内含a型流感病毒m基因装甲rna标准物质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种A型流感病毒核酸检测装甲RNA标准物质。该标准物质是利用MS2噬菌体装甲RNA技术，将A型流感病毒M基因用MS2噬菌体的衣壳蛋白包装而成，本发明制备的标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，适用于A型流感病毒以M基因为靶标的核酸检测方法的质量控制，以及检测试剂和实验室能力的评价。
【专利说明】内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质
【技术领域】
[0001]本发明属于疫病检测【技术领域】，涉及一种内含A型流感病毒M基因的装甲RNA标准物质，可用于针对A型流感病毒M基因建立的核酸检测方法和试剂的质量控制和评价。【背景技术】
[0002]A型流感病毒感染范围很广，能引起人和动物流感的流行和大流行，历史上多次流感的暴发均由A型流感病毒引起，如2004年东南亚发生的高致病性禽流感和2009年席卷全球的甲型HlNl流感等。几乎所有的动物流感均由A型流感引起，主要有禽流感，猪流感，马流感等。由于流感的发生对动物和人类健康构成了巨大威胁，因此全球对它高度关注，虽然各国对动物流感防制策略不尽相同，但都把动物流感的快速诊断和及时监测作为首要步骤。核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为A型流感病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。
[0003]A型流感病毒(Inf luenza Virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),为单股负链RNA病毒，其基因组由8个RNA节段组成，其中第7片段M基因最为保守，是流感病毒通用核酸检测的主要靶基因。目前，国内外针对A型流感病毒M基因建立了多种核酸检测方法，其中应用最多是RT-PCR和荧光RT-PCR方法，市场上也有多种不同厂家生产的核酸检测试剂盒，这些试剂盒在检测特异性、灵敏度等方面均有不同，直接影响检测结果的一致性和准确性。此外，目前A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂使用的质控样品多选择灭活的全病毒、质粒DNA和体外转录cRNA制备,灭活的全病毒存在生物安全隐患，裸露核酸又极易被广泛存在的核酸酶降解，且不能实现核酸提取过程的有效监控，难以保证检测结果的准确性。因此，研制一种既稳定又没有传染性可用于A型流感病毒通用核酸检测的质控样品和标准物质对于其检测方法和试剂的标准化、规范化使用及临床检测具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用MS2噬菌体装甲RNA技术，制备了一种内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，该标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，可用于多种A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂盒的质量控制。
[0005]本发明提供的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质是通过如下方案制备:
[0006]I)获得用于A型流感病毒核酸检测的M基因序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示；
[0007]所述M基因可以通过合成或者RT-PCR扩增获得，该片段覆盖了目前多数A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域。
[0008]2)将包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的序列及通过步骤I)获得的M基因序列克隆于原核表达载体；
[0009]具体的:将MS2噬菌体基因组中5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列克隆于原核表达载体pET32a中，在其下游插入M基因的cDNA序列，获得表达载体pET32a-ACP-1VM。
[0010]3)将原核表达载体转入表达菌株中，诱导表达，然后采用超声波裂解，离心，收集上清液，获得表达产物；
[0011]具体的:将pET32a-ACP-1VM质粒转化表达菌株BL21 (DE3)，阳性菌落接种到含氨苄霉素(100mg/L)LB液体培养基中，37°C、200r/min培养至0D600为0.6时加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度lmmol/L，诱导5h，收集菌体采用超声波裂解处理(200W,间隔10s，共超声作用30次)，12000r/min离心20min,收集上清液，用0.45 μ m微孔滤膜过滤，得到表达产物。 [0012]4)经Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化,去除残留质粒DNA,得到内含A型流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒(VLPs)。
[0013]5)将内含流感病毒M基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT-PCR方法定值，稀释分装，即得内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质。
[0014]发明人发现装甲RNA VLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。因此，要去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。现有技术中通常使用蔗糖密度梯度离心对表达产物进行纯化，但该方法无法去除DNA，因此，本发明采用了 Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化结合的方式，解决了上述技术问题。
[0015]具体的:将获得的表达产物用Cellufine sulfate树脂柱纯化，以去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。取10倍柱体积的平衡缓冲液(含有0.1M氯化钠的浓度为IOmM的磷酸钠缓冲液，pH7.5)平衡Cellufine sulfate树脂柱,流速3mL/min ;将表达上清液上柱结合，上样流速3mL/min，之后利用平衡缓冲液冲洗约10个柱体积；用洗涤缓冲液I (含0.3M氯化钠的浓度为IOmM磷酸钠缓冲液，pH7.5)洗脱30个柱体积以上。用洗脱缓冲液II (含2M氯化钠的浓度为IOmM磷酸钠缓冲液，pH7.5)洗脱，分管收集作为VLPs溶液。
[0016]VLPs溶液中加入固体聚乙二醇(PEG6000)至终浓度为10% (W / V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴4h以上使VLPs形成沉淀,4°C 11000r/min离心lOmin,用适量RNase freedH20悬浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中残留的质粒DNA，加入等体积的氯仿CH3Cl抽提后4°C 11000r/min离心lOmin，回收含VLPs的水相，即为内含流感病毒M基因的装甲RNA(AR-1VM)悬浮液。
[0017]本发明所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质中没有质粒DNA的残留。
[0018]进一步地，将内含流感病毒M基因的装甲RNA溶液通过荧光定量RT-PCR方法定值后，稀释分装后作为标准物质使用，内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质的浓度为IO6Copies/ μ L0
[0019]本发明还要保护内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质在A型流感病毒核酸检测中作为标准物质的应用。
[0020]本发明制备的装甲RNA标准物质的显著优点是:
[0021]I)该装甲RNA内部包含的M基因片段，覆盖了目前多数A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域，如国家标准GB/T27539-2011《Α型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》，2009年WHO⑶C和我国卫生部推荐的《Α型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》等。因此该标准物质可用于现有A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂的质量控制
[0022]2)该装甲RNA标准物质纯度高，无质粒DNA残留，具有良好的质控性能。装甲RNAVLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。研究中，我们试图通过超速离心、病毒沉淀以及DNase消化的方法纯化VLPs，结果发现残留质粒DNA均无法彻底去除。为此，我们进行了多种方法的尝试，包括硅粉吸附、超速离心以及Cellufine Sulfate亲和层析法等试验，结果证实，采用Cellufine Sulfate亲和树脂柱纯化,聚乙二醇沉淀,加入DNase消化后可彻底去除残留质粒DNA。[0023]3)该装甲RNA标准物质内部的M基因由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹，可耐受RNase降解，相比于体外转录的裸露RNA更加稳定，易于保存。
[0024]4)该装甲RNA模拟了天然病毒的结构，可与临床样本一样参与核酸提取和扩增等环节，实现对检测过程的全程质控，确保检测结果的真实可靠；
[0025]5)该装甲RNA无生物传染性，易于制备和运输，相比于增殖的病毒粒子，更适合临床推广使用；
[0026]6)该装甲RNA标准物质对其内部所含的目的核酸通过荧光定量RT-PCR方法进行了定值，可用于检测样品的定量分析及检测方法和试剂检测极限的评价。
[0027]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为A型流感病毒M基因RT-PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；
[0029]M:DNA Mark DL2000 ； Lane I 和 2:阳性扩增产物；Lane3:阴性对照。
[0030]图2内含A型流感病毒M基因装甲RNA PCR和RT-PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图；
[0031]Lanel和5:阴性对照，Lane2、3和4:分别为I μ L、2 μ L、4 μ L装甲RNA样品的RT-PCR 结果，M:DL5000DNA Marker，Lane6、7 和 8:分别为 I μ L、2y L、4y L 装甲 RNA 样品未反转录的PCR结果。
[0032]图3内含A型流感病毒M基因装甲RNA实时荧光RT-PCR鉴定结果。
[0033]图4荧光RT-PCR对A型流感病毒装甲RNA标准物质均匀性检测结果。
[0034]图5国家标准GB/T27539-2011《A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》检测10倍系列稀释装甲RNA标准物质的结果。
【具体实施方式】
[0035]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的
[0036]试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
[0037]实施例1、内含A型流感病毒M基因装甲RNA的获得及鉴定
[0038]1、材料
[0039]流感病毒A/Swine/2003 (HlNl)由本实验室保存。根据GenBank公布的MS2噬菌体基因组序列(登录号分别为EF112445)，人工合成MS2噬菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点序列约178Ibp,序列中还引入了 BamH I /Kpn I酶切位点，如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0040]2、方法
[0041]I)引物设计
[0042]根据GenBank公布的SIV基因组序列(登录号为⑶047344)，利用oligo6软件设计引物。引物对SIVCF/SIVCR用于扩增SIV最为保守的M基因，片段大小758bp，扩增引物中引入了 BamH I /Not I酶切位点，扩增片段覆盖了目前多数SIV通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域。引物对SIVPF/SIVPR用于鉴定检测SIV M基因，该引物对位于M基因内部，扩增片段大小约496bp。同时参照国家标准GB/T27539-2011《动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》合成SIV M基因实时荧光RT-PCR检测用引物和探针。所有引物及探针序列和PCR扩增片段大小见表1。
[0043]表1基因克隆和鉴定用引物和探针
[0044]
【权利要求】
1.一种内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于:它是通过如下方法制备: 1)获得用于A型流感病毒核酸检测的M基因序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示； 2)将包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的序列及通过步骤I)获得M基因序列克隆于原核表达载体； 3)将原核表达载体转入表达菌株中，诱导表达，然后采用超声波裂解，离心，收集上清液，获得表达产物 ； 4)经^Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化,去除残留质粒DNA,得到内含A型流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒。 5)将内含流感病毒M基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT-PCR方法定值，稀释分装，即得。
2.根据权利要求1所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于:步骤4)中，具体过程为:取平衡缓冲液平衡Cellufine sulfate树脂柱，将表达产物上柱结合，用洗涤缓冲液I洗脱，再用洗脱缓冲液II洗脱，收集含装甲RNA病毒颗粒的溶液；然后用固体聚乙二醇进行沉淀，再利用DNase I消化残留的质粒DNA，得到内含流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒，其中，平衡缓冲液为含有0.1M氯化钠的浓度为IOmM的磷酸钠缓冲液，PH7.5，洗涤缓冲液I为含0.3M氯化钠的浓度为IOmM磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗脱缓冲液II为含2M氯化钠的浓度为IOmM磷酸钠缓冲液，pH7.5。
3.根据权利要求1或2所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于:内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质中没有质粒DNA的残留。
4.根据权利要求3所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于，内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质的浓度为IO6Copies/ μ L。
5.权利要求1-4中任一所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质在A型流感病毒核酸检测中作为标准物质的应用。
【文档编号】C12R1/92GK103571865SQ201310541105
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】乔彩霞, 倪建强, 蒲静, 高志强, 张鹤晓, 尹羿, 汪琳, 谷强, 张利峰, 张伟 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局