枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用，枸杞紫黄质脱环氧化酶基因选自以下核苷酸序列之一：1)具有SEQ?ID?No.1序列所示的核苷酸序列；2)SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3'RACE技术克隆枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE，得到完整的基因序列为1413bp。枸杞紫黄质脱环氧化酶LmVDE能够催化紫黄质转化为花药黄质，并进一步转化为玉米黄质。将LmVDE基因转化洋桔梗后得到了阳性转化苗，光胁迫实验结果表明转化LmVDE基因后与野生植株相比抗光胁迫能力得到了显著提高。
【专利说明】枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及在提高植物抗胁迫能力应用，具体为枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及包括该基因的重组载体及应用，包括枸杞(Lyciumchinense Miller)紫黄质脱环氧化酶(violaxanthin de-epoxidase)基因的克隆，属于分子生物学和生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]紫黄质循环是类胡萝卜素合成途径的一部分。类胡萝卜素广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中，它主要包括胡萝卜素(carotenes)和叶黄素(xanthophylls)两大类。前者有α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。叶黄素则是胡萝卜素的氧化衍生物，它包括V(violaxanthin)、A(antheraxanthin)、Z(zeaxanthin)、新黄素(neoxanthin) >lutein 以及1roxanthin等。紫黄质循环,主要由三个组分即V、A、Z、紫黄质脱环氧化酶(violaxanthinde-epoxidase, VDE)和玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase, ZE)参与。紫黄质脱环氧化酶是紫黄质循环的关键酶，在强光下可以迅速将V转化为A和Z，从而增加紫黄质循环中各色素的总含量。
[0003]紫黄质循环存在于所有的高等植物中，是植物在长期进化过程中所保存下来的一种代谢过程，它具有多方面的功能，其中依赖于紫黄质循环的热耗散是最主要的功能(Gilmore，1997 ;Horton，1996 ;Muller，2001)。在正常情况下，PSII 中吸收光能的 10% 会形成3Chl*,叶黄素可以消耗3Chl*的能量，在分离的LHCII中，植物叶片所吸收的光能中大部分是通过热耗散途径使3Chl*去激发转变为热能消耗到体外。高等植物光合机构中，以NPQ表示的热耗散强度与Z+A的含量成正相关，Z(包括A)在耗散过多的激发能中起着非常重要的作用(Demmig-Adams, 1996 ；GiImore, 1997)。
[0004]此外紫黄质循环还有稳定类囊体膜结构等功能，用紫外线照射使膜脂发生氧化，L和Z都能够防止膜脂的氧化，但Z的保护能力比L强，这可能与它们和膜脂的组织状态有关(Sujak et al, 1999)。已经有一些实验证明多种叶黄素对活性氧的粹灭作用(Havaux etal,1998)ο
[0005]紫黄质(V)、花药黄质(A)、玉米黄质(Z)作为类胡萝卜素的重要组成色素，也是某些信号分子的前体物质，对植物的生长、清除体内自由基、延缓机体衰老有重要作用。同时将紫黄质脱环氧化酶基因转入植物中，可提高植物的抗强光、抗紫外等抗逆能力，对改良环境有重要作用。随着对类胡萝卜素代谢途径相关机制及功能研究的深入，其应用前景会越来越广阔。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及该基因编码的蛋白质。
[0007]本发明的第二个目的是提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。
[0008]本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。[0009]本发明提供了一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因hKM，如序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列构成。
[0010]本发明提供了一种上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0011]本发明提供了一种上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因重组克隆载体ρ]\ω?8-τ-ζ?ΚΜ。
[0012]含有上述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的重组载体，这些重组载体包括质粒。
[0013]所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体ρΕΤ28&_Ζ?ΚΜ。
[0014]含有上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
[0015]所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。
[0016]本发明提供了一种含有基因工程菌。
[0017]上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因的应用包括该基因编码的蛋白在大肠杆菌中的应用；
本发明提供的一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因，如序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，还包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0018]本发明提供的一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因编码的蛋白，如序列表SEQID N0.2所示氨基酸序列。
[0019]本发明的克隆方法由下述步骤组成:
从枸杞叶片中提取总RNA,根据转录组Unigene序列中枸杞紫黄质脱环氧化酶基因核苷酸序列设计上游引物:5’ -CGCGGATCCATGGCTCTCGCCCCTTATTC _3’，然后利用 3’RACE方法扩增得到完整的基因序列为1413bp。
[0020]本发明构建含枸杞紫黄质脱环氧化酶基因的大肠杆菌表达载体m^Sa-LmVDE,由下述步骤组成:
O构建含有枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的中间载体pMDlS-T-ZffiKM:
设计由SEQ ID N0.3所示的上游引物P1，和由SEQ ID N0.4所示的下游引物P2，以枸杞紫黄质脱环氧化酶基因的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18_T载体，获得含有序列表中SEQ ID N0.1所示的基因的中间载体pMDlS-T-ZffiKd
[0021]2)构建大肠杆菌表达载体ρΕΤ28&-Ζ?ΚΜ:
提取载体pMDlS-T-hKM备BamHl和5^1酶切后，将大肠杆菌表达载体pET28a经BamHl和Sal\酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体ρΕΤ28&-Ζ?ΚΜ。
[0022]本发明提供了一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码紫黄质脱环氧化酶的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用体外反应体系验证枸杞基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。
[0023]本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3’ RACE技术克隆了枸杞紫黄质脱环氧化酶基因hKM，得到完整的基因序列为1413bp。构建了大肠杆菌表达载体ρΕΤ28&-Ζ?ΚΜ，应用体外反应体系，对克隆的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因编码的酶活性进行了鉴定，紫黄质脱环氧化酶LmVDE能够催化紫黄质转化为花药黄质，并进一步转化为玉米黄质。将LmVDE基因转化植株后，其抗光胁迫能力显著提高。
[0024]附图附表说明
图1 pMD18-T-Z?ra5'载体示意图。
[0025]图2 ρΕΤ28β-Ζ?^载体示意图。
[0026]图3 pET28a_Z?ra5'酶切验证结果。
[0027]图4 (a)酶促反应的吸收光谱分析；(b)叶黄素色素库的HPLC分析。
[0028]图5转化阳性烟草检测图。
【具体实施方式】
[0029]实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0030]实施例1
枸杞紫黄质脱环氧化酶基因的克隆:
以RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, German)试剂盒,从0.1g新鲜枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LibVDE上游引物(SEQ ID N0.3)为::5’-CGCGGATCCATGGCTCTCGCCCCTTATTC -3’。利用 3’-FULLRACE Core Set Ver.2.0 (TaKaRa，Japan)试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤:①以总RNA为模板，使用3’ RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一链，反应体系如下:
RNA:2μ I
3’ RACE Adaptor:1 μ I
5XM-MLV Buffer:2 μ I
dNTP Mixture:I μ I
RNase Inhibitor:0.25 μ I
Reverse Transcriptase M-MLV:0.25 μ I
RNase Free dH20:3.5 μ I
反应条件:42°C，60min ;70°C，15min。
[0031]②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物(SEQ ID N0.4) 3’ RACE outprimer: 5’ -TACCGTCGITCCACTAGTGAITT -3’，以 cDNA 第一链为模板，进行 PCR 反应，反应体系如下:
cDNA: 第一链:2 μ I
dNTP:8 μ I
LmVDE?:2 μ I
3’ RACE out primer:2 μ I
10XLA PCR Buffer II:4μ I
MgCl2:3 μ I
TaKaRa LA Taq:0.25 μ I
dH20:28.75 μ I反应条件:94°C,4min ；94°C,30sec ；55°C,30sec ；72°C,2min ；72°C, lOmin, 30 个循环。
[0032]实施例2
克隆载体ρΜ?18-Τ?Μ的构建过程
将序列表所示的LmVDE基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下:
PMD18-T 载体:I μ I
目的PCR片段:4μ1
SolutionI:5 μ I
反应条件:16°C，30min。连接产物转化E.coli ToplO，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因的引物进行菌落 PCR (反应条件:94°C,4min ；94°C,30sec ；55°C,30sec ;72°C，2min ；72°C，10min，30个循环。)得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。
[0033]实施例3
大肠杆菌表达载体ρΕΤ28&-Ζ?ΚΜ的构建过程
首先，提取载体ρΜ?18-Τ-Ζ?ΚΜ HBamHl和Sall酶切，pET28a质粒经及應TI和ZAoI双酶切，将二者酶切产物连接:16°C，16hrs，连接(2 μ I IOXT4 buffer,0.5 μ I T4 DNA连接酶，5 “1载体0嫩，7.5 “1外源0嫩，5 μ I ddH20)。连接产物转化E.coli ToplO，涂布于含Amp的LB平板。以目的基因的引物进行PCR得到1413bp产物，酶切鉴定得到目的条带如图2所示，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体ρΕΤ28&-Ζ?ΚΜ构建正确。
[0034]将构建好的大肠表达载体ρΕΤ28&-Ζ?ΚΜ转化大肠杆菌BL21。
[0035]实施例4
基因在大肠杆菌中表达的紫黄质脱环氧化酶LmVDE的功能验证紫黄质的分离:取新鲜枸杞叶片，液氮研磨即时用于实验(或_80°C保存)，在暗光处用100%的丙酮提取总色素，接着用展开剂(丙酮:正己烷为1:1)在TLC板上进行色素分离，倒数第二条带为紫黄质，轻轻刮取回收溶于甲醇。
[0036]酶促反应分析:原核表达菌株37°C震荡培养，并用IPTG诱导表达8h后，取40mL菌液 4°C,4000xg 离心 lOmin,菌体用 3ml 的 ImMEDTA, 50mMTris (pH7.4)重悬液重悬。将重悬液放在冰上，超声波细胞破碎仪破碎10个循环(每个循环开30s/关30s);破碎产物4°C，lOOOOxg，离心lOmin，收集上清液IOOuL用于酶促反应，反应体系为:3mL，0.33 μ M紫黄质、0.9 μ M MGDG、30mM抗坏血酸钠、0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液、pH 5.1。将3ml的反应体系加入玻璃比色杯中，用UVIKON~943紫外可见双光束分光光度计测定502nm和540nm的吸光值，每隔Imin测定一次。此外分别在酶促反应0、4、8、12、16和20min后，加入固体TriS中止酶促反应。用乙醚重复抽提3次，用氮气吹干，并溶于40 UL 100%的丙酮中，经滤膜过滤后用于HPLC分析。
[0037]总胡萝卜素的HPLC 检测:使用 nucleosil 100-3 c250X4.6 mm (MN, Germany)色谱柱，兰博(进口 SSI)四元梯度泵。按照Thayer SS (Thayer SS and Bjorkman OLeaf xanthophyll content and composition in sun and shade determined by HPLC.Photosynth Res 23: 331 - 343)等(1990)的方法进行高效液相色谱分析。如图4 (b)所示，在体外反应体系中，随着反应时间的增加，A502-540um值逐渐增大，而对照组无此变化。该反应体系总色素含量经HPLC分析表明:随着反应时间的增加，V的相对含量由100%逐渐降低，A的含量先上升后下降，Z的含量由0%逐渐上升。
[0038]实施例5
农杆菌介导的洋桔梗遗传转化 本实验用到的培养基如下所示:`
【权利要求】
1.一个枸杞紫黄质脱环氧化酶基因，其特征在于选自以下核苷酸序列之一: 1)具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列； 2)SEQ ID N0.1所不的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质具有SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列。
3.—种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因全序列或部分片段。
4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体
5.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组载体的大肠杆菌BL21。
6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因全序列或部分片段。
7.权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因用于转化玉米黄质的应用。
8.权利要求1所述 的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因在植物抗光胁迫中的应用。
【文档编号】C12P23/00GK103710362SQ201310582038
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】季静, 王罡, 张旭强, 刁进进, 钟影, 曹海燕 申请人:天津大学