支原体核酸恒温扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种支原体核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物可以从极低支原体拷贝数的检测样品中扩增出对应于支原体特征性序列的扩增产物。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有支原体RNA的待测样品进行扩增，尤其适用于对含有生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP的待测样品进行扩增和检测，具有检测效率高，准确度高的特点。
【专利说明】支原体核酸恒温扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物的生物检测【技术领域】，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时 荧光核酸恒温扩增检测技术结合的支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探 针及相关试剂盒。
【背景技术】
[0002] 支原体是一类介于细菌与病毒之间的原核细胞微生物，缺少细胞壁，能独立复制。 寄生于人和其他灵长类动物的泌尿生殖道中，依靠高度特异的寄生机制包括独特的顶端细 胞器移植并侵入到人类细胞。
[0003] 近年来大量的流行病学资料提示，生殖支原体MG是人类泌尿生殖道的常见病原 体，与许多非淋球菌性尿道炎（NGU)、前列腺炎和盆腔炎等都有关系，是性传播疾病的病原 体之一。
[0004]目前，MG的主要检测方法有：培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。分离培养 和血清学方法，繁杂费时，无法满足同时处理大量样本的需要。分子生物学方法需要经历几 十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染，易受其他因素影响。因 此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。
[0005] 肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae,MP)感染不仅引起肺部病变，且能侵入心、 脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。由于感染常无特异性表现，容易与一般的病毒性 感冒相混淆。
[0006]目前，MP的实验室诊断方法有培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。然而，传 统的MP分离培养需3周甚至更长时间；MP快速培养法是利用MP在选择性液体培养基中生 长，根据其代谢产物使培养基颜色发生改变的特点来判断MP是否生长，显著缩短了MP的培 养时间，一般实验室均可开展，但在判断时需要注意假阴性。
[0007] 免疫学方法包括很多，其中冷凝集试验（cold agglutinin test, CAT)的敏感性及 特异性均不理想。富士明胶颗粒凝集法（polystyrene latex agglutination reaction, PLA)的灵敏度和特异性均提高，操作简单，价格便宜，无需特殊仪器设备，3小时能出报告， 适合临床常规检查。ELISA间接法用于检测血清中特异性的IgM和IgG抗体，但检测结果 受免疫系统状况的影响。
[0008] 分子生物学主要为检测DNA的PCR法和检测RNA的恒温扩增检测法。PCR属于 一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩 增。从理论上PCR可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增 的DNA。除了样本中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一 个缺点是由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染。
[0009] 最新发展RNA恒温扩增技术的是Gen-Probe公司的转录介导扩增法（TMA)，其采用 化学发光法进行终点检测，在检测中，需要打开反应管进行灭活，在污染控制上稍显不足。
[0010]实时突光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous AMGlification and Testing， 简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处， 前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行（42°C)，无需热循 环。采用M-MLV逆转录酶和I7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑 制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的 问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对生殖支原体（MG)及 肺炎支原体（MP)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的支原体 RNA检测方法。
[0012] 本发明的第一方面，提供了一种支原体的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在 反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包 括：
[0013]T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0014]nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。
[0015] 在另一优选例中，所述的支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。
[0016] 在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶。
[0017] 在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性捕获探针。
[0018] 在另一优选例中，所述的待测支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。
[0019] 在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性检测探针。
[0020] 在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。
[0021] 在另一优选例中，所述的检测探针的5'端标记FAM荧光基团，且检测探针的3'端 标记DABCYL淬灭基团。
[0022] 在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示。
[0023] 在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO: 13所示。
[0024] 在另一优选例中，所述的捕获探针可与生殖支原体MG的靶标核酸（MGRNA)序列 特异结合。
[0025] 在另一优选例中，所述方法还包括：在另一对照反应体系中进行扩增反应。
[0026] 在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MG内标（MG1C RNA)、所述捕获探针和所述检测探针。
[0027] 在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0028] 在另一优选例中，所述的MG检测探针用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述MG 靶标核酸（MGRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。
[0029] 在另一优选例中，所述的反应体系中生殖支原体MG或的拷贝数小于100个，较佳 地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。
[0030] 在另一优选例中，所述的捕获探针可与肺炎支原体MP的靶标核酸（MPRNA)序列 特异结合。
[0031] 在另一优选例中，所述方法还包括：在另一对照反应体系中进行扩增反应。
[0032]在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MP内标（MP1C RNA)、所述MP捕获探针和所述MP检测探针。
[0033] 在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0034] 在另一优选例中，所述的MP检测探针用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述MP 靶标核酸（MPRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。
[0035] 在另一优选例中，所述的反应体系中肺炎支原体MP或的拷贝数小于100个，较佳 地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。
[0036] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在扩增反应过程之中或之后，检测待测支 原体的特异性探针发出的荧光信号。
[0037] 在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。
[0038] 在另一优选例中，所述反应体系中还含有待测的生殖支原体或衍生自所述生殖支 原体核酸。
[0039] 在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样品或人类泌尿生殖道分泌物的核 酸。
[0040] 在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样本或人类泌尿生殖道或呼吸道 分泌物的核酸。
[0041] 本发明的第二方面，提供了一种支原体的非诊断性检测方法，所述检测方法包 括：
[0042] 用如本发明第一方面中所述的扩增方法扩增待测样品；和
[0043] 在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。
[0044] 在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。
[0045] 在另一优选例中，所述对照组包括：阳性对照组、阴性对照组、内标对照组。
[0046] 在另一优选例中，所述的待测支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。
[0047] 本发明的第三方面，提供了一种支原体的检测试剂盒，所述试剂盒包括：
[0048] (a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增生殖支原体的特异性引物对，所述引物 对包括：
[0049]T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0050]nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示；
[0051] 以及使用说明书。
[0052] 在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测含有生殖支原体（MG)和/或肺炎支原体 (MP)的待测样品。
[0053] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的一种或多种组分：
[0054](b)捕获探针；
[0055] (c)检测探针；
[0056] (d)待测序列的内标序列；和/或
[0057](e)内标检测探针。
[0058] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。
[0059] 在另一优选例中，所述的酶是M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶。
[0060]在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获 探针存在于一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和MG检测探针存在于一检测液中。
[0061] 在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获 探针存在于一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和MP检测探针存在于一检测液中。
[0062] 在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于MG检测液中。
[0063] 在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于MP检测液中。
[0064] 在另一优选例中，所述MG内标为竞争性内标，并与MG靶标核苷酸（MGRNA)使用 同一对引物07和nT7)。
[0065] 在另一优选例中，所述MP内标为竞争性内标，并与MP靶标核苷酸（MPRNA)使用 同一对引物07和nT7)。
[0066] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括阳性对照和/或阴性对照。
[0067] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括MG阳性对照和/或MG阴性对照。
[0068] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括MP阳性对照和/或MP阴性对照。
[0069] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征：
[0070] 所述捕获探针是与生殖支原体的靶标核酸（MGRNA)序列特异结合的捕获探针； 和/或
[0071] 所述检测探针是与根据所述MG靶标核酸（MGRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特 异结合的MG检测探针；和/或
[0072] 所述的待测序列的内标序列是MG的内标序列。
[0073] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征：
[0074] 所述捕获探针是与肺炎支原体的靶标核酸（MPRNA)序列特异结合的捕获探针； 和/或
[0075] 所述检测探针是与根据所述MP靶标核酸（MPRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特 异结合的MP检测探针；和/或
[0076] 所述的待测序列的内标序列是MP的内标序列。
[0077] 在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的MG检测探针还可与生殖支原体MG 的靶标核酸（MGRNA)序列特异结合。
[0078] 在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的MP检测探针还可与肺炎支原体MP 的靶标核酸（MPRNA)序列特异结合。
[0079] 在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、MG反 应液、MG检测液、SAT酶液、MG阳性对照、MG阴性对照和MG内标；
[0080] 其中，
[0081] 所述裂解液包括硫酸铵（(NH4) 2S04)和HEPES;
[0082] 所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；
[0083] 所述洗涤液包括NaCl和SDS;
[0084] 所述MG反应液包括dNTP和NTP;
[0085] 所述MG检测液包括17引物、n!7引物、MG检测探针和内标检测探针；
[0086] 所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；
[0087] 所述MG阳性对照包括含生殖支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；
[0088] 所述的MG阴性对照是不含有生殖支原体靶标核酸（MGRNA)序列或不含有生殖支 原体的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；
[0089] MG内标：含MG内标RNA(MGICRNA，序列如SEQIDN0:7所示）稀释物。
[0090] 在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、MP反 应液、MP检测液、SAT酶液、MP阳性对照、MP阴性对照和MP内标；
[0091] 其中，
[0092] 所述裂解液包括硫酸铵（(NH4) 2S04)和HEPES;
[0093] 所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；
[0094] 所述洗涤液包括NaCl和SDS;
[0095] 所述MP反应液包括dNTP和NTP;
[0096] 所述MP检测液包括17引物、n!7引物、MP检测探针和内标检测探针；
[0097] 所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；
[0098] 所述MP阳性对照包括含肺炎支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；
[0099] 所述的MP阴性对照是不含有肺炎支原体祀标核酸（MPRNA)序列或不含有肺炎支 原体的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；
[0100] MP内标：含MP内标RNA(MPICRNA，序列如SEQIDN0:14所示）稀释物。
[0101]在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，
[0102] A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；
[0103] B盒为核酸扩增检测单元，包括所述MG反应液、MG检测液、SAT酶液、MG阳性对照、 MG阴性对照及MG内标。
[0104] 在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，
[0105] A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；
[0106] B盒为核酸扩增检测单元，包括所述MP反应液、MP检测液、SAT酶液、MP阳性对照、 MP阴性对照及MP内标。
[0107] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征：
[0108] 所述检测探针包括如SEQIDN0:5所示的核苷酸序列；和/或
[0109] 所述的捕获探针包括如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；和/或
[0110] 所述的待测序列的内标序列包括如SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；和/或
[0111] 所述的内标检测探针包括如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；
[0112] 或所述的试剂盒包括选自下组的一个或多个特征：
[0113] 所述检测探针包括如SEQIDN0:13所示的核苷酸序列；和/或
[0114] 所述的捕获探针包括如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待测序列 的内标序列包括如SEQIDN0:14所示的核苷酸序列；和/或
[0115] 所述的内标检测探针包括如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。
[0116] 本发明的第四方面，提供了一种扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括：
[0117] T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0118] nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。
[0119] 在另一优选例中，所述的支原体优选为生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。
[0120] 本发明的第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的试剂盒或本发明第四方 面所述的引物对的用途，其特征在于，用于检测在环境微生物样品或人类泌尿生殖道分泌 物或人类呼吸道分泌物样品中是否存在支原体。
[0121] 在另一优选例中，所述的环境微生物样品包括：水源、贝类等水产品、水果和蔬菜 等即食性食品、色拉，或其组合。
[0122] 在另一优选例中，所述的人类泌尿生殖道分泌物样本包括尿液、男性尿道分泌物、 前列腺液、精液、尿液离心沉淀物，宫颈和阴道分泌物；所述的人类呼吸道分泌物样本包括 痰液、胸膜积液、支气管肺泡灌洗物、气管吸液。
[0123] 在另一优选例中，所述的支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。
[0124] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0125] 图1为比对组MG的引物对和探针序列的荧光检测结果；
[0126] 图2为本发明组MG的引物对序列的荧光检测结果；
[0127] 图3为比对组MP的引物对和探针序列的荧光检测结果；
[0128] 图4为本发明组MP的引物对序列的荧光检测结果；
[0129] 图5为MG临床拭子样本SAT检测的靶标荧光检测结果；
[0130] 图6为MG临床拭子样本SAT检测的内标荧光检测结果；
[0131] 图7为MG临床拭子样本SAT检测的熔解曲线图；
[0132] 图8为MP临床咽拭子样本SAT检测的靶标荧光检测结果；
[0133] 图9为MP临床咽拭子样本SAT检测的内标荧光检测结果；
[0134] 图10为MP临床咽拭子样本SAT检测的熔解曲线图。
【具体实施方式】
[0135] 本发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，开发了一种高特异性，高 灵敏度，且能够用于多种支原体核酸扩增的引物对。使用该特定的引物序列对支原体的核 酸进行扩增，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测一系列支原体。基于 上述发现，发明人完成了本发明。
[0136] 引物
[0137] 如本文所用，术语"扩增支原体的特异性引物"指这样的引物（对），它扩增出的扩 增产物具有支原体的互补链序列。优选的引物序列包括如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4组 成的引物对，所述的引物对可以用于扩增支原体的RNA序列，较佳地可以用于扩增生殖支 原体和/或肺炎支原体的靶标核酸序列，可以用于单一支原体的检测或多种支原体的总量 检测。
[0138] 本发明的引物序列设计包括使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计，得到支原体 通用的引物序列。
[0139] 在引物设计过程中，产生了诸多对支原体通用引物序列，比如17-2引物序列
【权利要求】
1. 一种支原体的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行 扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括待测支原体的特异性 捕获探针。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括待测支原体的特异性 检测探针。
4. 如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：在扩增反应 过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。
5. -种支原体的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括： 用如权利要求1中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。
6. -种支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的扩增生殖支原体的特异性引物对，所述引物对包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示； 以及使用说明书。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种组分： (b) 捕获探针； (c) 检测探针； (d) 待测序列的内标序列；和/或 (e) 内标检测探针。
8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：所述检测探针包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的待测序列的内标序列包括如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；和/或 所述的内标检测探针包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； 或所述的试剂盒包括选自下组的一个或多个特征： 所述检测探针包括如SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕获探针包括如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待测序列的内 标序列包括如SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；和/或 所述的内标检测探针包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
9. 一种扩增支原体的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。
10. 如权利要求6所述的试剂盒或权利要求9所述的引物对的用途，其特征在于，用于 检测在环境微生物样品或人类泌尿生殖道分泌物或人类呼吸道分泌物样品中是否存在支 原体。
【文档编号】C12Q1/68GK104342487SQ201310330643
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】王敏, 马道亮, 汤嘉维, 于明辉, 居金良 申请人:上海仁度生物科技有限公司