小麦TaFAD2蛋白及其编码基因和其在提高植物抗病性中的应用的制作方法

小麦TaFAD2蛋白及其编码基因和其在提高植物抗病性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及小麦TaFAD2蛋白及其编码基因TaFAD2。所述小麦TaFAD2蛋白为：（1）SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。本发明还提供了所述TaFAD2蛋白在提高植物抗病性中的应用。在小麦中抑制TaFAD2基因的表达能够明显降低小麦对白粉病的抗性，而在拟南芥中过表达TaFAD2基因可明显增加转基因拟南芥对白粉病的抗性，本发明可有效解决植株由于白粉病等真菌病害导致的产量减少等问题。
【专利说明】小麦TaFAD2蛋白及其编码基因和其在提高植物抗病性中 的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及小麦TaFAD2蛋白及其编码基因和其在 提高植物抗病性中的应用。

【背景技术】
[0002] 小麦是世界范围内最广泛种植的粮食作物，小麦白粉病是小麦的重要病害之一。 据报道，小麦白粉病可造成13%?34%的产量损失。而过多依赖于农药，不仅增加了生产成 本，而且还造成了大面积环境污染，严重威胁农业生态安全。因此，采用生物技术手段，克 隆高抗小麦白粉病基因并将其应用于小麦抗病遗传育种是控制小麦白粉病流行最经济、安 全、有效的方法。然而，由于抗病基因和无毒基因的互作表现为品种对小种的专化抗性，植 物抗病性常因病原菌群体生理小种的变化而被克服，有些抗病基因还没有克隆到，
[0003] 其抗病性就由于病菌群体毒性的变化而丧失。由此可见，利用抗病基因培育抗病 品种也在不断面临新的挑战。人们转而开始筛选广谱、持久的抗病重要相关基因并培育具 有持久抗病性的作物品种。
[0004] 油醜憐脂胆喊去饱和酶（l-aeyl-2-〇leoyl-sn-glyeer〇-3-phosphoeholin Λ 12_d esaturase，ECI. 3. 1. 35; FAD2)又称Λ 12脂肪酸脱氢酶或油酸脱氢酶，是植物体中产生多不 饱和脂肪酸的一个重要酶，在亚油酸和亚麻酸的合成过程中，内质网FAD2酶的活性尤为重 要，参与在脂肪酸碳链的第12位碳原子上引入第二个双键，催化多不饱和脂肪酸生物合成 的第一步反应，负责除质体膜内膜膜脂外所有不饱和甘油脂的合成，主要催化油酸（18:1) 转化为亚油酸（18:2)。油脂生物化学研究认为，硬脂酞-ACP脱氢酶决定硬脂酸形成油酸， 而FAD2和FAD6则决定油酸形成亚油酸。FAD2基因是FAD2酶的编码基因，因此FAD2基 因是控制油酸向亚油酸转化的关键基因，直接决定了种子中储存脂中多不饱和脂肪酸的含 量与比例(袁思玮，植物激素和非生物胁迫对拟南芥FAD2基因的调节机制研究，硕士论文， 2010)。
[0005] 植物中，FAD可以介导植物防御信号转导路径，在植物对细菌和真菌病害防御中 发挥重要作用。基础防御是植物抵御病原侵染产生的初级主动防御反应。大豆中GmFAD3 的沉默可以增强JA的累积，略微减少18:3脂肪酸水平，从而使植株对扁豆花叶病毒（Bean pod mottle virus, BPMV)更敏感（Singh AK, Silencing genes encoding omega-3fatty acid desaturase alters seed size and accumulation of Bean pod mottle virus in soybean， Mol Plant Microbe Interact，2011，24(4):506_15)〇
[0006] 目前，FAD基因主要是用于研究油类作物，但是对小麦FAD基因的研究很少，并且 对于FAD2基因的抗病功能也并未研究。


【发明内容】

[0007] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供小麦TaFAD2蛋白及其编码基因。
[0008] 本发明的另一目的是提供小麦TaFAD2蛋白及其编码基因在提高植物抗病性中的 应用。
[0009] 本发明提供了小麦TaFAD2蛋白，所述蛋白为：
[0010] (1) SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] (2)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 同等功能的由（1)衍生的蛋白质。
[0012] 本发明还提供了所述小麦TaFAD2蛋白的编码基因 TaFAD2,优选地，所述基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员 可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0014] 所述小麦TaFAD2基因包含1164bp的开放阅读框架(核苷酸序列如SEQ ID N0. 2 所示)，TaFAD2蛋白含有387个氨基酸。
[0015] 本发明还提供了含有所述TaFAD2基因的载体。
[0016] 优选地，所述载体为 pEASY-Tl Simple-TaFAD2。
[0017] 本发明还提供了含有所述TaFAD2基因的重组表达载体。
[0018] 优选地，所述含有TaFAD2基因的重组表达载体为pCAM2300-35S-0cs- TaFAD2。
[0019] 所述载体pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2的构建过程如下：
[0020] (1)以中国春小麦（Triticum aestivum L.)小麦叶片为材料，提取RNA并反转录 获得cDNA，以cDNA为模板，以TaFAD2-F和TaFAD2-R为引物，进行PCR ;
[0021] TaFAD2-F ：TCGTCCCGTCAACAAGAGG (SEQ ID NO. 5)；
[0022] TaFAD2-R ：TCAGTTATTCCGCCATAAACA (SEQ ID NO. 6)；
[0023] 将PCR产物克隆连接到pEASY-TlSimple载体上，获得pEASY-Tl Simple- TaFAD2 ;
[0024] (2)用 Kpnl 和 Spel 酶切 pEASY-TlSimple-TaFAD2,得到 TaFAD2 片段，用 Kpnl 和 Spel酶切表达载体pCAM2300-35S-0cS，得到载体片段，将酶切得到的两个片段连接，获得 重组表达载体 pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2。
[0025] 其中，步骤（1)中PCR程序：95 °C预变性5分钟；95 °C变性30秒，56 °C退火30秒， 72 °C延伸2分钟，重复35次；72 °C延伸10分钟；
[0026] PCR 体系：
[0027] 2 X Easy Taq PCR SuperMix 12. 5 μ 1 ；
[0028] TaFAD2_F (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0029] TaFAD2_R (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0030] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0031] 双蒸水 补足25 μ 1。
[0032] 本发明还提供了含有所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括重组菌， 如大肠杆菌、农杆菌等，也包括植物细胞。
[0033] 本发明还提供了小麦TaFAD2蛋白在提高植物抗病性中的应用。
[0034] 所述应用为将小麦TaFAD2基因或含有小麦TaFAD2基因的重组表达载体导入植物 中过表达小麦TaFAD2蛋白，使植物产生抗病性。
[0035] 优选地，所述的抗病为抗白粉病。
[0036] 优选地，所述植物为小麦和拟南芥。
[0037] 优选地，所述应用为通过过表达小麦TaFAD2基因，调节SA，JA路径相关基因的表 达变化，从而使植株产生抗病性。小麦TaFAD2基因通过正向调控JA路径，负向调节SA路 径来参与调控对白粉病的抗性。
[0038] 本发明的有益效果如下：
[0039] 本发明可用于解决植株由于白粉病等真菌性病害导致的产量减少等问题，对抗白 粉病植物的培育和育种具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图1为本发明实施例1和实施例2小麦TaFAD2基因的克隆中间载体PEASY-T1 Simple的图谱；
[0041] 图2为本发明实施例1中小麦TaFAD2蛋白和基因对照图；
[0042] 图3为本发明实施例1中小麦TaFAD2与多序列的一致性比对结果；其中，0sFAD2 为水稻0sFAD2蛋白的氨基酸序列；AtFAD2为拟南芥AtFAD2蛋白的氨基酸序列；TaFAD2为 小麦TaFAD2蛋白的氨基酸序列；
[0043] 图4为本发明实施例3中mRNA相对表达量检测结果；其中，1、2、3为平行重复实 验；
[0044] 图5为本发明实施例3中不同植株的抗病性表型观察；
[0045] 图6为本发明实施例3中显微观察VIGS植株的叶片接种白粉菌5天后次生菌丝 的生长情况；
[0046] 图7为本发明实施例4中植物表达载体pCAM2300-35S-0cs的图谱；
[0047] 图8为本发明实施例5中过表达拟南芥植株与野生型拟南芥植株对白粉病的抗 性；
[0048] 图9为本发明实施例6中过表达拟南芥植株的RT-PCR阳性鉴定。

【具体实施方式】
[0049] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范 围。
[0050] 若未特别指明，本发明所用的各试剂和实验材料均可市售获得，实施例中所用的 技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0051] 本发明中涉及到的生物材料中国春小麦（Triticum aestivum L.)、硬 粒小麦 DR147 (Triticum durum)、二倍体粗山羊草（Aegilops taushii)Ae39、 小麦Am6、北京837均为公知公用品种，（各品种可参见Szyroki等，ΚΑΤΙ is not essential for stomatal opening，2001，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，98,2917-2921 ;Zhou等，Development of wheat near-isogenic lines for powdery mildew resistance, 2005, Theoretical and Applied Genetics，110,640-648)
[0052] 2 X Easy Taq PCR SuperMix、pEASY-Tl Simple Cloning Kit 均购自北京全式金 生物技术有限公司。
[0053] 白粉菌E09为公知公用品种（参见Li等，Comparative analysis of early H202 accumulation in compatible and incompatible wheat - powdery mildew interactions, 2005，Plant Pathology, 54, 308-316)。
[0054] BSMV:HSP90 载体为公知公用载体(参见 Wang 等，Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90(Hsp90):functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance, 2011，New Phytol, 191，418-431)。
[0055] GKP缓冲液的配制方法为：50mM甘氨酸、30mM磷酸氢二钾、1%皂土、1%硅藻土， ρΗ9· 2。
[0056] 实施例1小麦TaFAD2基因全长的克隆及编码蛋白的结构分析
[0057] 以中国春小麦（Triticum aestivum L.)小麦叶片为材料，提取RNA并反转录获得 cDNA，以cDNA为模板，以TaFAD2-F和TaFAD2-R为引物，利用PCR方法获得小麦TaFAD2基 因序列全长。
[0058] TaFAD2基因全长的引物序列：
[0059] TaFAD2-F ：TCGTCCCGTCAACAAGAGG (SEQ ID NO. 5)
[0060] TaFAD2-R ：TCAGTTATTCCGCCATAAACA (SEQ ID NO. 6)
[0061] PCR程序：95 °C预变性5分钟；95 °C变性30秒，56°C退火30秒，72 °C延伸2分钟， 重复35次；72 °C延伸10分钟。
[0062] PCR 体系：
[0063] 2 X Easy Taq PCR SuperMix 12. 5 μ 1 ；
[0064] TaFAD2_F (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0065] TaFAD2_R (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0066] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0067] 双蒸水 补足25 μ 1。
[0068] PCR产物切胶回收纯化后按照pEASY-Tl Simple Cloning Kit克隆方法克隆连 接到pEASY-Tl Simple载体上（pEASY-Tl Simple的图谱如图1所示)，连接产物转化大肠 杆菌DH5a，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得PEASY-T1 Simple- TaFAD2,其中， TaFAD2全长为1790bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；由其编码的蛋白质的氨基酸 序列如SEQ ID N0. 3所示。TaFAD2包含1164bp的开放阅读框架（SEQ ID N0. 2)，由此推测 TaFAD2蛋白含有387个氨基酸残基(小麦TaFAD2蛋白和基因对照图如图2所示)。根据软 件预测，该蛋白的分子量为44435. 35道尔顿，等电点为8. 29。将TaFAD2蛋白的氨基酸序列 与GenBank中所有氨基酸序列进行比较，结果显示TaFAD2蛋白与单子叶植物水稻中该基因 的直系同源基因 （NCBI Reference Sequence:NP_001047927. 1)的相似性较高，为88%，同双 子叶植物拟南芥中该基因的直系同源基因（GenBank:AAM61113. 1)的相似性为67%，多序列 一致性比对结果如图3所示。
[0069] 实施例2小麦TaFAD2基因的VIGS载体及VIGS植株
[0070] 以实施例1获得的cDNA为模板，以正向引物F和反向引物R为引导进行PCR扩增， PCR程序：95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，重复30次； 72 °C延伸10分钟。
[0071] 正向引物 F :CTAGCTAGC GGGGTCTTCTGGTACAGC (SEQ ID NO. 7);下划线为限制 性酶切位点。
[0072] 反向引物 R :CTA GCTAGC GACACGCTACTCTTTCCTTT (SEQID NO. 8);下划线为限 制性酶切位点。
[0073] PCR 体系：
[0074] 2XEasy Taq PCR SuperMixl2. 5μ 1 ；
[0075] 正向引物 F (10 μ Μ) 1 μ 1 ;
[0076] 反向引物 R (10 μ Μ) 1 μ 1 ;
[0077] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0078] 双蒸水 补足25 μ 1。
[0079] PCR产物切胶回收纯化后按照北京全式金生物技术有限公司提供的pEASY-Tl Simple Cloning Kit克隆方法克隆连接到pEASY-TlSimple载体上（图谱如图1所示)，连接 产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得TaFAD2的cDNA片 段，该片段序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0080] 大麦条纹花叶病毒（BSMV)载体由BSMV- a，BSMV- β，BSMV- γ三个组分构 成（参见 Holzberg 等，Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant[J]· The Plant Journal, 2002, 30(3) :315-327.)。将本实施例中测序正确 的pEASY-Tl Simple载体和BSMV- γ载体用NEB公司的Nhel酶切，回收酶切的231bp的 TaFAD2基因片段（SEQ ID NO. 4)和BSMV-γ载体片段，用T4 DNA连接酶（NEB公司）连接， 将TaFAD2的基因片段反向连接到BSMV-γ载体多克隆位点。将连接产物转化到大肠杆菌 DH5ci感受态中，菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证，获得序列正确的载体质粒即为重组 载体 BSMV-γ :TaFAD2。
[0081] 绿色突光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP)来源于海洋生物水母，其基因 可在异源组织中表达并产生荧光，GFP cDNA开放阅读框架长度约714bp，编码238个氨基酸 残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸一脱氢酪氨酸一甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个 发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。绿色荧光蛋白是常用的报告基因之 一。本研究中之所以选用绿色荧光蛋白作为对照，是因为该基因在植物体内没有任何同源 基因，因此携带GFP的BSMV载体不会沉默植物中的任何基因，可以作为基因下调表达的对 照。
[0082] 在病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing, VIGS)实验中， BSMV:GFP 用来作为阴性对照（参见 Li 等，Transcriptome Analysis of H202 -Treated Wheat Seedlings Reveals a H202-Responsive Fatty Acid Desaturase Gene Participating in Powdery Mildew Resistance, 2011, PLoS One, 6, 1-16;Cao等，Serine/ threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat, 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences,USA, 108, 7727-7732)。该载体构建过程与 BSMV- γ :TaFAD2载体相同，测序筛选得到正确的载体质粒即为BSMVi :GFP重组载体。
[0083] VIGS植株获得的方法步骤：
[0084] 1)获得 BSMV-α，BSMV-β，BSMV-γ :TaFAD2 和 BSMV-γ :GFP 质粒，BSMV-α， BSMV-γ :TaFAD2 和 BSMV-γ :GFP 用 Mlul 酶切，BSMV-β 用 Spel 酶切，37°C，8h。线性化处 理，50 μ 1NEB酶切体系如下：
[0085] Mlul ：
[0086] 10 XNEB 缓冲液：5 μ 1
[0087] 质粒： 彡 2 μ g
[0088] Mlul ： 1 μ 1
[0089] 加灭菌双蒸水至50 μ 1
[0090] Spel ：
[0091] 10XNEB 缓冲液：5μ1
[0092] 质粒： 彡 2 μ g
[0093] 100XBSA ： 0. 5 μ 1
[0094] Mlul ： 1 μ 1
[0095] 加灭菌双蒸水至50 μ 1
[0096] 2)乙醇沉淀
[0097] 分别取150 μ 1 1)中四种线性化好的质粒，分别加350 μ 1DEPC (Diethyl pyrocarbonate)H20,加500μ 1酚氯仿(苯酚和氯仿体积比为1:1),12000 rpm离心30min。 取上清450μ1，加45μ1 NaAc (PH 5. 2,3M)，加 lml冷（4°C)无水乙醇，混匀。-20°C过夜。 12000rpm离心30 min,倒掉上清，lml 70%乙醇重复洗两次，瞭干，分别加30ylDEPC H20溶 解。浓度应> 400ng/yl。
[0098] 3)体外转录试剂盒使用北京GBI公司提供的AmpliCap-Max?T7and T3High Yield Message Maker Kits (Epicentre, USA),分别以2)中得到的四种经过乙醇沉淀处理的质粒 为模板进行体外转录，得到BSMV-α、BSMV-P、BSMV-γ :TaFAD2、BSMV-γ :GFP的转录物。
[0099] 10 μ 1反应体系：
[0100] 模板： 3μ1
[0101] 10χ转录缓冲液： Ιμ?
[0102] Cap/NTP 预混液： 4μ1
[0103] 100mM 二硫苏糖醇：1 μ 1
[0104] Τ7 酶： Ιμ?
[0105] 42°C，3h，4°C，保温。
[0106] 4)病毒接种
[0107] BSMV-α、BSMV-3、BSMV-Y :TaFAD2(或 BSMV-γ :GFP)转录物各取 10μ 1 混合，共 30μ 1，加3倍体积（90μ 1)的DEPC Η20,总体积达到120μ 1，再加一倍体积（120μ 1)的GKP buffer，制得240 μ lTaFAD2的接种病毒混合液和240 μ 1GFP的接种病毒混合液。
[0108] 用于病毒侵染的小麦材料选用抗白粉病近等基因系PmAm6/北京837*BC5F 3 (PmAm6/北京837*BC5F3制备方法：以四倍体硬粒小麦（Triticum durum) DR147为母本，以 二倍体粗山羊草（Aegilops taushii)Ae39为父本，人工合成六倍体小麦Am6。以Am6为供 体亲本，以北京837为轮回亲本，从杂交Fi中筛选抗白粉病单株，与北京837回交，从每次 回交后代中筛选抗病单株。从回交5代的F 3家系中筛选纯合抗病单株，即为PmAm6/北京 837*BC5F3)。待小麦幼苗第二片叶展平时（14d)，开始接种。戴刚开封橡胶手套，用处理过的 无 RNA酶的枪头取5-10 μ lTaFAD2或GFP的接种病毒混合液接种液到食指肚上，一手固定 住小麦幼苗基部，另一手用大拇指和食指轻轻来回摩擦小麦第二片叶。
[0109] 接种完后，向小麦幼苗喷施DEPC H20,保鲜膜覆盖，保湿24h (高湿有利于病毒侵 入)，之后揭开。温度在20-32°C之间均可(温度升高不利于病毒侵入，且叶片长的很快)。
[0110] 6-8天后，第三片叶产生病毒斑，即为病毒接种成功，得到BSMV:TaFAD2和 BSMV:GFP 的 VIGS 植株。
[0111] 实施例3VIGS实验证明TaFAD2基因参与白粉病抗性反应
[0112] 1) TaFAD2的VIGS植株中TaFAD2的表达检测
[0113] 从实施例2中获得的BSMV:TaFAD2和BSMV:GFP的VIGS植株经荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测TaFAD2的表达，结果如图4所示，在TaFAD2的VIGS植株中检测TaFAD2的 表达变化，发现TaFAD2基因的确下调。为了避免意外将其他基因沉默（off target)，所以 同时检测了小麦中与TaFAD2相似性最高的TaFAD6基因的表达变化，结果显示TaFAD6表达 不变，说明该VIGS植株没有把TaFAD2以外的家族其他成员基因沉默，以下进行的表型及功 能研究均为TaFAD2基因的下调产生的。
[0114] 2) BSMV:TaFAD2的VIGS植株的表型观察
[0115] 实施例2中获得的BSMV:TaFAD2和BSMV:GFP的VIGS植株在培养箱一起培养至第 四叶展平，将有病毒发病表型的植株叶片剪下，放在苯并咪唑培养基上接种白粉菌E09培 养一周（下文分别称为BSMV:TaFAD2和BSMV:GFP)。同时，将正常的北京837 (Bj)同样接 种白粉菌E09 (下文称Bj)、正常的PmAm6/北京837*BC5F3 (以下简称PmA)对照（Mock)接 种GKP缓冲液(下文称Mock)，BSMV:HSP90的VIGS植株（BSMV:HSP90VIGS植株的获得方法 同 BSMV: TaFAD2 和 BSMV: GFP )接种白粉菌 E09 (下文称 BSMV: HSP90 )。
[0116] BSMV:HSP90 载体为公知公用载体(参见 Wang 等，Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein90(Hsp90):functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance, 2011，New Phytol, 191，418-431)。
[0117] 上述不同植株的抗病性表型观察如图5所示，北京837 (Bj)为感病对照，叶片表 面均匀长满了白粉菌孢子，表明白粉菌的接种没有问题;Mock接种GKP缓冲液，叶片表面干 净，没有一个孢子堆，排除摩擦损伤叶片产生的影响；BSMV:GFP为带有水母的绿色荧光蛋 白（GFP)基因的病毒，GFP基因在植物体内没有任何同源基因，因此BSMV:GFP载体不会沉默 植物中的任何基因，可以作为基因下调表达的对照。该叶片表面有白色条纹状的病斑，说明 病毒侵染成功，叶片表面干净，没有生长白粉菌孢子堆，说明BSMV病毒不会影响植株的抗 病性；BSMV:HSP90在VIGS实验中常常作为病毒体系正常工作的阳性对照，因为HSP90是病 原菌入侵时，植物产生过敏反应（hypersensitive reaction,HR)所必需的。BSMV:TaFAD2为 带有目标基因片段TaFAD2的载体，该叶片表面长有肉眼可见的白色孢子堆，同BSMV:HSP90 载体的表型一致，证明小麦TaFAD2基因参与白粉病抗性反应。
[0118] 3) BSMV:TaFAD2的VIGS植株的显微观察
[0119] 显微观察材料的步骤：
[0120] (1)脱色
[0121] 脱色液的配置：1. 5g/L三氯乙酸醇溶液(溶于无水乙醇):三氯甲烷=4:1(体积比)。 将待观察的叶片侵泡在脱色液中48h，24h换一次脱色液(如脱色不完全可以适当延长脱色 时间）。
[0122] (2)染色
[0123] 染色液的配置：lg/L苯胺蓝水溶液(溶于水)。染色时，将叶片从脱色液中取出，先 在双蒸水中清洗3s，然后放入染色液中染色10s，再将叶片在干净的水中快速清洗，去掉表 面多余的染色液，最后放入50%的甘油中保存(保持渗透压，防止细胞因吸水涨破)。
[0124] 将VIGS植株的第四片叶离体接种白粉菌，在离体培养基上培养5天后，VIGS植株 的叶片接种白粉菌5天后次生菌丝的生长情况的显微观察结果如图6所示，BSMV:GFP的 VIGS植株的叶片中只有处于附着孢芽管状态的孢子，没有长出次生菌丝，该图为物镜放大 40倍观察结果；BSMV:TaFAD2的VIGS植株同BSMV:HSP90观察结果一致，部分孢子有次生菌 丝长出，生长状态同感病的北京837 -致，其余孢子生长状态同BSMV:GFP -样，没有长出次 生菌丝。
[0125] 这两张图片为物镜放大20倍数观察结果。
[0126] (3)次生菌丝的统计
[0127] 在显微镜下，统计每片叶上接上的总白粉菌孢子数及有次生菌丝长出的孢子数。 计算百分比，即为白粉菌侵染率。每次统计三片叶，共进行三次生物学重复。对接菌孢子数 和长出次生菌丝的孢子数进行统计，从而计算出白粉菌的侵染概率。统计结果如表1所示， 感病材料北京837 (Bj)的白粉侵染率为47. 83%，TaFAD2和HSP90VIGS植株的白粉侵染率 分别为28. 06%和27. 12%，VIGS材料的白粉侵染率是感病材料的一半左右，远远不同于Mock 和BSMV:GFP(白粉侵染率为0)，所以统计结果显示：TaFAD2与HSP90基因同样，参与白粉病 抗性反应。
[0128] 表1各植株的白粉菌的侵染概率
[0129]

【权利要求】
1. 小麦TaFAD2蛋白，其特征在于，所述蛋白为： (1) SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等 功能的由（1)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因 TaFAD2。
3. 根据权利要求2所述的TaFAD2基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有权利要求2或3所述TaFAD2基因的重组表达载体。
5. 根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述重组表达载体为 pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2。
6. 根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2的构 建过程如下： (1) 以中国春小麦叶片为材料，提取RNA并反转录获得cDNA，以cDNA为模板，以 TaFAD2-F 和 TaFAD2-R 为引物，进行 PCR ; TaFAD2-F ：TCGTCCCGTCAACAAGAGG ； TaFAD2-R ：TCAGTTATTCCGCCATAAACA ； 将 PCR 产物克隆连接到 pEASY-TlSimple 载体上，获得 pEASY-TlSimple-TaFAD2 ; (2) 用 ΚρηΙ 和 Spel 酶切 pEASY-TlSimple-TaFAD2,得到 TaFAD2 片段；用 ΚρηΙ 和 Spel 酶切表达载体pCAM2300-35S-0cs，得到载体片段，将酶切得到的两个片段连接，获得重组表 达载体 pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2。
7. 根据权利要求6所述的载体，其特征在于，步骤（1冲PCR程序：95°C预变性5分钟； 95°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分钟，重复35次；72°C延伸10分钟； PCR体系： 2X Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μ 1 ； TaFAD2-F (10 μ Μ) 1 μ 1 ； TaFAD2-R (10 μ Μ) 1 μ 1 ； cDNA 模板 2 μ 1 ; 双蒸水 补足25 μ 1。
8. 含有权利要求4-7任一项所述重组表达载体的宿主细胞。
9. 权利要求1所述TaFAD2蛋白在提高植物抗病性中的应用，所述应用为将权利要 求2或3所述TaFAD2基因或权利要求4-7任一项所述的重组表达载体导入植物中过表达 TaFAD2蛋白，使植物产生抗病性。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抗病为抗白粉病。
【文档编号】C12N9/02GK104152420SQ201310177666
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】毛龙, 李爱丽, 武亮, 耿帅锋 申请人:中国农业科学院作物科学研究所