一种dna检测试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明实施例提供了一种DNA检测试剂盒，包括脂质体-量子点复合物标记的检测DNA、磁珠修饰的捕捉DNA，所述脂质体-量子点复合物中，所述脂质体包裹多个单颗粒量子点，检测DNA通过酰胺键结合在所述脂质体表面，所述磁珠修饰的捕捉DNA中，捕捉DNA通过酰胺键结合在所述磁珠表面，所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补。该试剂盒检测灵敏度高，达到10-18mol/L，且可用于多组分DNA的同时检测。本发明实施例还提供了上述DNA检测试剂盒的制备方法和应用。
【专利说明】—种DNA检测试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA检测领域，特别是涉及一种DNA检测试剂盒及其制备方法和应用。【背景技术】
[0002]在现有的DNA检测技术中，基于PCR的目标扩增技术最为常用，但它需要多种引物，特殊的DNA聚合酶，以及精确控制的循环温度来分离DNA双链。目前，已逐步发展了一些恒温扩增技术，如滚环扩增，链置换扩增和环介导等温扩增等，这些恒温扩增法提高了目标分子扩增效率，但仍需要一些特殊的处理方法和反应条件，如预先热处理变性，锁式探针连接，多种引物和特殊的DNA聚合酶等，因而这类方法都较为复杂且花费较高。
[0003]而基于单颗粒量子点的DNA探针，结合单分子检测技术，目标DNA的检测对应于量子点的荧光亮点数，该方法较简单，具有高的信躁比，并可进行痕量检测，但其灵敏度的提高主要受限制于量子点数目与所组装的目标DNA分子数目，检测灵敏度只能达到10_15mol/L0
【发明内容】
[0004]鉴于此，本发明实 施例第一方面提供了一种DNA检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，达到10_18mol/L，且可用于多组分DNA的同时检测。本发明实施例第二方面提供了一种DNA检测试剂盒的制备方法，该方法操作简便。本发明实施例第三方面提供了 DNA检测试剂盒在检测DNA中的应用。
[0005]第一方面，本发明实施例提供了一种DNA检测试剂盒，包括脂质体-量子点复合物标记的检测DNA、磁珠修饰的捕捉DNA,所述脂质体-量子点复合物中，所述脂质体包裹多个单颗粒量子点，检测DNA通过酰胺键结合在所述脂质体表面，所述磁珠修饰的捕捉DNA中，捕捉DNA通过酰胺键结合在所述磁珠表面，所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补。
[0006]本发明中，所述脂质体的种类不做特殊限制，脂质体可以为在特定条件下可以有效破碎并释放出量子点的其它脂质体类似结构的材料。所述特定条件可为有机溶剂溶解、超声、热处理等破碎方法。
[0007]优选地，所述脂质体可被氯仿溶剂有效破碎，使所述被包裹的多个单颗粒量子点释放出来。
[0008]所述脂质体由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，羧基化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-C00H)和胆固醇形成。
[0009]本发明第一方面提供的DNA检测试剂盒，以脂质体-量子点复合物为目标DNA分子的荧光标记物，旨在增加量子点的数目，使得一个目标DNA分子对应多个量子点荧光信号，从而提高了该试剂盒的检测灵敏度，达到10_18mol/L，且可用于多组分DNA的同时检测。
[0010]第二方面，本发明实施例提供了一种DNA检测试剂盒的制备方法，包括:
[0011](I)脂质体-量子点复合物标记的检测DNA的制备方法,包括如下步骤:[0012](Ia)将脂质体的原料与量子点加入到反应器中，加入氯仿，在35~45°C均匀混合后，蒸干氯仿，氮气或氩气吹干，再加入磷酸盐缓冲溶液，超声震荡4~6min后，采用微孔过滤膜来回挤压过滤多次，得到脂质体-量子点复合物；
[0013](Ib)将表面羧基功能化的脂质体-量子点复合物，采用1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)活化10~15min，然后采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化15~30min，再加入氨基封端的检测DNA，室温反应1.5~2.5h，得到脂质体-量子点复合物标记的检测DNA ；
[0014](2)磁珠修饰的捕捉DNA的制备方法，包括如下步骤:
[0015]以1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，将氨基封端的捕捉DNA与羧基功能化的磁珠混合反应1.5~2.5h，磁性分离，离心纯化，除去未反应的捕捉DNA，得到磁珠修饰的捕捉DNA，所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补。
[0016]本发明中，所述脂质体的种类不做特殊限制，脂质体可以为在特定条件下可以有效破碎并释放出量子点的其它脂质体类似结构的材料。所述特定条件可为有机溶剂溶解、超声、热处理等破碎方法。
[0017]优选地，所述脂质体的原料为形成的脂质体可将多个单颗粒量子点包裹，并可被氯仿溶剂有效破碎，使所述被包裹的多个单颗粒量子点释放出来。
[0018]优选地，所述脂 质体的原料为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，羧基化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-C00H)和胆固醇。
[0019]优选地，所述微孔过滤膜为聚碳酸酯膜或聚醚砜膜。
[0020]优选地，所述磁性分离的具体操作为:将得到的产物置于磁力架上利用外磁场分离I~2min。
[0021 ] 第三方面，本发明实施例提供了上述的DNA检测试剂盒在检测DNA中的应用，应用的具体方法包括如下步骤:
[0022]按检测DNA和捕捉DNA的摩尔比例为1:1，将脂质体-量子点复合物标记的检测DNA与磁珠修饰的捕捉DNA混合，加入到含有目标DNA的溶液中，再向混合体系中加入缓冲液，所述缓冲液的组成为 IOOmmol, pH8.0 的 Tris-HCl, IOmmol (NH2)2SO4 和 3mmol MgCl2,控制温度为40~45°C进行杂化反应30min后,置于磁力架上分离I~2min,得到纯化后的杂交产物；所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补；
[0023]将得到的所述杂交产物用超纯水洗涤，蒸干水汽，氮气或氩气吹干后，加入I~3倍体积的氯仿，所述杂交产物分散于氯仿中，得到均相溶液，脂质体破碎，单颗粒量子点释放到溶液中，磁性分离后，取上层溶液进行单分子检测。
[0024]优选地，所述含有目标DNA的溶液中，所述目标DNA为一种或多种。
[0025]优选地，所述目标DNA为多种时，采用不同颜色的量子点对不同目标DNA进行标记。这样操作，利用单分子检测技术计数，各组分的检测结果不会产生相互干扰。
[0026]本发明提供的DNA检测试剂盒及其制备方法和应用具有如下有益效果:
[0027](I)本发明将单颗粒量子点包裹于生物相容的脂质体中，从而显著增多量子点的数目，以形成的脂质体-量子点复合物来标记检测DNA，以磁珠修饰捕捉DNA，有利于进行简单的磁性分离和纯化，当脂质体-量子点复合物标记的检测DNA和以磁珠修饰的捕捉DNA，与目标DNA杂交结合时，形成经典的“三明治”杂交结构，从而建立了一个目标DNA分子与多个单颗粒量子点荧光信号的对应关系，结合单分子检测技术，因而能够显著提高检测灵敏度，实现超灵敏的DNA检测，其检测限达到10_18mol/L ；
[0028] (2)本发明采用氯仿将脂质体有效破碎，量子点能够完全释放出来且对荧光性能无影响，操作过程简便；
[0029](3)本发明提供的DNA检测试剂盒，可进行多组分DNA的同时检测；
[0030](4)本发明提供的超灵敏的检测DNA的方法，对于生物医学、临床诊断以及基因表达研究具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明提供的DNA检测试剂盒结合单分子检测技术用于DNA检测的整体方案设计图；
[0032]图2为实施例1中制备的绿色量子点和红色量子点的TEM照片；
[0033]图3为实施例1中绿色量子点和红色量子点的紫外光谱图；
[0034]图4为实施例1中绿色量子点和红色量子点的荧光光谱图；
[0035]图5为实施例1中脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的荧光显微镜照片；
[0036]图6为实施例1中脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的尺寸分布图；
[0037]图7为实施例1脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的荧光光谱图；
[0038]图8为实施例1脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的TEM照片；
[0039]图9为实施例1中从脂质体中释放出的绿色量子点和红色量子点的尺寸分布图；
[0040]图10为实施例1中各阶段量子点的荧光谱图；
[0041]图11为实施例1中各阶段量子点的紫外光谱图；
[0042]图12、图13、图14为实施例1的单分子检测结果图。
【具体实施方式】
[0043]以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
[0044]本发明提供一种DNA检测试剂盒，包括脂质体-量子点复合物标记的检测DNA、磁珠修饰的捕捉DNA,所述脂质体-量子点复合物中，所述脂质体包裹多个单颗粒量子点,检测DNA通过酰胺键结合在所述脂质体表面，所述磁珠修饰的捕捉DNA中，捕捉DNA通过酰胺键结合在所述磁珠表面，所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补。
[0045]本发明的DNA检测试剂盒可根据待测目标DNA溶液的具体组成而进行设
[0046]计。图1为本发明提供的DNA检测试剂盒结合单分子检测技术用于DNA检测的整体方案设计图。图1中，α)合成脂质体-量子点复合物，合成脂质体-量子点复合物标记的检测DNA，以及合成磁珠修饰的捕捉DNA ; (ii)目标DNA诱导的“三明治”杂交结构的形成及磁性分离；(iii )脂质体破碎，单颗粒检测量子点数目。
[0047]实施例1
[0048]目标DNA包括目标DNAl和目标DNA2,其序列分别为:
[0049]目标 DNAl (HIV-1):5’ -GCT ATA CAT TCT TAC TAT TTT ATT TAA TCC CAG-3’
[0050]目标 DNA2 (HIV-2):5，-TAG ATTT AGT TGC GCCT GGT CCT TT-3’
[0051 ] 根据上述的目标DNAl和目标DNA2设计DNA检测试剂盒，具体地，在本实施例中，DNA检测试剂盒包括脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNAl，脂质体-红色量子点复合物标记的检测DNA2，磁珠修饰的捕捉DNAl，磁珠修饰的捕捉DNA2 ；
[0052]其中，检测DNAl、检测DNA2、捕捉DNAl和捕捉DNA2的序列号为:
[0053]检测DNAl: 5，-CTG GGA TTA AAT AAA A-A10_3，
[0054]检测DNA2:5，-AAA GGA CCA GGC-A1(l-3，
[0055]捕捉DNAl: 5，-A10-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3，
[0056]捕捉DNA2:5，-A10-GCA ACT AAA TTC A_3’
[0057]在本实施例中， 脂质体由DSPC、DSPE-PEG-C00H、以及胆固醇形成，在其他实施方式中，脂质体可以为在有机溶剂、超声、热处理等破碎条件下可以有效破碎并释放出量子点的其它脂质体类似结构的材料。
[0058]上述的DNA检测试剂盒的制备方法，包括:
[0059](I)脂质体-量子点复合物标记的检测DNA的制备方法,包括如下步骤:
[0060](a)量子点的合成
[0061]硒储备液的制备:在手套箱中将20mmol硒粉溶于20mL三辛基膦中，并将硒储备液保存于手套箱中；
[0062]合成十八胺修饰的红色荧光量子点:0.2mmol氧化镉和0.8mmol硬脂酸置于25mL三颈瓶中，在氩气保护下升温到120°C至氧化镉溶解，再升温至220°C生成白色硬脂酸镉，然后冷却至室温,加入1.6g十八胺和7mL十八碳烯,升温至100°C维持20min,然后进一步升温到270°C得到无色透明溶液，在此温度下，迅速注入2mL硒储备液，将反应温度降低至2500C，维持5min后停止反应。待体系温度降至80°C左右用甲醇和正己烷萃取纯化处理三次，将得到的红色荧光量子点保存于冰箱中；
[0063]合成十六胺修饰的绿色荧光量子点:0.2mmol氧化镉和0.8mmol硬脂酸置于25mL三颈瓶中，在氩气保护下升温到120°C至氧化镉溶解，再升温至220°C生成白色硬脂酸镉，然后冷却至室温，加入0.7g十六胺和SmL十八碳烯，升温至100°C维持20min得到无色透明溶液，继续升高温度至300°C，后撤去热源，再迅速注入2mL硒储备液和2mL十八碳烯。待体系温度降至80°C左右用甲醇和正己烷萃取纯化处理三次，将得到的绿色荧光量子点保存于冰箱中。
[0064](b)脂质体-量子点复合物的制备
[0065]将上述得到的量子点离心并溶于氯仿中，通过紫外、荧光光谱确定其浓度，将24 μ L, 0.lmol/L DSPC ；4 μ L, 1.0mmoI/L DSPE-PEG-COOH ;以及 15 μ L, 50mmol/L 胆固醇和1.211|1量子点加入圆底烧瓶中，再加入31^氯仿，在35-451:均匀混合。再用旋转蒸发仪挥发氯仿，三颈瓶内壁形成一层薄膜，通氩气吹干。再向三颈瓶中加入2mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，约30°C超声振荡至薄膜溶解。通过聚碳酸酯膜来回过滤三次，将得到的脂质体-量子点复合物室保存。采用上述方法分别制得脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物；
[0066](C)脂质体-绿色量子点复合物标记检测DNAl的制备:将表面羧基功能化的脂质体-绿色量子点复合物用0.1mmol EDC活化15min,后加入25 μ mo I NHS活化30min。再加入24nmol氨基封端的检测DNA1,室温反应2h后,离心纯化lOmin。
[0067]脂质体-红色量子点复合物标记检测DNA2的制备:将表面羧基功能化的脂质体-红色量子点复合物用0.1mmol EDC活化15min,后加入25 μ mo I NHS活化30min。再加入24nmol氨基封端的检测DNA2,室温反应2h后,离心纯化lOmin。
[0068]其中，氨基封端的检测DNAl: 5 ’ -CTG GGA TTA AAT AAA A-A10-NH2-3 ’，氨基封端的检测 DNA2:5’ -AAA GGA CCA GGC-A1(l-NH2-3’。
[0069](2)磁珠修饰的捕捉DNA的制备方法，包括如下步骤:
[0070]以1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，将25nmol氨基封端的捕捉DNAl与0.1mmol活化的羧基功能化的磁珠混合反应2h，得到的产物置于磁力架上约lmin，进行磁力分离并离心纯化，除去未反应的捕捉DNA1，得到磁珠修饰的捕捉DNAl ；
[0071]以1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，将25nmol氨基封端的捕捉DNA2与0.1mmol活化的羧基功能化的磁珠混合反应2h，得到的产物置于磁力架上约lmin，进行磁力分离并离心纯化，除去未反应的捕捉DNA2，除去未反应的捕捉DNA2，得到磁珠修饰的捕捉DNA2 ；
[0072]氨基封端的捕捉DNAl: 5’ -NH2-A10-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3’
[0073]氨基封端的捕捉DNA2:5’ -NH2-A10-GCA ACT AAA TTC A_3’。
[0074]上述制得的DNA检测试剂盒的具体应用方法，包括:
[0075](1) “三明治”杂交结构的形成:
[0076]配制缓冲液组成为IOOmM Tris-HCl, ρΗ8.0, IOmM(NH2)2SO4, 3mMMgCl2,加入目标DNAl和目标DNA2，控制检测DNAl和捕捉DNAl的摩尔比例为1:1，检测DNA2和捕捉DNA2的摩尔比例为1:1，将脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNA1、磁珠修饰的捕捉DNAlJg质体-红色量子点复合物标记的检测DNA2、磁珠修饰的捕捉DNA2，加入到在缓冲液中，控制温度为45°C，杂交反应30min。将得到的产物置于磁力架上约lmin，利用外磁场进行分离和纯化。
[0077](2)脂质体破碎:
[0078]将得到的“三明治”杂交产物用超纯水洗两次，用旋转蒸发仪将水份挥发，通入氩气吹干至水份完全挥发。加入2倍体积氯仿，产物迅速分散得到均相溶液，脂质体破碎，单颗粒量子点从中释放出来，利用磁性分离取出上层溶液，进行单分子检测。
[0079](3)单分子检测
[0080]单分子检测装置包括激光系统、进样系统、光路系统和数据采集分析系统。其中，激光系统包括第一激光器、第二激光器和校准器；进样系统包括动载物台和微流泵；光路系统包括第一分光片、第二分光片、通光孔、显微物镜、第一滤光片、第二滤光片、第一聚焦镜、第二聚焦镜；数据采集分析系统包括第一检测器、第二检测器、数据采集器和计算机终端。利用单分子检测装置对从脂质体中释放出的绿色量子点和红色量子点进行计数。以488nm的氩激光器为激发光源，通过一个二向色镜反射后经油浸型物镜的倒置显微镜聚焦，显微物镜的数值孔径为1.3，最后在通光孔内径为50μπι的通道中激发样品。绿色量子点和红色量子点爆发的光子经过第一分色镜，然后经过50 μ m的孔道，再由第二分色镜进行分离。绿色量子点爆发的信号经带通滤波器过滤后，通过雪崩光电二极管在绿色通道中检出，同时，红色量子点爆发的信号经另一带通滤波器过滤后，通过雪崩光电二极管在红色通道中检出，最后由数据采集器和计算机终端对第一检测器和第二检测器的检测结果进行采集处理。
[0081]图2为本实施例制备的绿色量子点和红色量子点的TEM照片，其中a为绿色量子点的TEM照片，b为红色量子点的TEM照片。照片说明已成功合成了高质量的绿色量子点和红色量子点。从TEM照片可以看出所得到绿色量子点和红色量子点高度分散且尺寸均一。
[0082]图3中，a、b分别为本实施例的绿色量子点和红色量子点的紫外光谱图。图4中，a、b分别为本实施例的绿色量子点和红色量子点的荧光光谱图。通过紫外，荧光光谱测定，计算出绿色量子点的平均尺寸为2.8±0.25nm，红色量子点的平均尺寸为4.6±0.34nm。图4的荧光光谱图显示绿色量子点荧光发射位置在537nm，红色量子点荧光发射位置在612nm。
[0083]图5的a和b分别为本实施例脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的荧光显微镜照片。由此看出脂质体-量子点复合物具有极强的荧光性能且尺寸较均一。
[0084]图6的a和b分别为本实施例脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的尺寸分布图。图6的尺寸分布柱形图通过动态光散射测量得到，表明脂质体-绿色量子点复合物的平均尺寸为82±3.8nm，脂质体-红色量子点复合物的平均尺寸为90 ±3.5nm。
[0085]图7为本实施例脂质体 -绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的荧光光谱图。其中曲线I代表脂质体-绿色量子点复合物，曲线2代表脂质体-红色量子点复合物。与原始绿色量子点和红色量子点(图4所示)相比，荧光发射峰位有5~7nm的红移现象。表面电位测试表明脂质体-绿色量子点复合物的表面电位为-32.7mV,脂质体-红色量子点复合物的表面电位为-37.2mV。
[0086]上述表征说明量子点已成功包覆于脂质体中，且脂质体-量子点复合物由于表面负电荷的静电斥力作用而具有良好稳定性。另外，对脂质体-量子点复合物进行了 TEM表征，如图8所示，其中，a为脂质体-绿色量子点复合物TEM照片，c为脂质体-红色量子点复合物TEM照片，b和d分别为脂质体-绿色量子点复合物和脂质体-红色量子点复合物的高分辨TEM照片，TEM照片可以看出成百上千的单颗粒量子点已被包覆于脂质体中，结合理论模型计算，证明一个脂质体可包裹约1063个绿色量子点，648个红色量子点。
[0087]图9的a和b分别为本实施例从脂质体中释放出的绿色量子点和红色量子点的尺寸分布图。脂质体破碎后，量子点由水相转移至氯仿相中，表现出良好的单分散性和极强的荧光。对破碎后的量子点进行尺寸分析，尺寸分布图表明释放出的绿色量子点平均尺寸为
2.5±0.28nm，红色量子点平均尺寸为4.3±0.45nm，分别与原始的单颗粒绿色量子点和红色量子点相近。[0088]另外，如图10所示，其中，a图中曲线I为原始绿色量子点荧光谱图，曲线2为脂质体-绿色量子点复合物荧光谱图，曲线3为从脂质体中释放出的绿色量子点荧光谱图；b图中曲线I为原始红色量子点荧光谱图，曲线2为脂质体-红色量子点荧光谱图，曲线3为从脂质体中释放出的红色量子点荧光谱图。
[0089]如图11所示，a图中曲线I为原始绿色量子点紫外光谱图，曲线2为脂质体-绿色量子点紫外光谱图，曲线3为从脂质体中释放出的绿色量子点紫外光谱图；b图中曲线I为原始红色量子点紫外光谱图，曲线2为脂质体/红色量子点紫外光谱图，曲线3为从脂质体中释放出的红色量子点紫外光谱图。图10和图11中的荧光光谱、紫外光谱也表明释放出的量子点与原始量子点在荧光发射位置，紫外最大吸收位置上都没有明显差别，进一步说明量子点的成功释放。
[0090]为证明本发明有益效果，提供如下对照试验:当仅有目标DNAl存在时，以及当仅有目标DNA2存在时，采用本实施例的DNA检测试剂盒进行检测。
[0091]图12为单分子检测结果。如图12a所示，当仅有目标DNAl存在时，只能检测到绿色量子点信号，而没有检测到红色量子点信号。如图12b所示，当仅有目标DNA2存在时，只能检测到红色量子点信号，而并没有检测到绿色量子点信号。当同时存在目标DNAl和目标DNA2时，如图12c，两个通道中可分别检测到绿色量子点和红色量子点信号，且两者没有明显的干扰。图13为绿色量子点和红色量子点荧光光子爆发数随目标DNAl和目标DNA2浓度变化的关系。从对照实验中可以看出，当加入非互补的DNA时，绿色量子点和红色量子点的荧光信号均不能检测到，说明单分子检测技术信躁比高，并由此得出脂质体-绿色量子点用于检测目标DNAl的检测限为1.0X 10_18mOl/L，脂质体-红色量子点用于检测目标DNA2的检测限为2.5X 10_18mol/L。另外，由于绿色量子点和红色量子点间不会发生明显的光谱重叠，此技术可成功用于多组分量子点的同时检测，如图14所示，为确定浓度下(目标DNAl和目标DNA2和浓度为0.1fM,脂 质体-量子点复合物标记的检测DNA和磁珠修饰的捕捉DNA浓度均为1.2 μ m),同时检测目标DNAl和目标DNA2的柱形图。图14显示，目标DNAl和目标DNA2同时存在时，检测到的绿色量子点和红色量子点的数目与目标DNAl和目标DNA2分别存在时的结果相一致。
[0092]实施例2
[0093]目标DNA只包括目标DNAl,其序列为:
[0094]目标 DNAl (HIV-1):5’ -GCT ATA CAT TCT TAC TAT TTT ATT TAA TCC CAG-3’
[0095]根据上述的目标DNAl设计DNA检测试剂盒，具体地，在本实施例中，DNA检测试剂盒包括脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNA1,磁珠修饰的捕捉DNAl ；
[0096]其中，检测DNAl、捕捉DNAl的序列号为:
[0097]检测DNAl: 5，-CTG GGA TTA AAT AAA A-A10_3，
[0098]捕捉DNAl: 5，-A10-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3，
[0099]在本实施例中，脂质体由DSPC、DSPE-PEG-C00H、以及胆固醇形成，在其他实施方式中，脂质体可以为在有机溶剂、超声、热处理等破碎条件下可以有效破碎并释放出量子点的其它脂质体类似结构的材料。
[0100]上述的DNA检测试剂盒的制备方法，包括:
[0101](I)脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNAl的制备方法[0102]同实施例1。
[0103](2)磁珠修饰的捕捉DNAl的制备方法
[0104]同实施例1。
[0105]上述制得的DNA检测试剂盒的具体应用方法，包括:
[0106](I) “三明治”杂交结构的形成:
[0107]配制缓冲液组成为IOOmM Tris-HCl, pH8.0, IOmM(NH2)2SO4, 3mM MgCl2,加入目标DNAl，控制检测DNAl和捕捉DNAl的摩尔比例为1:1，将脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNAl和磁珠修饰的捕捉DNAl，加入到缓冲液中，控制温度为40°C，杂交反应30min。将得到的产物置于磁力架上约lmin，利用外磁场进行分离和纯化。
[0108](2)脂质体破碎:
[0109]将得到的“三明治”杂交产物用超纯水洗两次，用旋转蒸发仪将水份挥发，通入氩气吹干至水份完全挥发。加入3倍体积氯仿，产物迅速分散得到均相溶液，脂质体破碎，单颗粒量子点从中释放出来，利用磁性分离取出上层溶液，进行单分子检测。
[0110]实施例3
[0111]目标DNA只包括目标DNA2,其序列为:
[0112]目标 DNA2 (HIV-2):5，-TAG ATTT AGT TGC GCCT GGT CCT TT-3’
[0113]根据上述的目标DNA2设计DNA检测试剂盒，具体地，在本实施例中，DNA检测试剂盒包括脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNA2,磁珠修饰的捕捉DNA2 ；
[0114]其中，检测DNA2、捕捉DNA2的序列号为:
[0115]检测DNA2:5’ -AAA GGA CCA GGC-A1(l-3’
[0116]捕捉DNA2:5’ -A10-GCA ACT AAA TTC A_3’
[0117]在本实施例中，脂质体由DSPC、DSPE-PEG-C00H、以及胆固醇形成，在其他实施方式中，脂质体可以为有机溶剂、超声、热处理等破碎条件下可以有效破碎并释放出量子点的其它脂质体类似结构的材料。
[0118]上述的DNA检测试剂盒的制备方法，包括:
[0119](I)脂质体-红色量子点复合物标记的检测DNA2的制备方法
[0120]同实施例1。
[0121](2)磁珠修饰的捕捉DNA2的制备方法
[0122]同实施例1。
[0123]上述制得的DNA检测试剂盒的具体应用方法，包括:
[0124](I) “三明治”杂交结构的形成:
[0125]配制缓冲液组成为IOOmM Tris-HCl，ρΗ8.0，IOmM(NH2)2SO4, 3mMMgCl2，加入目标DNA2，控制检测DNA2和捕捉DNA2的摩尔比例为1:1，将脂质体-绿色量子点复合物标记的检测DNA2和磁珠修饰的捕捉DNA2，加入到缓冲液中，控制温度为45°C，杂交反应30min。将得到的产物置于磁力架上约2min，利用外磁场进行分离和纯化。
[0126](2)脂质体破碎:
[0127]将得到的“三明治”杂交产物用超纯水洗两次，用旋转蒸发仪将水份挥发，通入氮气吹干至水份完全挥发。加入I倍体积氯仿，产物迅速分散得到均相溶液，脂质体破碎，单颗粒量子点从中释放出来，利用磁性分离取出上层溶液，进行单分子检测。[0128]本发明通过脂质体-量子点标记的检测DNA，磁珠功能化的捕捉DNA，以及目标DNA所形成“三明治”杂交结构，利用简单外磁场进行分离和纯化。最后将单颗粒量子点从脂质体中释放出来，用单分子检测技术对单颗粒量子点计数，建立了一个目标DNA分子与多个单颗粒量子点荧光信号的对应关系，结合单分子检测技术，显著提高了检测灵敏度，实现超灵敏的DNA检测，其检测限达到1 0 _18mOl/L。
【权利要求】
1.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括脂质体-量子点复合物标记的检测DNA、磁珠修饰的捕捉DNA,所述脂质体-量子点复合物中,所述脂质体包裹多个单颗粒量子点,检测DNA通过酰胺键结合在所述脂质体表面，所述磁珠修饰的捕捉DNA中，捕捉DNA通过酰胺键结合在所述磁珠表面，所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补。
2.如权利要求1所述的DNA检测试剂盒，其特征在于，所述脂质体可被氯仿溶剂有效破碎，使被包裹的所述多个单颗粒量子点释放出来。
3.如权利要求1所述的DNA检测试剂盒，其特征在于，所述脂质体由二硬脂酰磷脂酰胆碱，羧基化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和胆固醇形成。
4.一种DNA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括: (1)脂质体-量子点复合物标记的检测DNA的制备方法，包括如下步骤: (Ia)将脂质体的原料与量子点加入到反应器中，加入氯仿，在35~45°C均匀混合后，蒸干氯仿，氮气或氩气吹干，再加入磷酸盐缓冲溶液，超声震荡4~6min后，采用微孔过滤`膜来回挤压过滤多次，得到脂质体-量子点复合物； (Ib)将表面羧基功能化的脂质体-量子点复合物，采用1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺活化10~15min，然后采用N-羟基琥珀酰亚胺活化15~30min，再加入氨基封端的检测DNA，室温反应1.5~2.5h，得到脂质体-量子点复合物标记的检测DNA ； (2)磁珠修饰的捕捉DNA的制备方法，包括如下步骤: 以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为活化剂，将氨基封端的捕捉DNA与羧基功能化的磁珠混合反应1.5~2.5h，磁性分离，离心纯化，除去未反应的捕捉DNA，得到磁珠修饰的捕捉DNA，所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补。
5.如权利要求4所述的DNA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述脂质体的原料为形成的脂质体可将多个单颗粒量子点包裹，并可被氯仿溶剂有效破碎，使被包裹的所述多个单颗粒量子点释放出来。
6.如权利要求4所述的DNA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述脂质体的原料为二硬脂酰磷脂酰胆碱，羧基化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和胆固醇。
7.如权利要求4所述的DNA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述微孔过滤膜为聚碳酸酯膜或聚醚砜膜。
8.如权利要求1所述的DNA检测试剂盒在检测DNA中的应用，其特征在于，所述应用的具体方法包括如下步骤: 按检测DNA和捕捉DNA的摩尔比例为I 将脂质体_量子点复合物标记的检测DNA与磁珠修饰的捕捉DNA混合，加入到含有目标DNA的溶液中，再向混合体系中加入缓冲液，所述缓冲液的组成为 IOOmmol，ρΗ8.0 的 Tris-HCl，IOmmol (NH2)2SO4 和 3mmol MgCl2，控制温度为40~45°C进行杂化反应30min后,置于磁力架上分离I~2min,得到纯化后的杂交产物；所述检测DNA的序列与所述捕捉DNA的序列可分别与目标DNA两端的序列互补； 将得到的所述杂交产物用超纯水洗涤，蒸干水汽，氮气或氩气吹干后，加入I~3倍体积的氯仿，所述杂交产物分散于氯仿中，得到均相溶液，脂质体破碎，单颗粒量子点释放到溶液中，磁性分离后，取上层溶液进行单分子检测。
9.如权利要求8所述的DNA检测试剂盒在检测DNA中的应用，其特征在于，所述含有目标DNA的溶液中，所述目标DNA为一种或多种。
10.如权利要求9所述的DNA检测试剂盒在检测DNA中的应用，其特征在于，所述目标DNA为多种时，采用不同颜 色的量子点对不同目标DNA进行标记。
【文档编号】C12Q1/68GK103509857SQ201310253848
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年6月24日 优先权日:2013年6月24日
【发明者】张春阳, 周娟, 王强心 申请人:深圳先进技术研究院