一种提高体外受精胚胎发育率的方法
【专利摘要】本发明提供了一种提高体外受精胚胎发育率的方法，在确定卵母细胞成熟培养时间范围的基础上，检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将卵母细胞体外成熟培养至谷胱甘肽含量下降前进行体外受精。本发明为今后体外受精胚胎的生产和相关科学研究奠定了基础。
【专利说明】一种提高体外受精胚胎发育率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高体外受精胚胎发育率的方法，属于胚胎工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近些年来，体外受精技术得到迅猛发展和广泛应用，使良种动物的生产从基础研究迈进产业化，而产业化成功的关键就在于体外受精胚胎的发育，目前，体外受精胚胎的发育水平比较低，制约着体外受精胚胎的产业化发展，研究表明，这主要与卵母细胞体外成熟质量相关，因此，得到能促进体外受精胚胎发育的高质量卵母细胞是十分重要的。现已证明，卵母细胞中谷胱甘肽的含量决定了卵母细胞成熟质量，通过添加半胱氨酸在一定程度上提高了谷胱甘肽含量，并进一步促进了体外受精胚胎的发育，但进一步添加并不能够继续提高卵母细胞中谷胱甘肽含量，而且谷胱甘肽的含量随着成熟培养时间的增加而降低。目前，体外受精胚胎的生产多使用完全成熟的卵母细胞，而该阶段的卵母细胞谷胱甘肽含量已降低，从而导致体外受精胚胎的发育率较低，不利于体外受精胚胎在良种繁殖中的应用。因此根据谷胱甘肽含量确定成熟的卵母细胞成熟与应用将在体外受精胚胎的生产和科学研究领域中具有实际应用价值。
[0003]体外受精技术是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精继而发育的技术，它是在家畜繁殖领域继人工授精、胚胎移植技术之后的又一次革命。体外受精技术的迅速发展，使得哺乳动物卵母细胞的成熟、受精以及胚胎的发育可在体外更加直观的进行研究，并得到了广泛的应用。2010年，爱德华兹因发明该技术独享了 2010年的诺贝尔生理学奖。但是，成功获得体外受精的胚胎并不是体外受精技术的最终目的，如何利用体外受精技术加快胚胎产业化进程才是科研人员始终要面对的课题。在畜牧生产领域，通过体外受精技术技术可以挖掘良种动物的繁殖潜力，加快良种的繁殖速度，继而促进体外受精胚胎产业化的进程。但迄今为止，体外受精胚胎的发育率仍然是亟待解决的问题，这主要与卵母细胞体外成熟质量密切相关。目前，体外受精技术主要采用完全成熟的卵母细胞，即卵母细胞的细胞核和细胞质充分成熟，而这种方法容易导致卵母细胞中谷胱甘肽含量降低，从而导致原核形成比例降低，不利于后期胚胎的发育。现有技术并不能从根本上实质性的提高体外受精胚胎的发育，这也严重困扰着体外受精胚胎的产业化和相关科学研究的发展。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种提高体外受精胚胎发育率的方法，技术方案如下:
[0005]I)确定卵母细胞成熟培养时间范围；
[0006]2)检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将卵母细胞体外成熟培养至谷胱甘肽含量下降前进行体外受精。
[0007]进一步地，以猪作为模型，提高猪体外受精胚胎发育率，步骤如下:
[0008]I)确定猪卵母细胞成熟培养时间范围；[0009]2)检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将猪卵母细胞体外成熟培养至谷胱甘肽含量下降前进行体外受精。
[0010]猪卵母细胞体外成熟培养时间为:
[0011]具体而言，根据猪卵母细胞体外成熟过程中极体排出的比例，确定猪卵母细胞体外成熟培养时间为33-42h，检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，确定用于体外受精的卵母细胞成熟培养时间为33-39h，优选时间为33-36h，效果最好时间为33h。
[0012]更进一步，一种提高猪体外受精胚胎发育率的方法，具体步骤如下:
[0013]1)在猪卵母细胞体外成熟液中培养具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞，培养的条件为38.5°C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱；
[0014]2)通过检测猪卵母细胞体外成熟过程中极体排放比例，确定猪卵母细胞成熟培养时间为33-42h ；
[0015]3)通过检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，确定33h谷胱甘肽含量含量最高，按照步骤I)方法将猪卵母细胞成熟培养33h后进行体外受精。
[0016]本发明还提供一种确定猪卵母细胞培养时间的方法，是确定猪卵母细胞成熟培养时间范围，检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，确定在成熟培养时间范围内谷胱甘肽含量最高的时间为猪卵母细胞培养时间。
[0017]本发明还提供了一种猪卵母细胞培养方法，步骤为:1)先确定猪卵母细胞培养时间；2)将猪卵母细胞培养至步骤I)确定的时间。
[0018]本发明通过比较猪卵母细胞体外成熟过程中极体排放比例，确定猪卵母细胞成熟培养时间，检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量和胚胎发育情况，证明猪卵母细胞成熟培养33-42h能够促进原核的形成和胚胎的发育。因此本发明获得了一个能促进猪体外受精胚胎原核形成和发育的卵母细胞成熟培养阶段，为今后体外受精胚胎的生产和相关科学研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1猪卵母细胞体外成熟过程中极体排出情况。
[0020]图2猪成熟卵母卵丘细胞复合物和卵母细胞；
[0021](A:猪卵母卵丘细胞复合物培养33h ；B:猪卵母卵丘细胞复合物培养36h ；C:猪卵母卵丘细胞复合物培养39h ；D:猪卵母卵丘细胞复合物培养42h ；E:成熟培养33h的猪成熟卵母细胞；F:成熟培养36h的猪成熟卵母细胞；G:成熟培养39h的猪成熟卵母细胞；H:成熟培养42h的猪成熟卵母细胞)。
[0022]图3猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量；
[0023](A:猪卵母细胞成熟培养33h谷胱甘肽含量；B:猪卵母细胞成熟培养36h谷胱甘肽含量；C:猪卵母细胞成熟培养39h谷胱甘肽含量；D:猪卵母细胞成熟培养42h谷胱甘肽
含量)。
[0024]图4猪体外受精胚胎原核形成情况；
[0025](A:精子未解聚的体外受精胚胎；B:精子解聚的体外受精胚胎；C:原核形成的体外受精胚胎)。
[0026]图5猪体外受精胚胎囊胚；[0027](A:来源于培养33h卵母细胞的囊胚；B:来源于培养36h卵母细胞的囊胚；C:来源于培养39h卵母细胞的囊胚；D:来源于培养42h卵母细胞的囊胚)。
【具体实施方式】
[0028]图1结果表明，猪卵母细胞体外成熟培养33h (79.36%)与体外成熟培养42h(82.68%)的极体排出比例差异不显著，故猪卵母细胞体外成熟培养33h已经成熟。
[0029]下面结合说明书附图对本发明进一步说明。
[0030]实施例1卵母细胞成熟培养33h对体外受精胚胎发育的影响
[0031]1、卵母细胞体外成熟培养 [0032]从屠宰场收集卵巢并在37°C的生理盐水中运送回实验室，抽取直径为3_5mm的有腔卵泡，在洗卵液中洗涤3次，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞，然后在成熟液中洗涤3次，将洗净的卵母细胞移入500 μ L卵母细胞体外成熟培养滴中，每滴放入40-50枚卵细胞，最后置入培养的条件为38.50C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。
[0033]2、卵母细胞体外成熟过程中极体排放检测
[0034]卵母细胞体外培养成熟过程中，将培养33h的卵母卵丘细胞复合物(如图2A)放入含有lmg/mL透明质酸酶的管内，旋涡振荡3分钟去除卵丘细胞，然后用操作液洗涤一遍，显微镜下挑选排出极体的卵母细胞，如图2D (注:A-D (40X) ；E-H (100X))所示。
[0035]3、成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量检测
[0036]将成熟培养33h的卵母细胞在4%多聚甲醛中室温固定15min，在PBS中洗3次，移入到5 μ mol/LCell Tracker Blue中孵育30min,然后在操作液中再孵育30min,然后在荧光镜下照相，如图3A所示(注:A-D(100X))，利用Image-Ρ-- Plus软件进行光密度分析(详见表1)，同时应用碧云天试剂盒对成熟培养33h的卵母细胞进行谷胱甘肽含量测定，将卵母细胞移入到新鲜配制的IOul蛋白去除试剂M中，在液氮和37°C水浴中反复冻融3次，在酶标仪上进行标准品和样品的吸光度值检测，绘制标准曲线，根据曲线方程计算每个样品中每枚成熟卵母细胞的谷胱甘肽的含量(详见表2)。
[0037]4、体外受精胚胎发育检测
[0038](I)成熟33h卵母细胞体外受精前的准备
[0039]将体外成熟培养33h的卵母细胞移入预先平衡的受精液(38.5°C、5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱)中洗涤3次，然后移入预平衡的60mm培养皿中的50 μ L受精液微滴中，置入38.5°C、5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中等待体外受精，每个受精滴放入30枚成熟卵母细胞。
[0040](2)精子的准备
[0041]从猪场采取新鲜精液，在实验室用精液稀释粉进行稀释，取出ImL精液于39°C烘箱孵育20min,离心(2000r/min, 4min)弃上清，用含0.1%BSA的DPBS悬浮，重复离心，悬浮I次。然后利用细胞计数板进行计数，并利用受精液调整精子浓度为3 X 106个/mL。
[0042](3)体外受精
[0043]取10 μ L浓度为3 X 106个/mL的精子悬液加入到50 μ L受精滴中，将成熟卵母细胞与精子在38.5°C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中共孵育6h。[0044](4)体外受精胚胎体外培养及检测
[0045]将成熟的卵母细胞与精子共培养6h后从受精滴中挑出，然后用欲平衡的胚胎培养液将受精卵洗涤3遍，转到预平衡的胚胎培养液滴中，每滴500 μ L移入50枚受精卵，置于38.5°C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。
[0046]体外受精胚胎原核形成检测:取受精后培养12h的胚胎，用蛋白酶K去除透明带，经过 4% 多聚甲醛固定 40min，0.l%Triton_100 透膜 2h，用 10 μ g/mL Hoechst33342 避光染色IOmin,封片固定,在突光显微镜下观察原核形成,如图4C (注:A_C (400X)),并进行统计(详见表3)。
[0047]体外受精胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数检测:胚胎培养48h检查卵裂率，156h检查囊胚率(如图5A，注:A-D (IOOX ))，并用蛋白酶K去除囊胚透明带，经过4%多聚甲醛固定 40min,0.l%Triton_100 透膜 2h,用 10 μ g/mL Hoechst33342 避光染色 IOmin,封片固定，在荧光显微镜下统计囊胚细胞数(详见表4)。
[0048]实施例2卵母细胞成熟培养36h对体外受精胚胎发育的影响
[0049]1、卵母细胞体外成熟培养
[0050]卵母细胞体外成熟培养方法参见实施例1
[0051]2、卵母细胞体外成熟过程中极体排放检测
[0052]卵母细胞体外成熟培养36h极体排放检测方法参见实施例1，如图2B和2F所示。
[0053]3、成熟卵母细胞中·谷胱甘肽含量检测
[0054]卵母细胞成熟培养36h谷胱甘肽含量检测方法参见实施例1，如图3B、表1和表2所示。
[0055]4、体外受精胚胎发育检测
[0056](I)成熟36h卵母细胞体外受精前的准备
[0057]体外成熟培养36h卵母细胞的准备参见实施例1。
[0058](2)精子的准备
[0059]精子的准备参见实施例1。
[0060](3)体外受精
[0061]体外受精参见实施例1。
[0062](4)体外受精胚胎体外培养及检测
[0063]体外受精胚胎体外培养及检测方法参见实施例1，原核检测如图4C所示，囊胚如5B所示，并进行统计(详见表3和表4)。
[0064]实施例3卵母细胞成熟培养39h对体外受精胚胎发育的影响
[0065]1、卵母细胞体外成熟培养
[0066]卵母细胞体外成熟培养方法参见实施例1
[0067]2、卵母细胞体外成熟过程中极体排放检测
[0068]卵母细胞体外成熟培养39h极体排放检测方法参见实施例1，如图2C和2G所示。
[0069]3、成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量检测
[0070]卵母细胞成熟培养39h谷胱甘肽含量检测方法参见实施例1，如图3C、表1和表2所示。
[0071 ] 4、体外受精胚胎发育检测[0072](I)成熟39h卵母细胞体外受精前的准备
[0073]体外成熟培养39h卵母细胞的准备参见实施例1。
[0074](2)精子的准备
[0075]精子的准备参见实施例1。
[0076](3)体外受精
[0077]体外受精参见实施例1。
[0078](4)体外受精胚胎体外培养及检测
[0079]体外受精胚胎体外培养及检测方法参见实施例1，原核检测如图4C所示，囊胚如图5C所示，并进行统计(详见表3和表4)。
[0080]实施例4卵母细胞成熟培养42h对体外受精胚胎发育的影响
[0081]1、卵母细胞体外成熟培养
[0082]卵母细胞体外成熟培养方法参见实施例1
[0083]2、卵母细胞体外成熟过程中极体排放检测
[0084]卵母细胞体外成熟培养42h极体排放检测方法参见实施例1，如图2D和2H所示。
[0085]3、成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量检测
·[0086]卵母细胞成熟培养42h谷胱甘肽含量检测方法参见实施例1，如图3C、表1和表2所示。
[0087]4、体外受精胚胎发育检测
[0088](I)成熟42h卵母细胞体外受精前的准备
[0089]体外成熟培养42h卵母细胞的准备参见实施例1。
[0090](2)精子的准备
[0091]精子的准备参见实施例1。
[0092](3)体外受精
[0093]体外受精参见实施例1。
[0094](4)体外受精胚胎体外培养及检测
[0095]体外受精胚胎体外培养及检测方法参见实施例1，原核检测如图4C所示，囊胚如图5D所示，并进行统计(详见表3和表4)。
[0096]表1成熟卵母细胞谷胱甘肽含量检测
【权利要求】
1.一种提高体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，步骤如下: 1)确定卵母细胞成熟培养时间范围； 2)检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将卵母细胞体外成熟培养至谷胱甘肽含量下降前进行体外受精。
2.一种提高体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，步骤如下: 1)确定猪卵母细胞成熟培养时间范围； 2)检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将猪卵母细胞体外成熟培养至谷胱甘肽含量下降前进行体外受精。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述确定猪卵母细胞成熟培养时间范围具体步骤:测定猪卵母细胞体外成熟过程中极体排出的比例。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)在猪卵母细胞体外成熟液中培养具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞； 2)通过检测猪卵母细胞体外成熟过程中极体排放比例，确定猪卵母细胞成熟培养时间为 33-42h ； 3)通过检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将猪卵母细胞体外成熟培养至33-39h后进行体外受精。
5.根据 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)在猪卵母细胞体外成熟液中培养具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞； 2)通过检测猪卵母细胞体外成熟过程中极体排放比例，确定猪卵母细胞成熟培养时间为 33-42h ； 3)通过检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将猪卵母细胞体外成熟培养至33-36h后进行体外受精。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)在猪卵母细胞体外成熟液中培养具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞； 2)通过检测猪卵母细胞体外成熟过程中极体排放比例，确定猪卵母细胞成熟培养时间为 33-42h ； 3)通过检测猪成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量，将猪卵母细胞体外成熟培养至33h后进行体外受精。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养步骤为:收集卵巢，抽取直径为3-5_的有腔卵泡，在洗卵液中洗涤，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞，然后在成熟液中洗涤，将洗净的卵母细胞移入卵母细胞体外成熟培养滴中，每滴放入40-50枚卵细胞，最后置入饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养步骤为:收集卵巢并在37°C的生理盐水中，抽取直径为3-5_的有腔卵泡，在洗卵液中洗涤3次，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞，然后在成熟液中洗涤3次，将洗净的卵母细胞移入500 μ L卵母细胞体外成熟培养滴中，每滴放入40-50枚卵细胞，最后置入培养的条件为38.5°C，5%C02，饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述体外受精步骤如下: (I)成熟卵母细胞体外受精前的准备将体外成熟培养卵母细胞移入预先平衡的受精液中洗涤，然后移入预平衡的受精液微滴中，置入二氧化碳培养箱中等待体外受精，每个受精滴放入成熟卵母细胞； (2)精子的准备 采取新鲜精液，用精液稀释粉进行稀释，取出精液于烘箱孵育，离心弃上清，用含BSA的DPBS悬浮，重复离心，悬浮，然后利用细胞计数板进行计数，并利用受精液调整精子浓度； (3)体外受精 取精子悬液加入到受精滴中，将成熟卵母细胞与精子在二氧化碳培养箱中共孵育； (4)体外受精胚胎体外培养及检测 将成熟的卵母细胞与精子共培养后从受精滴中挑出，然后用欲平衡的胚胎培养液将受精卵洗涤，转到预平衡的胚胎培养液滴中，移入受精卵，置于二氧化碳培养箱中培养。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述体外受精具体步骤如下: (1)成熟卵母细胞体外受精前的准备 将体外成熟培养的卵母细胞移入预先平衡的受精液中洗涤3次，然后移入预平衡的60mm培养皿中的50 μ L受精液微滴中，置入38.5°C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中等待体外受精，每个受精滴放入30枚成熟卵母细胞； (2)精子的准备 从猪场采取新鲜精液，在实验室用精液稀释粉进行稀释，取出1mL精液于39°C烘箱孵育20min，离心弃上清，用含0.1%BSA的DPBS悬浮，重复离心，悬浮1次，然后利用细胞计数板进行计数，并利用受精液调整精子浓度为3 X 106个/mL ； (3)体外受精 取10 μ L浓度为3 X 106个/mL的精子悬液加入到50 μ L受精滴中，将成熟卵母细胞与精子在38.5°C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中共孵育6h ； (4)体外受精胚胎体外培养及检测 将成熟的卵母细胞与精子共培养6h后从受精滴中挑出，然后用欲平衡的胚胎培养液将受精卵洗涤3遍，转到预平衡的胚胎培养液滴中，每滴500 μ L移入50枚受精卵，置于.38.5°C，5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。
【文档编号】C12N5/075GK103589682SQ201310608158
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】郇延军, 孔庆然, 刘忠华, 朱江, 吕明 申请人:东北农业大学