Tuftsin的新型蛋白，不仅保留Tuftsin的促吞噬作用，而且具有靶向性，在动物体内具有良好的抗肿瘤效果。本发明还提供了该融合蛋白的编码基因、与力达霉素发色团组装的强化融合蛋白以及它们的制药用途。
【专利说明】一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途

【技术领域】
[0001] 本发明属于药用蛋白【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白、其编 码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。

【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（EGFR)异常表达是多种上皮来源的肿瘤细胞的重要特性，因此 EGFR已成为肿瘤靶向性治疗的理想靶点。但是，抗EGFR的抗体分子量大、免疫原性强，难以 穿透到实体肿瘤的内部，而EGFR的小分子酪氨酸抑制剂虽然组织扩散和穿透力强、低免疫 原性，但是一般和细胞毒药物一起使用。
[0003] 促吞噬肽（Tuftsin)由Najjar等人于1970年在美国Tufts大学首次发现，并因 此而得名。它是一种促进巨噬细胞吞噬作用的人体自然存在的活性物质，位于IgG重链Fc 段CH2区域残基289-292部分，分子量为500kD。吞噬细胞、巨噬细胞和单核细胞等免疫细 胞的细胞膜上都含有Tuftsin的特异性受体，当该特异性受体与Tuftsin结合后，这些细胞 即可发挥其吞噬、杀菌和抗肿瘤及其它活性作用。动物体内实验证明，移植了白血病细胞 的动物在注射Tuftsin后，其移植性肿瘤的发生延迟，发生率降低，并且实验动物的寿命得 到延长。此外，Tuftsin脂质体药物载体能够增强抗肿瘤药物的抑制肿瘤细胞增殖的作用。 进一步研究还指出，Tuftsin及其同系物具有选择性的抗肿瘤活性，并且可能通过抑制DNA 拓扑异构酶的活性发挥其抗肿瘤的作用。并且，在临床检测中发现，Tuftsin可以促进白细 胞肿瘤细胞吞噬，且如将其标记微颗粒的表面可以用来抗炎症治疗。然而遗憾的是，促吞 噬肽（Tuftsin)分子活性功能基团还存在争议：其活性基团主要为氮端的赖氨酸-NH 2及碳 端的-C00H，到底是那个基团起主要的活性作用还未研究清楚。因此将促吞噬肽（Tuftsin) 作为效应分子时，为了保护这两个基团或修饰这两个基团，主要采用了化学合成促吞噬肽 (Tuftsin)化合物的方式。但是，在化学合成时，副产物太多，主产物不易获得和纯化，并且 难大量生产。此外，已知促吞噬肽（Tuftsin)分子的分子量太小，对肿瘤细胞没有结合能力， 动物实验大量使用时有一定的毒性。
[0004] 力达霉素（LDM)是由1个辅基蛋白（Lidamycin apoprotein, LDP)和1个发色团 (active enediyne chromophore，AE)组成的一种烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以作为弹头药 物。其中，发色团是活性部分，含有一个九元环烯二炔核心结构，分子量为843Da ;辅基蛋白 起保护发色团的作用，由110个氨基酸组成，分子量为10506Da，并且这两个部分可以拆分。 研究发现，LDP本身在体内具有中等程度的抗肿瘤作用，并且由于其具有独特的分子结构， 可以作为开发新型抗肿瘤药物的支架载体。
[0005] 基于上述现有技术状况，可以考虑以力达霉素辅基蛋白为支架载体，构建具有 EGFR特异性的、基于促吞噬肽的抗肿瘤融合蛋白。


【发明内容】

[0006] 基于上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种以LDP为支架具有靶向EGFR的 促吞噬肽的融合蛋白，该融合蛋白为具有抗肿瘤作用的小分子药用蛋白。
[0007] 本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的编码基因。
[0008] 由于力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明还提供一种与发色团组装的强化 融合蛋白。
[0009] 本发明的还一个目的是提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合蛋 白的制药用途。
[0010] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0011] 迄今为止，在国外文献报道的相关促吞噬肽（Tuftsin)化合物抗肿瘤的研究中，促 吞噬肽（Tuftsin)化合物都是通过化学合成获得的。其原因在于，促吞噬肽（Tuftsin)分 子量太小，无法通过基因工程的方法构建载体和表达。这给促吞噬肽的应用带来了一定的 困难。对此，本发明人通过基因工程技术构建了以LDP为支架具有靶向EGFR的促吞噬肽 融合蛋白（本文命名为ET-tuftsin或ET-tuftsin-tuftsin)重组载体，将其转化到工程菌 BL21starTM(DE3)中表达，并经纯化获得了一种多功能的具有抗肿瘤作用的小分子药用蛋 白。其中，除表达的蛋白含促吞噬肽之外，关于EGFR靶向性则选取了与EGFR受体结合的 EGF重要结构C环，其上22个氨基酸残基作为导向分子，由此形成的小分子也更容易穿透组 织，到达实体肿瘤的更深部。此外，因力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明人还成功 组装了一种新的双弹头强化融合蛋白（本文命名为ET-tuftsin-AE)。体内体外试验证实，经 抗肿瘤作用得到进一步加强。
[0012] 因此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基 酸序列结构：
[0013] EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-力达霉素辅基蛋白-连接肽2-(促吞噬肽）η ;
[0014] 其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22个氨 基酸；所述力达霉素辅基蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110个氨基酸；所述 促吞噬肽具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共4个氨基酸；并且，n=l-3。
[0015] 在该融合蛋白中，连接EGFR特异性靶向寡肽与力达霉素辅基蛋白的连接肽1与 连接力达霉素辅基蛋白与促吞噬肽的连接肽2可以相同或不同。优选地，所述连接肽1为 (GGGGS) 2，所述连接肽2为（GGGGS)2。选择（GGGGS)Jt为连接肽的原因在于，一方面利于 在工程菌如大肠杆菌中表达；另一方面，连接肽太短，刚性大，不利于蛋白分子伸展，容易造 成蛋白分子构想相互遮掩，影响蛋白功能，并且力达辅基蛋白（LDP)支架分子共110个氨基 酸，具有α螺旋和β折叠，结构复杂，分子量比较大，因此，选用（GGGGS) 2。
[0016] 优选地，n=l，所述融合蛋白具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；
[0017] 进一步优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示或SEQ ID N0:5。
[0018] SEQ ID N0:4为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共156个氨基酸。 从氨基端至羧基端，该融合蛋白包括：EGFR特异性靶向寡肽（Ec)，共22个氨基酸；连接肽 1，为（GGGGS) 2柔性肽，共10个氨基酸；力达霉素辅基蛋白（LDP)，共110个氨基酸；连接肽 2,为（GGGGS)2柔性肽，共10个氨基酸；促吞噬肽（Tuftsin，TF)，共4个氨基酸。
[0019] SEQ ID N0:5为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共166个氨基酸。 相比于SEQ ID N0:4,该融合蛋白在EGFR特异性靶向寡肽之前具有Met和Ala，在促吞噬肽 的C端具有Leu和Glu以及（His) 6标签。
[0020] 或者，n=2,所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列；
[0021] 优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:13所示。
[0022] SEQ ID NO: 13为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共160个氨基酸。 相比于SEQ ID N0:4,该融合蛋白在羧基端具有连续的2个促吞噬肽。
[0023] 另一方面，本发明提供上述融合蛋白的编码基因。
[0024] 优选地，所述编码基因具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
[0025] 优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:7所示。
[0026] 再一方面，本发明提供一种抗肿瘤强化融合蛋白，所述强化融合蛋白为本发明的 上述融合蛋白与力达霉素发色团组装而成。
[0027] 根据本发明的【具体实施方式】，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而 成：将本发明提供的上述融合蛋白与力达霉素发色团以1:3的分子比混合，于4°C下避光缓 慢晃动反应12?16个小时。反应接受后，去除多余发色团，得到组装成功的强化融合蛋 白。具体而言，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而成：取高活性的力达霉 素纯品，经C4柱分离活性发色团，流动相为水：乙腈：三氟乙酸（78%:22%:0.05%，体积比)， 监测350nm处的吸光值，以收集发色团；将本发明提供的上述融合蛋白与力达霉素发色团 以1:3的分子比混合，置于摇床上缓慢晃动，4°C下避光反应12-16小时；将二者的混合液经 S印hadex G-75柱除去未包装上的发色团，HPLC(C4 300A柱）检测350nm处的吸光值，观 察发色团与融合蛋白是否组装成功。
[0028] 另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述融合蛋 白和/或强化融合蛋白为活性成分。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或 乳腺癌，优选鳞癌。
[0029] 又一方面，本发明还提供上述融合蛋白或强化融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用 途。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。
[0030] 综上，本发明应用基因工程的方法提供了一种新型的具有特异性、靶向性的融合 蛋白。该融合蛋白为靶向EGFR (表皮生长因子受体)、且含有LDP和Tuftsin的新型蛋白。 该融合蛋白不仅保留Tuftsin的促吞噬作用，而且具有靶向性，在动物体内具有良好的抗 肿瘤效果。此外，由于该融合蛋白含有LDP作为支架，可以组装抗肿瘤抗生素力达霉素的烯 二炔发色团AE，从而进一步提高了抗肿瘤疗效。并且实验证明，与现有融合蛋白相比，本发 明的融合蛋白具有抑瘤效果更佳的优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0031] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0032] 图1示出了重组表达质粒pET3〇-ET_tuftsin的构建。
[0033] 图2示出了重组菌表达产物ET-tuftsin融合蛋白的检测结果。其中：
[0034] 图2A为ET-tuftsin融合蛋白定位分析的电泳图谱，1-蛋白分子量标准，2-IPTG 诱导全菌组分，3-上清组分，4-周质腔组分，5-细胞质可溶组分，6-包涵体组分；
[0035] 图2B为ET-tuftsin融合蛋白纯化后的SDS-PAGE和Western Blot结果，1-蛋白 分子量标准，2、3_纯化ET-tuftsin蛋白，4、5-ET_tuftsin融合蛋白WesternBlot结果；
[0036] 图2C为HLPC检测ET-tuftsin融合蛋白的纯度结果。
[0037] 图3示出了 ET-tuftsin融合蛋白体外结合能力的分析结果。其中：
[0038] 图3A和3B为不同肿瘤细胞及J774A. 1中EGFR表达量的Western Blot检测结 果；
[0039] 图3C为A431细胞中ET-tuftsin融合蛋白ELISA免疫活性分析结果；
[0040] 图3D为J774A. 1细胞中ET-tuftsin融合蛋白ELISA免疫活性分析结果。
[0041] 图4示出了细胞免疫荧光检测ET-tuftsin融合蛋白与肿瘤细胞结合结果（TRITC 标记羊抗鼠 IgG染色)。其中，图4A为A431细胞，图4B为A549细胞，图4C为MCF-7细胞， 图4D为SK-BR-3细胞。
[0042] 图5示出了细胞免疫荧光分析融合蛋白ET-tuftsin和蛋白LDP分别与A431细胞 的结合活性结果。其中：
[0043] 图5A-5C为融合蛋白ET-tuftsin作用于A431细胞：5A，细胞核DAPI着色图片； 5B，细胞膜着色图片；5C，细胞核和细胞膜着色图片；
[0044] 图OT-5F为蛋白LDP作用于A431细胞：5D，细胞核DAPI着色图片；5E，细胞膜着色 图片；5F，细胞核和细胞膜着色图片。
[0045] 图6示出了 ET-tuftsin融合蛋白的体外吞噬活性分析结果。其中：
[0046] 图6A为ET-tuftsin融合蛋白作用于J774A. 1细胞；
[0047] 图6B为LDP蛋白作用于J774A. 1细胞；
[0048] 图6C为采用流式细胞仪分析融合蛋白ET-tuftsin和蛋白LDP促小鼠巨噬细胞 J774A. 1的吞噬活性结果。
[0049] 图7示出了融合蛋白ET-tuftsin和LDP、Tuftsin对肿瘤细胞的抑制率比较结果。
[0050] 图8示出了高效液相色谱法鉴定的强化融合蛋白ET-tuftsin-AE的分子组装结 果。其中：1、3_杂蛋白吸收峰；2-融合蛋白吸收峰；4-发色团吸收峰。

【具体实施方式】
[0051] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0052] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0053] 实施例1重组表达载体pET30-ET_tuftsin的构建
[0054] 本实施例中使用的重组质粒pEL含有EGFR寡肽配体Ec基因和LDP基因，构建方 法及其图谱参见郭晓芳，"靶向表皮生长因子受体的寡肽与力达霉素强化融合蛋白的构建 及其抗肿瘤活性"，《癌症》，2009, 28 (6) :561-568)。大肠杆菌感受态DH5a为北京全式金 生物科技公司产品，pET30a(+)为Novagen公司（69909-3)的产品，PCR引物由英维杰基上 海公司合成。
[0055] 构建重组载体pET3〇-ET_tuftsin需要3条引物：
[0056] El (SEQ ID N0:8) :5，-gc cat atg aaa tac ctg ctg ccg acc_3，（下划线为 Ndel酶切位点）
[0057] P2 (SEQ ID N0:9) :5，-gcc gaa ggt cag age cac gtg-3，
[0058] T2 (SEQ ID NO: 10) :5' -gc etc gag aeg egg ett ggt tga acc gcc tee acc tgaacc gcc tcc acc gcc gaa ggt cag age cac_3'（下划线为 Xhol 酶切位点）
[0059] 以重组质粒pEL为模板，采用引物El和P2进行常规PCR反应：94°C预变性3分 钟，然后94°C变性30秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸45秒，进行30个循环的扩增反应，最后 72 °C延伸10分钟。反应体系含：
[0060] 模板质粒DNA 100ng El (20 pM) 0.5 μ? Ρ2 (20 ρΜ) 0.5 μ! Premix PrimetSTAE 25 μ! 无菌双蒸水补至总体积 50 μ 1
[0061] 产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用Omega公司凝胶回收试剂盒回收501bp的基因片 段，该基因片段带有信号肽，命名为Ec-ldp (SEQ ID N0:11)。
[0062] 以Ec-ldp为模板，引物El和T2进行PCR反应，采用的PCR反应条件为：94°C预变 性3分钟，然后94°C变性50秒，55 °C退火50秒，72 °C延伸50秒，进行30个循环的扩增反 应，最后72°C延伸8分钟。反应体系含：
[0063] 模板质粒DNA 100 ng R1 (20 pM) 0.5 μ! Τ2(20 ρΜ) 0.5 μΙ Prcmix PrirneiS I AK 25 μ? 无菌双蒸水补至总体积 50 μ?
[0064]
[0065] 将得到的基因片段命名为ET-tuftsin基因 （SEQ ID Ν0:7)。
[0066] ET-tuftsin基因包括4部分，从5'端到3'端依次为NdeI酶切位点（6bp)、pe 1Β信 号肽的编码序列（69bp)、Ec的编码序列（66bp)、柔性肽（GGGGS)2的编码序列（30bp)、LDP的 编码序列（330bp)、柔性肽（GGGGS) 2的编码序列（30bp)、tuftsin的编码序列（12bp)、Xhol 酶切位点（6bp)，共549bp。其中pe 1B信号肽的作用是促使融合蛋白在细菌的周质腔中表 达，之后将被周质腔中的信号肽酶切除，只保留末端的丙氨酸和甲硫氨酸。
[0067] 分别用Ndel和Xhol双酶切ET-tuftsin基因和pET30a ( + )载体，然后连接，得到 重组表达载体，命名为pET30-ET-tuftsin，并转化至大肠杆菌DH5 α，挑选出阳性克隆进行 测序，质粒构建流程见图1。结果表明，酶切结果和测序结果与预期完全一致。
[0068] 在得到的重组质粒pET30-ET-tuftsin中，在促吞噬肽编码序列的3'末端有Xhol 酶切位点，并且pET30a ( + )载体含有组氨酸标签（6个氨基酸，His-tag标签)，使得该重组 质粒pET30-ET-tuftsin在表达融合蛋白时使蛋白含有His-tag标签，以便于纯化和鉴定。
[0069] 实施例2融合蛋白ET-tuftsin在大肠杆菌中的表达和纯化
[0070] 本发明使用的大肠杆菌菌株BL21star?(DE3)是Novagen公司的产品。
[0071] 将实施例1中构建的重组表达载体pET30-ET-tuftsin转化至大肠杆菌BL21中， 挑取阳性单克隆接种LB培养基(卡那霉素50μ g/ml)，37°C下过夜培养。送去测序，选取测 序和酶切结果正确的阳性菌株_80°C下保存。
[0072] 将该阳性单克隆接种5ml LB培养基，37°C下过夜培养，当0D=1.0_2. 0时，加入 lmmol/L IPTG，诱导8h，按照pET系统操作手册（Novagen公司)对培养液上清液、周质腔、细 胞质可溶以及不可溶组分进行分析。融合蛋白ET-tuftsin分子量大小为16.3KD。发现，经 12% SDS-PAGE电泳分析，ET-tuftsin蛋白主要定位于周质腔中（图2A)，分子量大小与预期 相符。对影响蛋白表达产量的各个条件进行了优化，最终确定表达条件为：温度37°C、菌体 起始密度A600=l. 0、IPTG浓度为0. lmmol/L、诱导时间为8h。
[0073] 融合蛋白是可溶性的，不需经过复性，可经过高渗、低渗处理后释放出来，并且融 合蛋白ET-tuftsin在碳末端带有His-tag标签，因此采用GE公司的His-tag5ml的镍柱， 按试剂盒说明书进行Ni2+亲和色谱纯化。用不同浓度的咪唑将蛋白提纯，咪唑的浓度分别 为20mM、50mM、70mM、100mM和250mM，250mM咪唑洗下的蛋白经12%SDS-PAGE电泳分析鉴定 为目的蛋白ET-tuftsin (图2B)，分子量大小与预期相符。HPLC检测其纯度达到了 90. 2% (图2C)，产量为每升发酵液大概获得6mg的活性蛋白。
[0074] 得到的融合蛋白ET-tuftsin的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
[0075] 实施例3融合蛋白ET-tuftsin体外细胞结合活性测定
[0076] 实验(一）：
[0077] 将对数生长期的人皮肤鳞癌细胞A431和小鼠巨噬细胞J774A. 1用预冷的PBS洗 涤2次，用胰酶消化细胞，再用PBS洗涤2次，加入适量细胞裂解液(北京宝赛生物技术公 司），冰上裂解10分钟。之后于4°C，10, OOOrpm下离心30分钟，收集上清液。
[0078] 用BCA试剂盒进行融合蛋白ET-tuftsin定量，取100 μ g蛋白与适量5X上样缓 冲液混合，沸水浴中变性5分钟，-80°C保存备用。
[0079] Western Blot检测肿瘤细胞EGFR的表达水平，结果显示A431为EGFR高表达细胞 株，而J774A. 1检测不到EGFR的表达（图3A)。
[0080] 相同的方法处理人皮肤鳞癌细胞A431、小鼠巨噬细胞J774A. 1、人肺癌细胞A549、 人肺癌细胞H460、人乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3,用BCA试剂盒进行融合蛋白ET-tuftsin 定量，取20 μ g蛋白与适量5X上样缓冲液混合，沸水浴中变性5分钟，-80°C保存备用。
[0081] Western Blot检测肿瘤细胞EGFR的表达水平，结果显示A431为EGFR高表达细胞 株，而A549中表达EGFR，MCF-7和SK-BR-3表达EGFR较少，J774A. 1和H460不表达EGFR (图 3B)。
[0082] 以酶联免疫吸附分析方法（ELISA)检测融合蛋白的免疫原性。将A431和J774A. 1 细胞于96孔板每孔接种1 X 104个细胞，37°C下培养24小时后用PBS洗3次，加入4°C预冷 的0. 05%戊二醛（100 μ 1/孔)，于4°C固定细胞30分钟。固定好的细胞用PBS洗3次后，用 3% BSA溶液于4°C下封闭过夜，然后用PBST缓冲液（PBS中含有0. 05%的Tween-20)洗3次。 将融合蛋白ET-tuftsin倍比稀释加入到96孔板中，每个浓度设3个平行孔，37°C下温育2 小时。用PBST洗3次后，加入抗His-tag单克隆抗体（1 :2500稀释)，37°C下温育2小时。 用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG抗体（1 :2500稀释)，37°C下温育 2小时。用PBST洗板5次，加入TMB底物反应液(北京天根公司）（100μ1/孔)，室温避光 反应10-30分钟。以2mol/L的硫酸每孔100 μ 1终止反应，立即在酶标仪上测定450nm处 的吸光值。结果表明，融合蛋白ET-tuftsin对A431细胞的反应均呈阳性（图3C)，J774A. 1 细胞表面具有Tuftsin的专一受体，ET-tuftsin对其的反应也呈阳性（图3D)。
[0083] 实验（二）：
[0084] 采用细胞免疫荧光法分析融合蛋白ET-tuftsin与EGFR不同表达的A431、A549、 SK-BR-3和SW1990细胞的结合活性。
[0085] 将这四种肿瘤细胞以5X104个细胞/孔的密度接种到六孔板中，37°C下培养24 小时后用PBS洗3次，加入70%甲醇于置于0°C下固定20分钟，PBS洗3次。加入融合蛋 白ET-tuftsin(100μM/孔)，于室温下孵育2小时或于4°C下过夜，然后PBS洗3次。加入 1:1000稀释的抗His-tag抗体，室温下反应2小时，PBS洗3次。加入1:50稀释的TRITC 标记羊抗鼠 IgG (中杉金桥公司），室温下避光反应1小时，PBS洗3次。加入1:100稀释的 DAPI( lmg/ml )，室温下避光反应15分钟。PBS洗3次后于荧光显微镜下观察并照相。结果如 图所示，在这四种细胞细胞膜上均可观察到红色荧光，只是荧光强度不同，表明ET-tuftsin 蛋白可以与表达EGFR受体的肿瘤细胞的细胞膜结合（图4)。
[0086] 实验(三）：
[0087] 细胞免疫荧光法分析比较融合蛋白ET-tuftsin和蛋白LDP分别与A431细胞 (EGFR高表达)结合能力的差异。结果表明，融合蛋白ET-tuftsin可以与A431细胞膜上的 受体结合（图5A、5B和5C)，而LDP蛋白不能与A431细胞细胞膜上的EGFR受体结合（图 5E 和 5F)。
[0088] 实施例4融合蛋白ET-tuftsin体外吞噬实验
[0089] 将J774A. 1以5X 104个细胞/孔接种于24孔组织培养板，37°C下过夜培养。PBS 洗3遍，无血清培养基培养此。取三个孔，每孔都加入2. 5 μ M FITC标记的BSA，然后一个 为对照孔（BSA)，另外两孔分别加入LDP和ET-tuftsin (10 μ Μ/孔)，37°C下培养2h，于显 微镜下观察并照相。结果显示，融合蛋白ET-tuftsin作用过的细胞（图6A)，与LDP作用过 的细胞相比（图6B)，吞噬作用增强。
[0090] 取对数生长期的J774A. 1细胞以浓度为5 X 105个细胞/孔接种24孔组织培养板， 37°C下过夜培养。用PBS洗涤细胞3次，温孵2小时。取三个孔，每孔都加入ΙΟμΜ FITC 标记的BSA，然后一个为对照孔(只含有FITC标记的BSA)，另外两孔分别加入LDP (20 μ Μ/ 孔）和ET-tuftsin (20 μ Μ/孔)，每孔分别重复三次。37°C下反应2小时以上加入lml用 PBS配制的台盼蓝溶液（120 μ g/ml)淬灭荧光5分钟。PBS洗三遍，用胰酶消化，1，OOOrpm 离心5分钟收集细胞，加入500 μ 1反应缓冲液（PBS+2%FBS)，所有的反应管均用200目尼龙 网过滤后用流式细胞仪测定突光强度。计算吞噬倍数利用公式：fold phagocytic index= (F蛋白_F_对照）/ (FBSA-F阴性对照)。如图所示，融合蛋白ET-tuftsin具有明显的促进吞噬细 胞J774A. 1吞噬的作用（图6C)。
[0091] 实施例5CCK-8试剂盒检测ET-tuftsin融合蛋白体外对肿瘤细胞的杀伤活性
[0092] 取对数生长期的皮肤鳞癌细胞A431和肺癌细胞A549细胞，以每孔3000个细 胞的密度接种于96孔板，37 °C下培养24h后加入不同浓度的融合蛋白ET-tuf tsin或 LDP-tuftsin (采用常规方法获得的LDP与Tuftsin的融合蛋白，序列为SEQ ID NO: 12)或 LDP或Tuftsin (Sigma)，每浓度设置3个平行孔。孵育24h后，每孔加入20 μ L CCK-8溶 液继续培养lh。酶标仪测定450nm处的吸光度（A45CI)。实验设置无药对照组和无细胞空白 组，按下面公式计算细胞的存活率并计算出IC50值：
[0093] 细胞抑制率=100-(加药组A45(l值一空白组A45(l值）八对照组六 45(|值一空白组八45。 值）X100%。
[0094] 结果表明，与 LDP-tuftsin、LDP 和 Tuftsin 相比，ET-tuftsin 蛋白对 A431 肿 瘤细胞抗增殖作用最明显，1〇〇μ M ET-tuftsin蛋白对鳞癌A431细胞的抑制率为67%， LDP-tuftsin为52%，而LDP蛋白只有20% (图7A);与力达辅基蛋白相比，ET-tuftsin蛋 白对A549肿瘤细胞抑制率为54%，LDP-tuftsin为50%，LDP蛋白只有45% (图7B)。因此 ET-tuftsin蛋白对EGFR高表达A431细胞株抗增殖作用比A549明显；LDP-tuftsin比力达 辅基蛋白的抗肿瘤活性高，而ET-tuftsin蛋白又比LDP-tuftsin高。促吞噬肽（Tuftsin)融 合蛋白LDP-tuftsin和ET-tuftsin都具有明显的抑制肿瘤细胞A431和A549增殖的作用， 但是含促吞噬肽的融合蛋白比不含吞噬肽的LDP效果好，含有靶向分子Ec的ET-tuftsin 比没有祀向的融合蛋白LDP-tuftsin效果好。
[0095] 实施例6融合蛋白ET-tuftsin对人鳞癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用
[0096] 取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠5只，将人鳞癌A431细胞接种于裸鼠腋 窝皮下，每只接种1X10 7个细胞。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成 2 X 2 X 2mm3的小块，用套管针将瘤块分别移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。待 瘤块长至100mm 3大小时，将裸鼠按照瘤块大小和体重进行分组，使每组瘤块大小平均值为 100mm3,且各组体重平均值接近，每组6只裸鼠。当肿瘤体积为100mm 3时，将等摩尔的融合 蛋白 Ec-LDP-Hr (参见郭晓芳，Clin Cancer Res 2010;16:2085-2094. )、LDP-tuftsin、LDP 和Tuftsin分别通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200 μ 1，对照组不做任何处理。第一次给药 后的第7天，按照相同的剂量再次给药一次。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根 据公式V=ab 2/2计算肿瘤体积（a :肿瘤长径，b :肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，观察体重变 化。实验第30天处死动物，分别称量肿瘤的重量，计算抑瘤率。结果见表1。
[0097] 表1融合蛋白ET-tuftsin对人鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用
[0098]

【权利要求】
1. 一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构： EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-力达霉素辅基蛋白-连接肽2-(促吞噬肽）η ; 其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID Ν0:1所示的氨基酸序列，所述力达霉素 辅基蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述促吞噬肽具有SEQ ID NO:3所示的氨 基酸序列；并且，n=l-3。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽1为（GGGGS)2 ;所述连接 肽 2 为 〇；GGGS)2。
3. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，n=l，所述融合蛋白具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列； 优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
4. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，n=2,所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列； 优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白的编码基因。
6. 根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有SEQ ID N0:6所示 的核苷酸序列； 优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
7. -种抗肿瘤强化融合蛋白，其特征在于，所述强化融合蛋白为根据权利要求1至4中 任一项所述的融合蛋白与力达霉素发色团组装而成。
8. 根据权利要求7所述的强化融合蛋白，其特征在于，所述强化融合蛋白通过包括以 下步骤的方法组装而成：将根据权利要求1或2所述的融合蛋白与力达霉素发色团以1:3 的分子比混合，于4°C下避光缓慢晃动反应12?16个小时。
9. 一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物以根据权利要求1至4中任一项所述的融合 蛋白和/或根据权利要求7或8所述的强化融合蛋白为活性成分。
10. 根据权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防 鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。
11. 根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7或8所述的强化 融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。
12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、 肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。
【文档编号】C12N15/62GK104151432SQ201310178116
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】刘文娟, 甄永苏, 刘秀均, 李毅, 张胜华 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所