一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，检测步骤如下：（1）提取病原微生物基因组和基因组片段化；（2）设计和制备探针；（3）探针与基因组DNA片段进行杂交反应；（4）探针与杂交体固定于丙烯酰胺胶中，电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子；（5）核酸分子固相原位扩增；（6）信号检测，判断病原菌是否存在。本发明采用单个核苷酸分子捕获、扩增与检测技术，实现了原病微生物快速高效检测的目的，具有十分重要的应用前景和使用价值。本发明不仅可用于微生物鉴定，还可用于实验室、生产和临床中某些含量较低，且具有重要分析或诊断意义的分子的检测。
【专利说明】—种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物分子检测【技术领域】，特别是涉及一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术。
【背景技术】
[0002]食品安全问题越来越受到人们的重视，致病微生物对食品的污染问题历来是人们关注的首要食品安全问题。要从根本上解决食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术，同时一旦发生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短时间内完成检测，以制定科学合理的治疗方案，赢得治疗时间。这些快速分析检测技术的推广应用，不仅是对传统的食品安全分析检测技术的改进和提高，也使食品的质量安全有了进一步的保证。
[0003]近年来，随着各项科学技术的发展，食品安全快速分析检测技术也得到了一定程度的发展。目前，食品安全快速分析检测方法主要有三类:培养法、免疫学方法和分子生物学方法。[0004]培养法是最早发展起来的鉴定细菌的方法。目前，该种方法已改进为在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，使目标培养物的选择、分离和鉴定一次性完成。纸片法就是在培养法基础上发展起来的一种新型检测方法。该方法以纸片、纸膜和胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在培养基载体上，通过微生物在培养基和显色物质上的生长、显色来测定食品微生物。目前虽然已有纸片法产品运用于临床检测，但该方法仍存在较多不足之处，如培养检测仍需要较长的检测时间(约24小时)；显色指示剂系统单一，不能对细菌有区别地分类分析；测试纸检测的指标较少，通量低等。由于这些不足，纸片法产品的生产和临床运用仍然较少。
[0005]免疫学方法通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。酶联免疫吸附法是一种固相酶免疫分析方法，其是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测方法。该方法既可测抗原，也可测抗体，还可以进行定性和定量。但该方法也存在着如检测时间较长、致病菌单克隆抗体难以制备、使用多抗容易产生交叉反应而出现假阳性以及一次只能检测一种或几种致病菌等缺点和不足。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量。但该方法的成本较高，不仅流式细胞仪极为昂贵，而且对操作者的要求也较高。
[0006]随着分子生物学技术的发展，一些分子生物学检测技术与手段也开始应用于食品致病微生物的检测。实时定量PCR技术是在PCR基础上发展起来的一项新技术，该技术通过直接测定PCR过程中荧光信号的变化，利用电脑分析软件对PCR过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量，从而成功地实现了 PCR从定性到定量的飞跃。然而，实时荧光定量PCR技术常由于受到寡核苷酸杂交特异性、TaqMan探针比例和染料浓度大等因素的影响，引起定量结果出现偏差或导致假阳性和假阴性结果。[0007]基因芯片技术基于芯片上的探针与样品中的靶基因片段之间发生特异性核酸杂交，具有高通量、高灵敏度、准确、快速等特点。其不足之处是芯片技术本身具有较多问题，如特异性问题、假阴性和假阳性问题、芯片的产品质量和可靠性问题等。
[0008]因此，目前还需要开发可快速、高效检测致病菌的新技术。
【发明内容】
[0009]本发明主要解决的技术问题是提供一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，能够快速、高效检测致病菌。
[0010]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，检测步骤如下:
(O分离待检测食品中的微生物，并提取基因组DNA ;采用超声波或DNA破碎酶将上述基因组DNA随机打断成200~1000bp的片段；
(2)用DNA合成仪合成一条探针，并用丙烯酰胺对探针进行标记；
(3)将步骤(2)中标记后的探针与步骤(1)中打断的基因组DNA片段杂交；
(4)将步骤(3)中杂交后的溶液与丙烯酰胺贮存液混合，将均匀混合液平铺于基片上进行凝固形成胶，然后用非变性电 泳液电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子；
(5)向步骤(4)中电泳后的胶上滴加核酸分子扩增反应液、核酸荧光染料混合液，将混合液与胶一起密封在基片上并置于控温装置中，进行核酸分子原位扩增；
(6)用分辨率高于2048X2048的荧光显微镜或扫描仪进行荧光信号采集，根据阳性点的数量判断待检测样本的病原菌是否存在。
[0011]在本发明一个较佳实施例中，所述病原微生物为细菌、古细菌、真菌、病毒、支原体和藻类，来自于食品、水、空气和患者排泻物。
[0012]在本发明一个较佳实施例中，所述病原微生物是含有特征核酸分子的病原体。
[0013]在本发明一个较佳实施例中，所述特征核酸分子为单链或双链RNA，DNA, cDNA直链核酸分子或环形核酸分子。
[0014]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(3)中的基片为载玻片、硅片或芯片。
[0015]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(5)中的核酸分子原位扩增技术为PCR原位扩增或恒温原位扩增。
[0016]在本发明一个较佳实施例中，所述原位扩增采用原位单分子在三维胶内进行。
[0017]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(5)中的核酸荧光染料为SYBR Green 1、Genefinder 和 Geneview 中的至少一种。
[0018]在本发明一个较佳实施例中，所述核酸分子荧光染料与核酸分子扩增反应混合物一起添加或在扩增反应后添加。
[0019]本发明的有益效果是:本发明一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，针对目前市场上对于快速高效病原微生物检测技术的需要，采用单个核苷酸分子捕获、扩增与检测技术，实现了原病微生物快速高效检测的目的，具有十分重要的应用前景和使用价值。本发明不仅可用于微生物鉴定，还可用于实验室、生产或临床中某些含量较低，而具有重要分析或诊断意义的分子的检测。。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本发明一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术的示意图； 图2是单个核酸分子扩增与检测结果图；
附图中各部件的标记如下:1.基因组片段化处理；2.探针与靶向分子在溶液中杂交；
3.通过探针上的化学基团将靶向分子与探针的杂交体、以及引物/探针连接固定在固相载体胶中；4.采用电泳等技术将非靶向分子去除；5.采用固相PCR将靶向分子进行单分子原位扩增；6.扩增后的DNA分子簇直接显色后检测；a.细菌基因组DNA ;b.打碎成200-1000bp的非靶向DNA片段；c.打碎成200_1000bp的靶向DNA片段；d.标记有化学基团的探针分子；e.探针与靶向分子的杂交体；f.铺在载玻片或其他固相载体上的丙烯酰胺胶，该胶体中固定有标记了丙烯酰胺分子的引物/探针，以及引物/探针与靶向分子的杂交体，胶孔内还含有未杂交上去的非靶向片段；g.去除非靶向分子之后的胶体，及固定下来的引物与杂交体；h.扩增后的胶体与被扩增的靶向分子；1.信号采集图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0022]请参阅附图,本发明实施例包括:
实施例1
采用聚丙烯酰胺凝胶捕获靶片段和PCR原位扩增鉴定病原微生物 (I)探针/引物的设计与制备:
菌种特异DNA序列片段选择:采用Mega或Clustal W等软件进行生物信息学比较,并选择食品病原微生物的特异基因。
[0023]探针的设计:采用primerf.0软件，针对微生物的特异片段设计探针。
[0024]探针的合成与标记:一条探针/引物采用DNA合成仪进行合成，同时在5'端标记一个丙烯酰胺基团，前后引物都要进行标记。
[0025](2)病原微生物基因组提取、基因组片段化:
病原微生物基因组DNA提取:采集冷却肉及经屠宰加工后的鸭肉系列产品，用无菌棉拭子进行六面50cm2取样,然后将棉拭子上的微生物用PBS缓冲液(phosphate buffersaline,磷酸盐缓冲液)冲洗下来，14000rpm离心10分钟,分离微生物。采用试剂盒或本研究室优化后的微生物DNA抽提方法，抽提微生物全基因组DNA。
[0026]基因组DNA的超声波处理:选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成500-1000bp大小的基因片段。
[0027](3)片段化的基因组与探针杂交并固定于聚丙烯酰胺凝胶中
基因组与探针的杂交反应:杂交反应采用的杂交体系为:5XSSC (saline sodiumcitrate,朽1樣酸缓冲液),25%去离子甲酸胺,0.1% SDSCSodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸钠)，50yg/ml sheared salmon sperm和两条5'-丙烯酰胺-引物/探针为lpmol。将杂交反应液与基因组1: 2混合均匀，95°C变性5分钟，然后半小时内降至室温进行复性。
[0028] 硅片的表面修饰:
(A)选择大小合适的低荧光背景的硅片，置于80°C的piranha洗液(浓硫酸与30% H2O2按体积比7: 3混合)中超声洗涤2小时，然后依次用洗涤剂和去离子蒸馏水彻底清洗，烘干备用;
(B)硅烷化处理:将步骤(A)中烘干后的硅片置于含有2% APTES (3-Aminopro-pyltriethoxysilane, 3_氨丙基三乙氧基硅烷)的丙酮溶液中浸泡5~10分钟,然后分别用丙酮、乙醇和去离子蒸馏水彻底清洗两次，氮气吹干，180°C烘烤I~2小时。
[0029]探针/引物及杂交体固定于丙烯酰胺胶中，电泳去除未杂交上去的DNA片段: 探针/引物固定于丙烯酰胺胶中:配制掺有杂交溶液的丙烯酰胺溶液，该溶液包含:丙
烯酰胺(3%)、N，N'-甲叉双丙烯酰胺(0.15%)、过硫酸铵(0.05%)、TEMED (0.05%)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混匀后滴加到硅烷化处理的载玻片上，然后用排斥硅烷处理过的盖玻片盖在丙烯酰胺溶液上，形成5~20微米的薄层溶液，最后，将含有薄层溶液的玻片置于饱和湿度的真空环境中凝集0.5小时，形成凝胶。
[0030]电泳法去除非靶向片段:将带有凝胶的玻片取出，用去离子水冲洗几遍后，将其置于电泳液(0.5XTBE)中电泳5分钟，取出后用洗液(Tris.HCL 10 mmol/L, PH 7.5 ；KCL50mmol/L,EDTA 2mmol/L,0.01% Triton X-100)冲洗 2 次，最后用去离子水冲洗 2 ~4 次，
氮气吹干备用。
[0031](4)固相原位PCR扩增与信号检测
固相PCR扩增:制备30微 升PCR反应液，其中包含I XPCR反应液缓冲液，Mg2+L 8mmol/L, dNTPs 200 mol/L, Taq DNA 聚合酶 I U 和 10XSYBR Green I。将适量的 PCR 反应用液滴加到胶上，在胶上覆盖一个密封的盖盒，使PCR反应体系得以在密闭的环境中完成。置于玻片温控体系中进行如下PCR扩增:95°C预变性2分钟，然后95°C变性I分钟，Tm复性I分钟，72°C延伸30秒，共35个循环，最后，72°C再延伸5分钟。PCR反应结束后，去除PCR反应液。
[0032]信号检测:将玻片贴有丙烯酰胺胶的一面放置于高分辨率(高于2048X2048)的荧光显微镜下观察并拍照，计数阳性点数量。
[0033]实施例2
采用聚丙烯酰胺凝胶捕获靶片段和恒温原位扩增鉴定病原微生物 (I)探针/引物的设计和制备:
菌种特异DNA序列片段选择:采用Mega或Clustal W等软件比较生物信息学,并选择食品病原微生物的特异基因。
[0034]探针/引物的设计:采用primerf.0软件，针对微生物的特异片段设计探针。
[0035]探针/引物的合成与标记:一条探针/引物采用DNA合成仪进行合成，同时在5'端标记一个丙烯酰胺基团，前后引物都要进行标记。
[0036](2)病原微生物基因组提取、基因组片段化和环化
病原微生物基因组DNA提取:采集冷却肉及经屠宰加工后的鸭肉系列产品，用无菌棉拭子进行六面50cm2取样，然后将棉拭子上的微生物用PBS冲洗下来，HOOOrpm离心10分钟，分离微生物。采用试剂盒或本研究室优化后的微生物DNA抽提方法，抽提微生物全基因组 DNA。
[0037]基因组DNA的超声波处理:选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200-500bp大小的基因片段。[0038]基因组DNA片段的通用连接子连接:将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(I inker 1: 5 '-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT-3 ' ； l inker2:5' -GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3')连接，形成一个双链的环，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成单链环。
[0039](3)片段化的基因组与探针杂交并固定于聚丙烯酰胺凝胶中
基因组与探针的杂交反应:杂交反应采用的杂交体系为:5XSSC，25%去离子甲酰胺，
0.1% SDS, 50 μ g/ml sheared salmon sperm和两条 5'-丙烯酰胺-引物 / 探针为 lpmol。将杂交反应液与基因组1: 2混合均匀，在95°C时变性5分钟，然后再在半小时内降至室温进行复性。
[0040]硅片的表面修饰:
(A)选择大小合适的低荧光背景的硅片，置于80°C的piranha洗液(浓硫酸与30%H2O2按体积比7: 3混合)中超声洗涤2小时，然后依次用洗涤剂和去离子蒸馏水彻底清洗，烘干备用;
(B)硅烷化处理:将步骤(A)中烘干后的硅片置于含有2%APTES (3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5~10分钟,然后用丙酮、乙醇和去离子蒸懼水分别彻底清洗两次，氮气吹干后在180°C烘烤I~2小时。
[0041]探针/引物及杂交体固定于丙烯酰胺胶中，电泳去除未杂交上去的DNA片段: 探针/引物固定于丙烯酰胺胶中:配制掺有杂交溶液的丙烯酰胺溶液，该溶液包含:丙
烯酰胺(3%)、N，N'-甲叉双丙烯酰胺(0.15%)、过硫酸铵(0.05%)、TEMED (0.05%)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混匀后滴加到硅烷化处理的载玻片上，然后用排斥硅烷处理过的盖玻片盖在丙烯酰胺溶液上，形成5~20微米的薄层溶液，最后，将含有薄层溶液的玻片置于饱和湿度的真空环境中凝集0.5小时，形成凝胶。
[0042]电泳法去除非靶向片段:将带有凝胶的玻片取出，并用去离子水冲洗几遍后，将其置于电泳液(0.5XTBE)中电泳5分钟，取出后用洗液(Tris.HCL 10 mmol/L,PH 7.5 ；KCL 50mmol/L, EDTA 2 mmol/L,0.01% Triton X-100)冲洗2次，最后用去离子水冲洗2~4次，
氮气吹干备用。
[0043](4)固相恒温原位扩增与信号检测
恒温原位扩增:制备30微升恒温扩散反应液，其中包含10 X SYBR Green 1、Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/yL)、lXBst DNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800 μ mol/L)。将适量的恒温扩增反应液滴加到胶上，在胶上覆盖一个密封的盖盒，使扩增反应体系得以在密闭的环境中完成。将芯片放置于50°C条件下，扩增30分钟，去除扩增反应液。
[0044]信号检测:将玻片贴有丙烯酰胺胶的一面放置于高分辨率(高于2048X2048)的荧光显微镜下观察并拍照，计数阳性点数量。
[0045]实施例3
采用流道式芯片进行聚丙烯酰胺凝胶捕获靶片段和PCR原位扩增鉴定病原微生物 (1)探针/引物的设计和制备:
菌种特异DNA序列片段选择:采用Mega或Clustal W等软件比较生物信息学,并选择食品病原微生物的特异基因。
[0046]探针/引物的设计:采用primerf.0软件，针对微生物的特异片段设计探针。
[0047]探针/引物的合成与标记:一条探针/引物采用DNA合成仪进行合成，同时在5'端标记一个丙烯酰胺基团，前后引物都要进行标记。
[0048](2)病原微生物基因组提取、基因组片段化:
病原微生物基因组DNA提取:采集冷却肉及经屠宰加工后的鸭肉系列产品，用无菌棉拭子进行六面50cm2取样，然后将棉拭子上的微生物用PBS冲洗下来，HOOOrpm离心10分钟，分离微生物。采用试剂盒或本研究室优化后的微生物DNA抽提方法，抽提微生物全基因组 DNA。[0049]基因组DNA的超声波处理:选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成500-1000bp大小的基因片段。
[0050](3)流道式芯片制备 娃片的表面修饰:
(A)选择大小合适的低荧光背景的硅片，置于80°C的piranha洗液(浓硫酸与30%H2O2按体积比7: 3混合)中超声洗涤2小时，然后依次用洗涤剂和去离子蒸馏水彻底清洗，烘干备用;
(B)硅烷化处理:将步骤(A)中烘干后的硅片置于含有2%APTES (3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5~10分钟,然后用丙酮、乙醇和去离子蒸懼水分别彻底清洗两次，氮气吹干后在180°C烘烤I~2小时。
[0051](C)将耐高温的PE材料刻成一定的形状，两边涂上耐高温胶水，将两片玻片粘合在一起，两玻片中间形成多条流道，流道两端有进样孔和出样孔。
[0052](4)片段化的基因组与探针杂交于聚丙烯酰胺凝胶混合液并固定于芯片流道中 基因组与探针/引物的杂交反应:杂交反应采用的杂交体系为:5XSSC，25%去离子甲
酰胺，0.1% SDS, 50 μ g/mL sheared salmon sperm和两条5'-丙烯酰胺-引物/探针为Ipmol0将杂交反应液与基因组1: 2混合均匀，在95°C时变性5分钟，然后再在半小时内降至室温进行复性。
[0053]探针/引物、杂交体与丙烯酰胺混合液灌注芯片，电泳去除未杂交的DNA片段:配制掺有杂交溶液的丙烯酰胺溶液，该溶液包含:丙烯酰胺(3%)、N, N'-甲叉双丙烯酰胺(0.15%)、过硫酸铵(0.05%)、TEMED (0.05%)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混匀后，采用微量注射器将上述混合液注入芯片的流道中形成5~20微米的薄层溶液，最后，将含有薄层溶液的芯片置于饱和湿度的真空环境中凝集0.5小时，形成凝胶。
[0054]电泳法去除非靶向片段:将芯片置于电泳液(0.5XTBE)中，电极插入进样孔和出样孔，电泳 5 分钟，取出后再用洗液(Tris.HCL 10 mmol/L, PH 7.5 ；KCL 50mmol/L, EDTA2mmol/L,0.01% Triton X-100)冲洗2次，然后用去离子水冲洗2~4次，抽干流道中的溶液，备用。
[0055](5)固相原位PCR扩增与信号检测
固相PCR扩增:制备30微升PCR反应液，其中包含I X PCR反应液缓冲液，Mg2+ 1.8mmol/L, dNTPs 200 mol/L, Taq DNA 聚合酶 I U 和 10 X SYBR Green I。将适量的 PCR 反应液灌注到芯片内，两端加样孔用封口胶密封，然后将其置于温控体系中进行如下PCR扩增:95°C预变性2分钟，然后95°C变性I分钟，Tm复性I分钟，72 °C延伸30秒，共35个循环，最后，72°C再延伸5分钟。PCR反应结束后，去除PCR反应液。
[0056]信号检测:将玻片贴有丙烯酰胺胶的一面放置于高分辨率(高于2048X2048)的荧光显微镜下观察并拍照，计数阳性点数量。
[0057]本发明具有如下优点:
(I)实现了病原微生物的快速检测与鉴定:该检测方法无需增菌培养，直接分离食品表面的细菌，并抽提细菌基因组DNA，将抽提的DNA首先进入靶序列的捕获，然后进行原位扩增和检测，整个流程在3~5小时内即可完成，分子分析过程速度较快。本发明采取的样品如果含有5个以上的细菌即可以检测出来。通常，对于大部分病原菌，5个以下的细菌不足以引起疾病。
[0058](2)实现了病原微生物的高灵敏度检测:采用捕获的方法将目标片段与其他非特异DNA片段分开，实现了单分子扩增与检测技术。DNA扩增效率与被扩增分子与引物分子之间的碰撞机会呈正相关，理论上，PCR扩增反应可以将溶液中的单个分子扩增出来，但实际实验操作过程中发现，PCR检测的灵敏度是100-100000个分子，一般的反应体系需要10000个分子以上。本发明在进行单分子扩增之前，首先通过电泳或沉淀等技术将非目标片段去除，剩余的片段只有引物和目标分子，这样大大增加了目标分子与引物之前的碰撞机会，也大大提高了目标分子的扩增效率。
[0059]另外，本发明针对同一种病原微生物采用多个捕获探针，检测部位含有5个以上的细胞即可以被检测到。理论上有一个DNA分子即可以被捕获并检测到，但由于操作过程中有一定的消耗，因此该 项研究检测的灵敏度为大约为5个细胞。
[0060](3)实现了进行多种病原微生物或多个样本同时检测:由于单个分子扩增需要一块很小的区域(一平方毫米可以有1000个以上分子的扩增点)，在一张载玻片上可以制作50以上的凹槽，每个凹槽至少可以检测一种微生物或一个样品，因此，该项技术能够实现多种病原微生物同时检测。
[0061](4)采用分子的溶液内杂交捕获，以及捕获探针胶固定模式，具有较高的杂交效率和较高的捕获探针固定效率:以往的捕获探针与目标片段杂交采用固液相杂交，也就是将探针分子固定在固相载体上，然后将含有目标分子的片段与探针在固液相中进行杂交，由于固液相条件下，探针与靶向片段分子的碰撞机会与液相杂交相比要少很多，因此液相杂交效率明显高于固液相杂交；对于液相杂交结束后捕获探针的固定，目前效率最好的是磁珠上包被亲和素与探针上连接有生物素相结合，固定效率最高达30%，而本发明所采用的丙烯酰铵凝胶固定，其固定效率至少为50%，最高可达到95%以上，也就是10个分子中至少有5个分子被捕获。
[0062](5)采用三维胶内原位扩增模式，大大提高了原位扩增效率:截止到目前所报导的原位扩增只有三种类型，一种是在一个平面上进行桥式PCR原位扩增，一种是在磁珠上进行PCR原位扩增，还有一种是在三维胶内进行滚环扩增。前两种原位扩增由于平面上所固定引物数量有限，引物与模板链相碰撞的机会相应较少；而且扩增产物还会产生一定的空间位阻，阻止了引物与模板链的有效结合，导致这两种原位扩增效率较低，条件较难控制。在三维空间内进行的滚环扩增，由于扩增模板是一个环形的模板，应用面较窄，另外由于连接成环的效率不是很高，所以检测的灵敏度也受到较多限制。本发明在三维结构的胶内进行PCR扩增，引物提前固定在三维胶上，增加了引物与模板的接触机会和接触空间，使得原位扩增易于实现。
[0063](6)采用原位单分子扩增技术，能够定量检测食品中病原微生物的含量:在模板分子数量较少的情况下，一个扩增点只有一个原模板分子，因此，每一个扩增点代表一个拷贝的DNA分子，而每一个拷贝的DNA模板分子来自于一个细菌或一个生命个体(对于单拷贝基因来说)，因此，根据原位扩增位点能够大体进行定量分析。
[0064](7)检测方法多样，可根据需要进行选择，成本相对较低:首先，可以采用DNA荧光染料(如SYBR Green I)进行显色，有DNA的位点会有荧光发出，然后通过扫描仪或荧光显微镜进行检测。该方法简单快速，成本较低；第二种检测方法为探针杂交的方法，即针对扩增产物设计探针，探针一端连接有荧光，探针与扩增产物杂交后进行电泳，去除未杂交上去的探针，然后通过荧光检测仪检测信号分子。该方法更为准确，但操作起来较为繁琐；第三种检测方法是测序法，测序法也就是以扩增产物为测序模板，进行延伸测序，这种方法对于仪器要求较高，成本相应的也较高，但是检测结果绝对可靠，而且还可以进行微生物的分型与突变检测。
[0065]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，检测步骤如下: (1)分离待检测食品中的微生物，并提取基因组DNA;采用超声波或DNA破碎酶将上述基因组DNA随机打断成200~1000bp的片段； (2)用DNA合成仪合成一条探针，并用丙烯酰胺对探针进行标记； (3)将步骤(2)中标记后的探针与步骤(1)中打断的基因组DNA片段杂交； (4)将步骤(3)中杂交后的溶液与丙烯酰胺贮存液混合，将均匀混合液平铺于基片上进行凝固形成胶，然后用非变性电泳液电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子； (5)向步骤(4)中电泳后的胶上滴加核酸分子扩增反应液、核酸荧光染料混合液，将混合液与胶一起密封在基片上并置于控温装置中，进行核酸分子原位扩增； (6)用分辨率高于2048X2048的荧光显微镜或扫描仪进行荧光信号采集，根据阳性点的数量判断待检测样本的病原菌是否存在。
2.根据权利要求1所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述病原微生物为细菌、古细菌、真菌、病毒、支原体和藻类，来自于食品、水、空气和患者排?与物。
3.根据权利要求2所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述病原微生物是含有特征核酸分子的病原体。
4.根据权利要求3所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述特征核酸分子为单链或双链RNA，DNA, cDNA直链核酸分子或环形核酸分子。
5.根据权利要求1所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述步骤(3)中的基片为载玻片、硅片或芯片。
6.根据权利要求1所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述步骤(5)中的核酸分子原位扩增技术为PCR原位扩增或恒温原位扩增。
7.根据权利要求6所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述原位扩增采用原位单分子在三维胶内进行。
8.根据权利要求1所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述步骤(5)中的核酸突光染料为SYBR Green 1、Genefinder和Geneview中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，所述核酸分子荧光染料与核酸分子扩增反应混合物一起添加或在扩增反应后添加。
【文档编号】C12Q1/04GK103740808SQ201310563819
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】周东蕊, 张红琳, 白志茂, 严勇, 陆祖宏, 肖鹏峰, 李清宁 申请人:东南大学