一种提高谷氨酰胺转胺酶比酶活及活化效率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高谷氨酰胺转氨酶的比酶活及活化效率的方法，在谷氨酰胺转胺酶C端插入融合蛋白中常用的连接肽，上述连接肽的基因序列设计在引物上，利用定点突变技术插入到前导肽C端，其优选GS或PT。采用本发明提供的方法在不改变谷氨酰胺转氨酶分泌效率的前提下，显著提高谷氨酰胺转氨酶的比酶活，具有重要的意义。此外，本发明还发现使用本发明提供的短肽能显著提高TGase前导肽切割效率，缩短反应时间2/3。
【专利说明】一种提高谷氨酰胺转胺酶比酶活及活化效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高谷氨酰胺转氨酶比酶活及活化效率的方法，特别是一种通过使用短肽提高谷氨酰胺转氨酶比酶活及活化效率的方法。
【背景技术】
[0002]微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，MicrobialTransglutaminase, EC2.3.2.13简称MTG)能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的Y-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε_( Y-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了 MTG的应用范围。
[0003]前导肽C端虽非TGase必需区域，但可影响TGase分泌和催化活性。目前TGase的改造限于成熟酶分子内部，忽略了前导肽对TGase催化性能的影响。实验室前期研究发现，共表达TGase前导肽和成熟酶可以实现TGase在E.coli中的活性表达,但TGase不能够分泌到胞外。共表达结果表明，前导肽和成熟酶之间的共价连接对TGase折叠没有影响，但是促进TGase分泌的必要条件。因此,为不影响pro_TGase分泌,又可改善TGase酶学性质，在不影响前导肽和成熟酶共价相连前提下，选取前导肽C端为改造区域。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的问题提供一种提高谷氨酰胺转氨酶的比酶活的方法，在谷氨酰胺转胺酶C端插入融合蛋白中常用的连接肽。
[0005]所述连接肽的基因序列设计在引物上，利用定点突变技术插入到前导肽C端。
[0006]所述连接肽优选GS或PT，插入位点选定在前导肽切割位点(L53-F54)前，即L53之前。
[0007]谷氨酰胺转胺酶活力的测定方法:
[0008]比色法测定酶活:以N- a -CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-Y单羟胺酸做标准曲线。I个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为:37°C时每分钟催化形成lymol L-谷氨酸-Y单羟胺酸的酶量(U/mL)。
[0009]试剂A:1OOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL0.2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入0.2mol/L pH6.0 的 Tris-HC 缓冲液 4mL，0.lmol/L 羟胺 2mL，0.01mol/L 的还原型谷胱甘肽2mL,并调节pH至6.0。
[0010]试剂B:3mol/L 的 HCL, 12%TCA, 5%FeCL3 按 1:1:1 混合。
[0011 ] 配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液。取ImL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液混合，37°C水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100°C加热10分钟的离心后的上清液为空白。[0012]酶活力(u/mL)= (6.8548 X 0D525-0.0164) X 稀释倍数
[0013]采用本发明提供的方法在不改变谷氨酰胺转氨酶分泌效率的前提下，显著提高谷氨酰胺转氨酶的比酶活，具有重要的意义。此外，本发明还发现使用本发明提供的短肽能显著提高TGase前导肽切割效率，缩短反应时间2/3。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1突变体及其表达
[0015]a: pro-TGase结构示意图及插入短肽位序列；b:野生酶及突变酶胞外蛋白电泳；c:野生酶及突变酶全细胞蛋白电泳；0:野生酶；1:pro-52GG ；2:pro_52GGG ；3:pro-52GGGG ；4:pro-52GS ；5:pro-52PT:M:蛋白质标准分子量
[0016]图2SDS-PAGE 分析纯化 TGase
[0017]I:WT ；2:pro-52GG ；3:pro-52GGG ；4:pro-52GGGG, 5:pro-52GS,4:pro-52PT
[0018]图3突变酶pro_52GS和pro_52PT活化过程
[0019].:WT ；▲:pro-52GS ；:pro-52GS
[0020]图4蛋白电泳检测突变酶pro_52GS和pro_52PT活化过程
[0021]a:野生酶；b:pro-52GS ；c:pro_52PT
[0022]图5前导肽突变酶 结构模拟
[0023]a:野生酶；b:pro-52GGG ；c:pro-52GS ；d:pro-52-PT
【具体实施方式】
[0024]培养基
[0025]LB 培养基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7.0 ；
[0026]TB 培养基:蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/L KH2PO4, 7 2mmo I/LK2HPO4。
[0027]实施例1:吸水链霉菌来源MTG晶体结构模拟
[0028]以已报道的S.mobaraensis pro-TGase (PDB code: 3IU0)为模板(两者氛基酸相似度为73.1%)，利用在线模拟软件SWISS-M0DEL，模拟S.hygroscopicus TGase的晶体结构。
[0029]实施例2:突变体的获得
[0030]将短肽的基因序列设计在引物上，利用定点突变技术插入到前导肽C端。以
S.hygroscopicus pro-TGase表达质粒pBBl-1011为模板(在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通过基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genbank:EU477523)，具体文献为 Liu S，Zhang D, Wang M, Cui W，Chen K, Liu Y, Du G, ChenJ, Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminaseaffects its secretion by Escherichia col1.FEMS Microbiol Lett324(2):98-105),进行全质粒PCR。引物如表 1所示，由上海生工生物工程公司合成。其中引物Pro-52-R是构建所有突变酶的下游引物，而其余引物为构建对应突变酶的上游引物，对应的突变体命名见表1。[0031]表1
【权利要求】
1.一种提高谷氨酰胺转氨酶的比酶活及活化效率的方法，其特征在于在谷氨酰胺转胺酶C端插入融合蛋白中常用的连接肽。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述连接肽的基因序列设计在引物上，利用定点突变技术插入到前导肽C端。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述连接肽优选GS或PT。
4.权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于插入位点选定在前导肽切割位点L53-F54前，即L53之前 。
【文档编号】C12N9/10GK103540574SQ201310428806
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】陈坚, 王广圣, 陈康康, 刘松, 堵国成 申请人:江南大学