一种制备重组肠道病毒ev71型病毒样颗粒的方法

一种制备重组肠道病毒ev71型病毒样颗粒的方法
【专利摘要】本发明涉及免疫【技术领域】，具体涉及一种制备重组肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法，为通过酵母表达系统，在多顺反子真核表达载体中表达EV71的PI蛋白和特异性蛋白酶。为了实现EV71病毒样颗粒的制备，本发明构建了一种EV71病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体及表达系统，所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，含有分别受MOX启动子调控的P1蛋白表达序列和受DAS启动子调控的蛋白酶表达序列。本发明通过密码子的优化以及载体的设计，构建了一种高效表达重组肠道病毒EV71型病毒颗粒的方法，本发明的方法能够获得高纯度、形态均一、性状稳定的病毒颗粒，用于手足口病疫苗的制备，极具市场价值。
【专利说明】一种制备重组肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫【技术领域】，具体涉及一种制备重组肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法、多顺反子表达载体和表达系统。
【背景技术】
[0002]手足口病是一种主要由肠道病毒引起的威胁5岁以下低龄儿童健康的病毒性传染病，主要感染途径为粪-口传播。症状包括发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，少数患儿可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎、急性迟缓性麻痹、神经源性肺水肿等并发症，个别病情进展较快的重症患儿会导致死亡。手足口病已在世界多个国家引起爆发性流行，尤其近几年的大规模爆发流行及死亡率明显升高。中国最早的手足口病报道于上世纪80年代初，而爆发性流行始于2007年。自2008年5月起，中国将其规定为法定报告管理的丙类传染病。根据卫生部(http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/wsb/)统计，2008-2011年中国手足口病发病及死亡人数急速增长，自2008年开始，中国的手足口病疫情呈现了不可控的爆发性流行，发病人数及死亡人数明显上升，2010年的发病人数近180万，而2007年的时候仅8万多，仅仅3年手足口病的发病人数就增长了 20倍，如此可怕的增长趋势不得不引起卫生部门的极大重视，如何预防和治疗手足口病是中国政府必须在短期内克服的一大公共卫生难题。
[0003]手足口病可由20多种肠道病毒感染引起，其中以肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV) A组16型的感染率和发病率最高。
[0004]肠道病毒71型根据基因序列同源性差异，可分为A、B、C三种基因型，其中B型与C型又可进一步细分为BI~ B5、C1~C4亚型。不同基因型的流行趋势呈现一定的地域差异，而同一地区不同时间流行的EV71基因型又有所不同。但是从1997年开始，EV71在中国的流行趋势较稳定，主要以C4型为主。
[0005]肠道病毒71型属于小RNA病毒科肠道病毒属。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径约为24-30nm。病毒衣壳蛋白内部包裹着一条单股正链RNA,全长约7408核苷酸，由一个开放阅读框(open reading frame, 0RF)和两端的5’，3’非编码区(untranslated region,UTR)组成。ORF编码一个较大的多聚前体蛋白，由P1、P2、P3三个前体蛋白组成，Pl编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VPl包含主要的中和抗原表位所在的区域，VPl常作为EV71的基因型鉴别依据。VP1、VP2、VP3、VP4蛋白先形成亚基，再由亚基组成病毒颗粒，其中VP4包埋在病毒颗粒的内侧，其他三种衣壳蛋白均暴露在病毒颗粒的表面。P2、P3编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、VPg (3B)、3C和3D。2A、3C是特异性蛋白水解酶，主要负责自裂解P1、P2、P3前体蛋白，VPg是病毒基因组RNA的5’末端结合蛋白，3D是RNA聚合酶。
[0006]肠道病毒家族的前体蛋白的剪切过程比较复杂，不过大多都大同小异，以脊髓灰质炎与EV71为例，01^表达的多聚前体蛋白首先裂解为？1、？2、？3，继而再进一步经2么、3〇和病毒RNA等的作用裂解为各种衣壳蛋白亚基和非结构功能蛋白。其中VPO (VP2+VP4)的裂解位点可能主要与病毒成熟和RNA包裹有关，VPl与2A之间(Pl与P2之间)的位点由2A蛋白酶识别，其他单体蛋白之间的裂解都与3C/3CD有关。
[0007]EV71呈全球分布，无明显的地域性，流行季节为夏秋季，但全年均可发生感染。人是EV71的唯一自然宿主，感染者为唯一传染源。
[0008]EV71的衣壳蛋白VPl具有最多的型特异性中和位点，因此VPl蛋白编码基因序列与病毒血清型具有较高的相关性，被用于病毒的型别鉴定和基因进化分析，除了 VPl蛋白编码基因外，也有利用VP2、VP4蛋白的编码序列进行分析，但VPl全基因序列为公认的进行基因特征和进化分析的标准区域，用于EV分子流行病学研究。B亚型主要流行于20世纪70年代的美国和澳大利亚，A、B1、B2型毒株自1987年以来未见报道，其流行似乎已经终止。中国大陆地区，自1998年以来只有C4亚型EV71流行的报道。

【发明内容】

[0009]本发明的目的在于提供一种稳定、高效表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达质粒、表达系统以及表达EV71病毒样颗粒的方法。
[0010]本发明首先公开了一种表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，含有分别受MOX启动子调控的Pl蛋白表达序列和受DAS启动子调控的蛋白酶表达序列。
[0011]较优的，所述蛋白酶表达序列为3C蛋白表达序列；或者，所述蛋白酶表达序列为3⑶蛋白表达序列。本发明中，3C蛋白表达序列和3⑶蛋白表达序列均能在启动子控制下表达特异性蛋白水解酶，用于前体蛋白Pi的剪切。
[0012]较优的，所述Pl蛋白表达序列如SEQ ID NO:4所示；所述3C蛋白表达序列如SEQIDNO: 5所示；所述3⑶蛋白表达序列如SEQ ID NO: 6所示。进一步的，所述Pl蛋白表达序列表达的Pl蛋白的氨基酸组成如SEQ ID NO:1所示；所述3C蛋白表达序列表达的3C蛋白的氨基酸组成如SEQ ID NO:2所示；所述3CD蛋白表达序列表达的3CD蛋白的氨基酸组成如 SEQ ID NO:3 所示。
[0013]较优的，所述多顺反子真核表达载体有5’至3’方向排列的DAS启动子，蛋白酶表达序列，AOXl (TT)转录终止序列，MOX启动子，Pl蛋白表达序列，以及AOXl (TT)转录终止序列。
[0014]其中，所述DAS启动子为汉逊酵母二羟基丙酮合成酶(DAS)基因启动子，该启动子的序列如SEQ ID NO:7所示；所述MOX启动子为汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)基因启动子，该启动子的序列如SEQ ID NO:8所示；所述AOXl (TT)转录终止序列如SEQ IDNO:9所示。
[0015]较优的，本发明的多顺反子真核表达载体还可以含有5’至3’方向排列的MOX启动子，Pl蛋白表达序列，AOXl (TT)转录终止序列，DAS启动子，蛋白酶表达序列，以及AOXl(TT)转录终止序列。
[0016]本发明采用两种转录效率不同的启动子，分别控制Pl蛋白和蛋白酶的表达。本发明中，两种启动子的配合不仅获得了较高的外源蛋白表达量，也利于生产时Pi蛋白和蛋白水解酶的表达调控。
[0017]更优的，所述Pl蛋白表达序列左右两侧分别含有BstBI酶和SbfI酶的限制性酶切位点序列；所述蛋白酶表达序列左右两侧分别含有NheI酶和NotI酶的限制性酶切位点序列。[0018]较优的，所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体是由pPICZB质粒改造获得。
[0019]本发明第二方面公开了前述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体的制备方法，步骤如下:
[0020]I)采用DAS启动子替换pPICZB质粒中的AOXl启动子，构建获得pDASZ质粒；
[0021]2)采用MOX启动子替换pPICZB质粒中的AOXl启动子，构建获得pMOXZ质粒；
[0022]3)将pDASZ质粒通过BglII与BamHI酶切后连接的方式插入BglII酶处理后的PMOXZ质粒，得到带有不同启动子的表达载体pMDZ ；
[0023]4)将蛋白酶表达序列以及Pl蛋白表达序列通过酶切连接的方式插入真核表达质粒pMDZ，获得Pl蛋白的表达受MOX启动子调控，且蛋白酶的表达受DAS启动子调控的表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核质粒。
[0024]为实现上述制备方法，本发明实施例中给出了一种具体可行的EV71多顺反子真核表达载体的构建方法，所述制备方法如下:
[0025]1、pDASZ质粒的构建:构建左右两端分别为BglII限制性酶切位点和HindIII限制性酶切位点，中间含有DAS启动子的DAS启动子插入片段；构建左右两端分别为HindIII限制性酶切位点和BamHI限制性酶切位点，中间含有AOXl(TT)转录终止序列的第一终止子插入片段；然后将BglII与HindIII联合酶切处理的DAS启动子插入片段，HindIII与BamHI联合酶切处理第一终止子插入片段，以及BglII与BamHI联合酶切处理的质粒pPICZB三者连接，获得质粒PDASZ ；
[0026]2、pM0XZ质粒的构建:构建左右两端分别为BglII限制性酶切位点和NdeI限制性酶切位点，中间含有MOX启动子的MOX启动子插入片段；构建左右两端分别为NdeI限制性酶切位点和BamHI限制性酶切位点，中间含有AOXl (TT)转录终止序列的第二终止子插入片段；然后将BglII与NdeI联合酶切处理的MOX启动子插入片段，NdeI与BamHI联合酶切处理第二终止子插入片段，以及BglII与BamHI联合酶切处理的质粒pPICZB三者连接，获得质粒pMOXZ ；
[0027]3、pMDZ质粒的构建:将步骤I中构建的pDASZ质粒通过BglII与BamHI酶切后连接的方式插入BglII酶处理后的pMOXZ质粒，得到带有不同启动子的真核质粒pMDZ ；
[0028]4、表达柯萨奇病毒EV71病毒样颗粒真核表达载体的构建:首先将BstBI酶和SbfI酶联合处理的Pl蛋白表达序列连接入pMDZ质粒，然后与NheI酶和NotI酶联合处理的蛋白酶表达序列连接，获得目的质粒。
[0029]本发明第三方面公开了一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达系统，包括酵母细胞以及位于酵母细胞内的前述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体。
[0030]较优的，所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces Iactis),以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的任一种。
[0031]本发明第四方面公开了一种制备肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法，为构建Pl蛋白受MOX启动子调控表达，并且蛋白酶受DAS启动子调控表达的真核表达载体，通过酵母表达系统进行表达。
[0032]较优的，所述肠道病毒EV71的Pl蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。
[0033]编码SEQ ID NO:1所示Pl蛋白的开放阅读框含有SEQ ID NO:4所示基因片段；编码SEQ ID NO:2所示蛋白酶的开放阅读框含有SEQ ID NO:5所示基因片段；编码SEQ IDNO:3所示蛋白酶的开放阅读框含有SEQ ID NO:6所示基因片段。
[0034]优选的，所述含有受DAS启动子调控的蛋白酶表达序列以及受MOX启动子调控的Pl蛋白表达序列的多顺反子真核表达载体为前述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体。
[0035]优选的，所述真核表达载体中表达PI蛋白的启动子为汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)基因启动子；表达蛋白酶的启动子为汉逊酵母二羟基丙酮脱氢酶(DAS)基因启动子。所述PI蛋白和蛋白酶的终止子为AOXl (TT)终止序列。
[0036]本发明最后公开了前述肠道病毒EV71型病毒样颗粒的真核表达载体、表达系统，以及制备肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法在制备手足口病疫苗中的应用。
[0037]根据汉逊酵母密码子偏爱性合成编码EV71-P1、EV71-3C、EV71-3CD蛋白的DNA序列，合成所得的基因连接到汉逊酵母表达载体上，得到同时表达Pl前体蛋白和3C蛋白酶的双表达质粒及同时表达Pl前体蛋白和3⑶蛋白酶的双表达质粒。重组质粒通过基因工程方法整合到汉逊酵母基因组中，经大规模筛选得到高表达菌株。以此重组表达菌株为种子，发酵表达得到Pl和3C蛋白或Pl和3CD蛋白酶。3C/3CD酶在酵母细胞内部将Pl前体蛋白裂解为VP1、VP3和VP0，`三种衣壳蛋白亚基自组装成为病毒样颗粒(VLPs)。二种表达(3C/3⑶)均可通过柱层析等纯化方法获得高纯度、形态均一、性状稳定的VLPs，纯化后的VLPs吸附适当的佐剂(如铝佐剂)成为重组疫苗制剂。由动物实验验证重组疫苗制剂的免疫原型。
[0038]本发明的有益效果:本发明开发了一种结构上类似于天然肠道病毒71型的病毒样颗粒作为疫苗抗原，该抗原由多个单体构成，分子量巨大，在电镜下观察到颗粒状重复性结构，颗粒状的抗原一般都具有较强的免疫原性。本发明制备的疫苗抗原不含有病毒的遗传物质，不会有潜在的感染可能性，是更合适的疫苗候选抗原。本发明通过使用不同的启动子，调节病毒衣壳蛋白Pl与蛋白酶3C/3CD的表达量，调控病毒样颗粒前体蛋白Pl的剪切，从而获得形态均一的病毒样颗粒。本发明使用Pl蛋白前体与3C蛋白酶或Pl蛋白前体与3CD蛋白酶组合，均可制备出形态均一、具有高免疫原性的抗原病毒样颗粒。该病毒样颗粒作为疫苗抗原，应用于EV71、CV16 二价手足口病疫苗，也展现出良好的免疫原性，是合适的疫苗候选抗原。
【专利附图】

【附图说明】
[0039]图l:pMDZ质粒图谱
[0040]图2:EV71-Pl-pMDZ 质粒图谱
[0041]图3:EV71-P13C-pMDZ 质粒图谱
[0042]图4:EV71-P13CD_pMDZ 质粒图谱[0043]图5:EV71-P13C-pMDZ 酶切鉴定图
[0044]泳道1:EV71-P13C_pMDZ 质粒
[0045]泳道2:EV71-P13C-pMDZ 质粒(BstBI+SbfI 双酶切)
[0046]泳道3:EV71-P13C-pMDZ 质粒(Nhel+Notl 双酶切)
[0047]泳道4:250bp DNA ladder (TAKARA)
[0048]图6:EV71-P13CD_pMDZ 酶切鉴定图
[0049]泳道1:EV71-P13CD_pMDZ 质粒
[0050]泳道2:EV71-P13CD-pMDZ 质粒(BstBI+SbfI 双酶切)
[0051]泳道3:EV71-P13CD-pMDZ 质粒(Nhel+Notl 双酶切)
[0052]泳道4:250bp DNA ladder (TAKARA)
[0053]图7:重组EV71病毒样颗粒Western-Blot检测结果
[0054]泳道1:HS-EV71-P13C-pMDZ菌株纯化的EV71病毒样颗粒(P1/3C来源)
[0055]泳道2:蛋白质预染Marker [0056]泳道3:HS-EV71-P13CD-pMDZ菌株纯化的EV71病毒样颗粒(P1/3CD来源)
[0057]图8:重组EV71病毒样颗粒动态光散射检测结果
[0058]A:HS-EV71-P13C-pMDZ菌株纯化的EV71病毒样颗粒(P1/3C来源)
[0059]B:HS-EV71-P13CD-pMDZ 菌株纯化的 EV71 病毒样颗粒(P1/3CD 来源)
[0060]图9:重组EV71病毒样颗粒电镜观察(25000倍)
[0061]A:HS-EV71-P13C-pMDZ菌株纯化的EV71病毒样颗粒(P1/3C来源)
[0062]B:HS-EV71-P13CD-pMDZ 菌株纯化的 EV71 病毒样颗粒(P1/3CD 来源)
【具体实施方式】
[0063]以下为本发明的具体实施例，用于进一步理解本发明的技术方法，但不以任何形式限制本发明的保护范围。
[0064]实施例1病毒颗粒的制备
[0065]1.表达基因的选择与密码子的优化设计
[0066]编码EV71-P1蛋白与EV71-3C或3CD蛋白的DNA序列参照中国株Fuyang.Anhu1.P.R.C/17.08/1 (GenBank:EU703812.1)，Fuyang.Anhu1.P.R.C/17.08/1 株 EV71-P1 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，EV71-3C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2K*，EV71_3CD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0067]对Fuyang.Anhu1.P.R.C/17.08/1 株中编码 SEQ ID NO:1 所示 EV71-P1 蛋白、SEQIDN0:2所示EV71-3C蛋白和SEQ ID NO:3所示EV71-3CD蛋白的野生型DNA序列进行改造，密码子尽可能采用汉逊酵母中使用频率较高的密码子，同时避免了可能影响表达的转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构。密码子优化后得到编码EV71-P1蛋白的重组基因序列如SEQ ID N0:4所示，编码EV71-3C蛋白的重组基因序列如SEQ ID N0:5所示，编码EV71-3CD蛋白的重组基因序列如SEQ ID N0:6所示。
[0068]2.重组表达载体的构建
[0069]2.1pMDZ质粒的构建:pMDZ质粒改造自pPICZB质粒，具体方法如下:
[0070]I)通过PCR方式，采用SEQ ID NO:10_11所示序列的引物从汉逊酵母基因组DNA中扩增得到MOX启动子插入片段；采用SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16所示序列的引物从pPICZB质粒中扩增得到含AOXTT终止序列的片段。Bglll+Ndel联合酶切处理MOX启动子插入片段，Ndel+BamHI处理AOXTT终止序列片段，Bglll+BamHI处理pPICZB，再用小牛肠碱性磷酸酶处理pPICZB-Bglll+BamHI片段，三片段连接后得到质粒
[0071]ρΜΟΧΖ ο
[0072]2)采用SEQ ID NO: 12-13所示序列的引物从汉逊酵母基因组DNA中扩增得到DAS启动子插入片段；采用SEQ ID NO:15-16所示序列的引物从pPICZB质粒中扩增得到含AOXTT终止序列的片段。Bglll+Hindlll联合酶切处理DAS启动子插入片段，Hindlll+BamHI处理AOXTT终止序列片段，Bglll+BamHI处理pPICZB，再用小牛肠碱性磷酸酶处理pPICZB-Bglll+BamHI片段，三片段连接后得到质粒pDASZ。
[0073]3)将pDASZ质粒表达盒通过BglII和BamHI酶切后连接的方式(参见InvitrogenpPICZB操作手册提到的体外多拷贝质粒构建方案)插入BglII处理的pMOXZ质粒，得到带有不同启动子控制的汉逊酵母双表达质粒pMDZ。MOX启动子扩增引物
[0074]h游引物:5’ -ACCAAAAGATCTGTCGACGCGGAG-3’ (SEQIDN0:10)
[0075]下游引物:5，-CTTGGCTACATATGATCGATCGTGTACACGTTTCGAATTTGTTTTTGTACTTT-3，(SEQ ID NO:11)
[0076]DAS启动子扩增引物
[0077]h游引物:5’ -ACCAGGAGATCTAGCTTGAATCGTGAAAC-3’ (SEQ ID NO: 12)
[0078]下游引物:5’-TCAAGTCAAGCTTCACGTGGCTAGCGGGAAGAAAAGACAGAG-3’ (SEQ IDNO:13)`
[0079]AOXTT扩增引物
[0080]引物1:5’ -GCCCGATCATATGCCTGCAGGCAGCTTTCTAGAACAA-3’ (SEQ ID NO:14)
[0081]引物2:5’ -AAACGTGAAGCTTGAATTCGCGGCCGCCAGCTTTCT-3’ (SEQ ID NO:15)
[0082]引物3:5’ -TGGGGGATCCGCACAAACGAA-3，(SEQ ID NO:16)
[0083]构建的pMDZ质粒如图1所示，该质粒带有两个开放阅读框，一个开放阅读框由汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)启动子控制，另一个表达盒由汉逊酵母二羟基丙酮合成酶(DAS)启动子控制，两者都是汉逊酵母甲醇代谢途径中所必须的酶，在葡萄糖、甘油等碳源条件下强烈抑制。
[0084]2.2EV71-P13C-pMDZ 和 EV71_P13CD_pMDZ 重组表达载体的构建:
[0085]设计5’端和3’端分别含有BstBI酶切位点和SbfI酶切位点的Pl蛋白表达序列并进行全基因合成，获得SEQ ID N0:4所示序列的核苷酸片段；设计5’端和3’端别含有NheI酶切位点和NotI酶切位点的3C蛋白表达序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:5所示序列的核苷酸片段；计5’端和3’端别含有NheI酶切位点和NotI酶切位点的3CD蛋白表达序列并进行全基因合成，获得SEQ ID N0:6所示序列的核苷酸片段。
[0086]采用BstBI酶和SbfI酶的混合酶酶切处理Pl蛋白表达序列与pMDZ质粒，酶切后的片段由T4DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C过夜倒置培养。挑取部分克隆抽提质粒，以BstBI和SbfI酶切鉴定，构建成功的重组质粒命名为EV71-Pl-pMDZ (图2)。采用NheI酶和NotI酶的混合酶酶切3C蛋白表达序列或3CD蛋白表达序列，同样的酶酶切前一步骤构建的EV71-Pl-pMDZ重组质粒，酶切后的片段由T4DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5菌株，37°C过夜倒置培养。挑取部分克隆抽提质粒，以NheI和NotI酶切鉴定，酶切鉴定结果见图5和图6，构建成功的重组质粒分别命名为 EV71-P13C-pMDZ (图 3)和 EV71_P13CD_pMDZ (图 4)。
[0087]3.EV71-P13C-pMDZ/EV71-P13CD-pMDZ 重组表达菌株构建
[0088]汉逊酵母菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号2.2497。将构建的重组质粒EV71-P13C-pMDZ或重组质粒EV71_P13CD-pMDZ由ScaI酶线性化，分别电转汉逊酵母，电转条件为1500V，120Q，50F。电转后菌液涂布YPD平板(200ug/mlZeocin)，37°C过夜倒置培养。挑取部分克隆划线YPD平板(1500ug/ml Zeocin), 37置培养2天，挑取生长情况较好的菌株作为发酵菌种，分别命名为HS-EV71-P13C-pMDZ和HS-EV71-P13CD-pMDZ。
[0089]4.重组蛋白的发酵罐培养
[0090]取出发酵菌种(HS-EV71-P13C-pMDZ或 HS-EV71_P13CD-pMDZ)，在超净台内接入5ml活化培养基(YPD)，在恒温振荡培养器内以200rpm，30~37 °C培养过夜。20小时左右测得活化液的0D_在I~2的范围，停止培养。镜检无杂菌后将Iml活化液转接入500ml种子培养基(YPD)，在恒温振荡培养器内以200rpm，30~37°C培养过夜。镜检无杂菌后按按1:15接种。使用BIOENGINEERING RALF Basic发酵罐，发酵用基础盐培养基BSM。发酵初始温度设定为30~37°C，初始pH5~6，转速300rpm，通气量0.5vvm, D0100%,添加PTMl痕量盐类。初始增殖阶段大约20~24小时，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压和补加纯氧维持溶氧值20~40%。当菌体湿重达到60~90g/L。补加50%甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值20~40%，补加4~8小时。检测菌体湿重增加到100~200g/L时，停止补料。将温度设定在30~37°C，pH值控制调为6~7，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50~100mL/min。维持溶氧值高于20~40%，温度设定在30~37°C，pH值控制为6~7。诱导40小时发酵结束。用冷冻离心机8000rpm，10分钟离心发酵液。离心结束后弃上清收集菌泥。收获的菌泥放在_20°C冰箱内冻存。
[0091]5.病毒样颗粒纯化
[0092]取200g发酵菌体，加入4 °C预冷的破菌用缓冲溶液(50mM PB, 0.2M NaCl，0.5%Tween-80, pH7.0) 800ml,于磁力搅拌器上搅拌至完全混匀。采用高压均质机(ATSAH-100B)高压破碎以上菌体混悬液，调节均质阀，控制破菌压力为1200bar。重复以上高压破碎过程3-4遍。高速冷冻离心机(ThermoFisher lynx4000)离心澄清破菌液,设定条件10000rpm，30min，8°C，离心分离，收集离心后的上清液。上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为30~40%，4°C放置过夜。按10000rpm、30min、8°C条件离心分离，弃去上清保留沉淀物，加入缓冲溶液(50mM PB ρΗ7.0) 1000ml，搅拌 2 ~4hr。按 10000rpm、30min、8°C条件离心分离，保留上清用于层析分离。将上清液上样至阴离子层析柱Capto Q (GE公司)吸附，利用0.2-1M NaCl梯度洗脱，根据紫外吸收峰分部收集样品。SDS-PAGE电泳分析各部分组份，合并含有目的蛋白部分，100KD超滤(Millipore公司)浓缩20倍，并用0.45um膜过滤。过滤后的上清液上样至分子筛层析柱S印har0Se4FF (GE公司)，收集纯化后的目的蛋白峰。经过上述步骤纯化后，按照最终纯化蛋白的产量和纯化步骤的得率计算，本发明方法中EV71病毒样颗粒在汉逊酵母中的表达量约为200mg/升发酵液。HS-EV71_P13C-pMDZ与HS-EV71-P13CD-pMDZ两个菌株(分别对应P1/3C来源与P1/3CD来源)在表达量上无显著区别。
[0093]6.病毒样颗粒性质鉴定
[0094]纯化的病毒样颗粒蛋白样品经过Western-blot检测,可与EV71的多抗(abeam公司，货号ab26858)呈特异性的显色反应(图7)。动态光散射(Malvern Instruments Nano
S)检测纯化样品颗粒直径范围在20~30nm左右(图8);纯化的病毒样颗粒蛋白样品经磷酸钨染色后，电镜(Philips)观察呈现病毒样颗粒(图9)。
[0095]实施例2病毒颗粒的抗原性能检测
[0096]1.病毒样颗粒疫苗制备
[0097]I)单价EV71疫苗:将纯化获得的EV71病毒样颗粒蛋白(P1/3C来源与P1/3CD来源)分别吸附铝佐剂，制备获得具有免疫原性的EV71疫苗。
[0098]2) 二价疫苗:将CV16病毒样颗粒蛋白(该蛋白的制备可参考申请号为201210008528.4的发明专利:重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法及其应用)吸附铝佐剂，与上述EV71疫苗按1:1混合，制备获得具有免疫原性的EV71、CV16 二价疫苗。
[0099]2.EV71单价疫苗，以及EV71、CV16 二价疫苗免疫原性的测定
[0100]选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠，分为7组，每组6只小鼠。其中I组小鼠用含有铝佐剂的缓冲液(50mM PB pH7.0)进行免疫(作为阴性对照组)，EV71单价疫苗3组每次免疫剂量为I μ g/只、0.1 μ g/只、0.01 μ g/只，二价疫苗3组每次免疫剂量为I μ gEV71+1 μ g CV16/ 只、0.1 μ g EV71+0.1 μ g CV16/ 只、0.01 μ g EV71+0.01 μ g CV16/ 只，分别于第O、14天皮下注射免疫，共免疫两次，第二次免疫后两周采血。将采集得到的血液于4°C放置过夜后，5000g离心lOmin，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20°C存放，并检测鼠血清的阳转率。具体方法如下:
[0101]用包被液稀释纯化的EV71蛋白或CV16蛋白至I μ g/ml,向酶标板每个孔中各加
0.lml，4°C包被过夜。除去包被液，洗板。每孔加入0.3ml封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37°C保温2小时。除去包被液，每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:1000稀释的被检血清各0.1ml，于37°C保温I小时，除去血清液，洗板。然后向每孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各0.1ml，37°C保温0.5小时后除去酶标液，洗板；然后向每孔中加入0.1ml DAB显色液，室温避光作用10分钟后加2M H2SO40.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD45tl值，OD450值如表1所示。三个检测组的阳转率结果如表2所示。Cutoff值为阴性对照被检血清抗体的OD45tl值的平均值加上3倍标准差，OD450值大于Cutoff值的小鼠判定为阳性，OD450值小于Cutoff值的小鼠判定为阴性。
[0102]表1疫苗的抗原性检测结果
【权利要求】
1.一种表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体,含有分别受MOX启动子调控的Pl蛋白表达序列和受DAS启动子调控的蛋白酶表达序列。
2.如权利要求1所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述蛋白酶表达序列为3C蛋白表达序列；或者，所述蛋白酶表达序列为3⑶蛋白表达序列。
3.如权利要求2所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述Pl蛋白表达序列如SEQID NO:4所不；所述3C蛋白表达序列如SEQ ID NO:5所不；所述30)蛋白表达序列如SEQ ID NO:6 所示。
4.如权利要求1所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述多顺反子真核表达载体有5’至3’方向排列的DAS启动子，蛋白酶表达序列，AOXl (TT)转录终止序列，MOX启动子，Pl蛋白表达序列，以及AOXl (TT)转录终止序列。
5.如权利要求4所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述DAS启动子为汉逊酵母二羟基丙酮合成酶基因启动子，该启动子的序列如SEQ ID NO:7所示；所述MOX启动子为汉逊酵母甲醇氧化酶基因启动子，该启动子的序列如SEQ ID NO:8所示；所述AOXl (TT)转录终止序列如 SEQ ID NO:9所示。
6.如权利要求1所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体是由PPICZB质粒改造获得。
7.权利要求1-6任一权利要求所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体的制备方法，步骤如下: 1)采用DAS启动子替换pPICZB质粒中的AOXl启动子，构建获得pDASZ质粒； 2)采用MOX启动子替换pPICZB质粒中的AOXl启动子，构建获得pMOXZ质粒； 3)将pDASZ质粒通过BglII与BamHI酶切后连接的方式插入BglII酶处理后的pMOXZ质粒，得到带有不同启动子的表达载体PMDZ ； 4)将蛋白酶表达序列以及Pl蛋白表达序列通过酶切连接的方式插入真核表达质粒pMDZ，获得Pl蛋白的表达受MOX启动子调控，且蛋白酶的表达受DAS启动子调控的表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核质粒。
8.一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达系统，包括酵母细胞以及位于酵母细胞内的权利要求1-6任一权利要求所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体。
9.如权利要求8所述的肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达系统，其特征在于，所述酵母选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母，以及栗酒裂殖酵母中的任一种。
10.权利要求1-6任一权利要求所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体、权利要求8-9任一权利要求所述表达系统，以及权利要求7所述制备方法在制备手足口病疫苗中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103525855SQ201310476097
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】张高峡 申请人:上海博唯生物科技有限公司