木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
【专利摘要】本发明涉及具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的酶，其例如催化内部β-1,4-木糖苷键或内β-1,4-葡聚糖键的水解；和/或将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖。因此，本发明提供分解作为植物细胞壁主要成分的半纤维素的方法和过程，包括水解任何植物或木材或木制品、废木料、纸浆、纸制品或废纸或纸副产品中的半纤维素的方法和过程。另外，还提供设计新木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法和其应用方法。所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在增加的pH和温度下具有增加的活性和稳定性。
【专利说明】木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年08月01日，申请号为200880118805.9 (PCT/US2008/072030)，发明名称为“木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制
备和应用方法”。
_2] 关于在联邦资助的研究下做出的发明权的声明
[0003] 本发明一部分是依据能源部提供的第D0E1435-04-03-CA-70224号合同，在政府的支持下进行的。政府可以在本发明中享有一定的权利。
_4] 相关申请的交叉引用
[0005]本申请要求2007年10月3日提交的美国临时申请序列号60/977，348的权益。该文件的内容通过引用而并入本文。
[0006]参考通讨EFS-WEB提夺的序列表
[0007]本申请通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交，如在MPEP § 1730I1.B.2.(a) (A)所批准并阐明的，并且该电子提交包括电子提交的序列(SEQ ID)表；该序列表的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。序列表根据如下电子提交的.txt文件确定:
【权利要求】
1.分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)，其包含 (a)编码至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含与下列核酸序列具有至少约 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多或完全(100%)序列同一性的序列: (i )SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列，其具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物)，或具有下列核苷酸残基改变中的至少I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC ;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC ;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC ;编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为GAC ;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC ;编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC ;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG ;编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC ;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG ;编码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC ;编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG ;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC ;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC ;编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG ;或
(ii) SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21 或 SEQID NO:23的核酸(多核苷酸)序列； 其中(i)或(ii)的所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽，或编码能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽)的 多肽 或肽， (b)(a)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列同一性如下测定:(A)通过用序列比对算法分析或通过视觉观察，或(B)在至少约 20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150 或更多个残基的区域上,或在cDNA、转录物(mRNA)或基因的全长上； (c)(a)或(b)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列比对算法是2.2.2版BLAST算法，其中过滤设置被设置为blastall-p blastp_d〃nr pataa〃_F F并且所有其它选项被设置为默认值； (d)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含在严格条件下与这样的核酸杂交的序列:所述核酸包含SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列以及具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物)，或具有下列核苷酸残基改变中的至少I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC ;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC ;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC ;编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为GAC ;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC ;编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC ;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG ;编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC ;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG ;编码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC ；编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG ;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC ;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC ;编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG ;和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG， 其中所述多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性或能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽)， 以及所述严格条件包括这样的洗涤步骤，其包含在约65°C温度下于0.2XSSC中洗涤约15分钟； (e)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含在严格条件下与包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:21 或SEQ ID NO:23序列的核酸杂交的序列， 以及所述严格条件包括这样的洗涤步骤，其包含在约65°C温度下于0.2XSSC中洗涤约15分钟； (f)(a)至(d)中任意的核酸(多核苷酸)，其长度为至少约20、25、30、50、75、100、125、.150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、.1050 、1100、1150或更多个核苷酸残基，或基因或转录物的全长； (g)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的序列或其酶促活性片段，以及具有表1中所述的至少一个氨基酸残基改变(或其等价物)，或具有下列氨基酸残基改变中的至少I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:氨基酸残基4从T (或thr或苏氨酸)变为N(或asn或天冬酰胺)；氨基酸残基4从T (或thr或苏氨酸)变为R (或arg或精氨酸)；氨基酸残基4从T (或thr或苏氨酸)变为H(或his或组氨酸)；氨基酸残基9从P (或pro或脯氨酸)变为D(或asp或天冬氨酸))；氨基酸残基17从F(或phe或苯丙氨酸))变为V(或val或缬氨酸)；氨基酸残基21从F (或phe或苯丙氨酸))变为Y (或tyr或酪氨酸)；氨基酸残基33从L(或Ieu或亮氨酸)变为A(或ala或丙氨酸))；氨基酸残基38从R(或arg或精氨酸)变为H(或his或组氨酸)；氨基酸残基44从S (或ser或丝氨酸)变为T (或thr或苏氨酸)；氨基酸残基63从1(或ile或异亮氨酸))变为V(或val或缬氨酸)；氨基酸残基73从G (或gly或甘氨酸)变为Y (或tyr或酪氨酸)；氨基酸残基73从G (或gly或甘氨酸)变为V (或val或缬氨酸)；氨基酸残基73从G (或gly或甘氨酸)变为E (或glu或谷氨酸)；氨基酸残基108从F (或phe或苯丙氨酸)变为K (或Iys或赖氨酸)；氨基酸残基125从Q(或gin或谷氨酰胺)变为Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸残基150从V(或val或缬氨酸)变为A (或ala或丙氨酸));氨基酸残基188从S (或ser或丝氨酸)变为E (或glu或谷氨酸)；和/或氨基酸残基189从S (或ser或丝氨酸)变为Q (或gin或谷氨酰胺)；(h)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述多肽包含 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO: 22、SEQ ID NO: 24的序列或其酶促活性片段； (i)(A) (a)至(h)中任意的核酸(多核苷酸)并且编码这样的多肽，所述多肽具有至少一个保守氨基酸替代并且保持其木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性；或(B) (i)(A)的核酸，其中至少一个保守氨基酸替代包括用相似特性的另一种氨基酸替代氨基酸；或保守替代包括:用另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸；用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然；用另一种酸性残基置换酸性残基；用带有酰胺基团的另一种残基置换带有酰胺基团的残基；用另一种碱性残基交换碱性残基；或用另一种芳香族残基置换芳香族残基； (j)(a)至(i)的任意核酸(多核苷酸)，其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，但缺少信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块(CBM)；(k)(j)的核酸(多核苷酸)，其中所述糖结合模块(CBM)包含木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成； (IXa)至(k)的任意核酸(多核苷酸)，其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，进一步包含异源序列； Cm) (I)的核酸(多核苷酸)，其中所述异源序列包含编码下列的序列或由其组成:(A)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合；(B) (I)的序列，其中所述异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)源自异源酶；或(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶； (H)(I)的核酸(多核苷酸)，其中所述异源糖结合模块(CBM)包含木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成； (ο) (I)的核酸(多核苷酸)，其中所述异源信号序列将编码的蛋白靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒；或 (P)与(a)至(O)的任意序列充分(完全)互补的核酸序列(多核苷酸)。
2.分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)，其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，其中所述核酸包含为SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列或由其组成，所述序列具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物)，或具有下列核苷酸残基改变中的至少I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC ;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC ;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC ;编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为GAC ;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC ;编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC ;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG ;编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC ;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG ;编码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG ;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC ;编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG ;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC ;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC ;编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG ;和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG。
3.权利要求1或2所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中 (a)所述木聚糖酶活性包括催化内部β-1, 4-木糖苷键水解；包括内-1，4-β -木聚糖酶活性；包括水解木聚糖或阿拉伯木聚糖以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体；包括水解含1，4-β-糖苷-连接的D-吡喃木糖的多糖；包括水解纤维素或半纤维素；包括水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的纤维素或半纤维素；包括催化饲料或食品中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解；或包括催化微生物细胞或植物细胞中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解。 (b)所述葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性，例如内-1，4-和/或1，3-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性；催化1，4- β -D-糖苷键的水解；内-1，4-和/或1，3- β -内切葡聚糖酶活性或内-β -1, 4-葡聚糖酶活性；内-1，4- β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性；催化纤维素、纤维素衍生物、羧甲基纤维素和/或羟乙基纤维素、地衣多糖中的1，4-β -D-糖苷键、在混合的β -1, 3葡聚糖、谷类β -D-葡聚糖和/或含纤维素部分的其它植物材料中的β -1, 4键的水解；水解葡聚糖、β -葡聚糖或多糖以产生较小分子量的多糖或寡聚体；或， (c)所述甘露聚糖酶活性包括内-1，4-β -D-甘露聚糖酶活性,或催化β -1, 4-甘露聚糖或未取代的线性β-1，4-甘露聚糖的水解。
4.权利要求3所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述木聚糖或阿拉伯木聚糖包含水溶性阿拉伯木聚糖，以及任选地，所述水溶性木聚糖或阿拉伯木聚糖包括面团或面包产品。
5.权利要求3所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述饲料或食品包括基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、乳或乳制品、水果或蔬菜。
6.权利要求1-5中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中(a)所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是热稳定的；或(b)所述多肽在包含约0°C至约20°C、约20 °C至约37 V、约37 °C至约50 V、约50 °C至约70 V、约70 °C至约75 V、约75 °C至约80°C、约 80°C至约 85°C、约 85°C至约 90°C、约 90°C至约 95°C、约 95°C至约 100°C、约 100°C至约110°C之间或更高的温度范围的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
7.权利要求1至5中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中(a)所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是耐热的；或(b)所述多肽在暴露于约0°C至约20 V、约20°C至约37°C、约37°C至约50 V、约50 V至约70 V、约70°C至约75°C、约75°C至约80°C、约 80°C至约 85°C、约 85°C至约 90°C、约 90°C至约 95°C、约 95°C至约 100°C、约 100°C至约110°C或更高范围的温度后保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
8.权利要求1至7中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约PH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0或更小(更酸)pH的酸性条件下保持活性，或在暴露于包括约pH6.5、pH6、pH5.5、ρΗ5、ρΗ4.5、ρΗ4.0、ρΗ3.5、ρΗ3.0或更小(更酸)ρΗ的酸性条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
9.权利要求1至7中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、ρΗ10.5、pHll、pHll.5、pH12、pH12.5或更大(更碱)的碱性条件下保持活性，或在暴露于包括约 ρΗ7、ρΗ7.5、ρΗ8.0、ρΗ8.5、ρΗ9、ρΗ9.5、ρΗ10、ρΗ10.5、ρΗΙΙ、ρΗ11.5、ρΗ12、ρΗ12.5 或更大(更碱)的碱性条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
10.权利要求1至9中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在至少约80°C、81°C、82°C、83°C、84°C、85°C、86°C、87°C、88°C、89°C或90°C的温度和至少约 ρΗ7.5、ρΗ8.0、ρΗ8.5、ρΗ9、ρΗ9.5、ρΗ10、ρΗ10.5、ρΗ11、ρΗ11.5、ρΗ12、ρΗ12.5或更大(更碱)的碱性pH下保持活性。
【文档编号】C12N15/56GK103757036SQ201310541109
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2008年8月1日 优先权日:2007年10月3日
【发明者】K·A·加里, R·德尔梅尔 申请人:维莱尼姆公司