磁性固定化磷脂酶A₁的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A₁精炼毛油的方法

专利名称：磁性固定化磷脂酶A₁的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A₁精炼毛油的方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化磷脂酶A1的制备方法及用固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。
背景技术：
固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的 不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等 优点。固定化酶在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学领域广泛应用。使用现有方法 制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收困难，活力回收率低(一股为40% 60%)的 问题。植物油脂中的胶质主要是磷脂混合物，脱胶是植物油精炼中非常重要的工序，脱 胶效果好坏将直接影响精炼效率和产品质量；若脱胶不完全，则会加重脱色负担，影响油脂 质量和精炼经济效益。植物油磷脂可分为水化磷脂和非水化磷脂，水化磷脂具有亲水性，可 通过水化方法脱除，而非水化磷脂具有明显的疏水性，在水化脱胶中较难与水结合，其存在 会给油脂精炼带来很多麻烦。现已提出用游离酶法水解脱除非水化磷脂，但在实际生产中发现游离磷脂酶对反 应环境敏感，易变性失活，反应条件不易控制。因此将酶进行固定化，可提高它的稳定性和 利用效率。目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的报道。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收 复杂，活力回收率低，及目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的问题，而提供一种磁性 固定化磷脂酶A1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。本发明的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行一、制备狗304纳 米粒子；二、制备F%04/Si0x复合粒子；三、制备i^e304/Si0x-APTS载体；四、制备磁性狗304/ SiOx-g-P (GMA)复合粒子；五、将磁性!^e3CVSiOx-g-P (GMA)复合粒子加入到0. lmol/L且pH 值为7 7. 2的磷酸缓冲液中浸泡M ^h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂 酶A1加入0. lmol/L且pH值为5. 5 9. 5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0. 2 %的磷脂 酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12 88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10 50°C下用磁力搅拌器搅拌2 9h，搅拌速度为10 12r/min，然后进行磁分离，用0. Imol/ L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液冲洗2 3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1 ；其中步骤 五中每克磁性i^O/SiOx-g-P (GMA)复合粒子加入到48 50mL磷酸缓冲液中。利用上述的磁性固定化磷脂酶~精炼毛油的方法，按以下步骤进行一、使用水化 脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水 浴加热至70 90°C，加入质量浓度为40% 50%的柠檬酸溶液，混勻，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0. 2 %，在搅拌速度为400 600r/min的条件下反应 10 30min ；二、然后冷却至30 70°C，加入质量浓度为3% 5% NaOH溶液调节pH值至 3 9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 04 0. 16g的磁性 固定化磷脂酶A1,于搅拌速度为40 120r/min下反应1 他，用磁铁将磁性固定化磷脂 酶~与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。本发明的优点1、本发明的方法合成了磁性高分子微球载体，赋予了固定化磷脂酶A1较强的磁场 响应性，从而可以借助外部磁场从反应体系中快速简便地富集、分离和回收固定化磷脂酶 A1，可有效地提高酶的活力回收率，使回收率达到85%以上，进而提高酶的使用效率；2、磁性固定化磷脂酶A1在50°C下反应120分钟后，固定化磷脂酶A1的活力保留 值为初始活力的80% 85% ；经过6次使用后固定化磷脂酶A1的活力保留值为初始活力 的83% 85%，固定化磷脂酶A1的热稳定性和重复使用性都有所提高；3、将磁性固定化磷脂酶A1用于精炼毛油，使磷含量降到7 10mg/kg ；4、重复脱胶4次以后，磁性固定化磷脂酶A1的活力仍保留80% 85%，提高了酶 的重复利用性，降低了生产成本；5、可以利用外部磁场控制磁性固定化磷脂酶A1的运动，从而代替传统的机械搅拌 方式，提高磁性固定化磷脂酶A1的催化效率，适合大规模连续化操作。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一、本实施方式的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进 行一、制备1 纳米粒子；二、制备Fi5304/Si0x复合粒子；三、制备!^e3CVSiOx-APTS载体； 四、制备磁性i^O/SiOx-g-PteMA)复合粒子；五、将磁性i^O/SiOx-g-P (GMA)复合粒子加 入到0. lmol/L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液中浸泡M ^h，然后进行磁分离，得浸泡 后的载体；六、将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值为5. 5 9. 5的磷酸缓冲液中，制成质量 浓度为0. 2%的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12 88mL磷脂酶A1磷 酸缓冲液中，在10 50°C下用磁力搅拌器搅拌2 9h，搅拌速度为10 12r/min，然后进 行磁分离，用0. lmol/L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液冲洗2 3次，即得到磁性固定化 磷脂酶A1 ；其中步骤五中每克磁性i^CVSiOfg-P (GMA)复合粒子加入到48 50mL磷酸缓 冲液中。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中制备!^e3O4纳 米粒子的具体方法为a、将lmol/L的!^Cl2溶液和1. 75mol/L的!^Cl3溶液混合，使!^e2+与 1 3+的摩尔比为1 1.5，在氮气保护下，于水浴60°C搅拌，搅拌速度为10 40r/min，同时 滴加质量浓度为25% 的氨水调节pH值至10，然后升温至80°C保持lh，之后冷却至 室温，得产物A ；b、用永久磁体将产物A分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，于室温下真 空干燥Mh，即得到!^e3O4纳米粒子。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中制备!^e3O4/ SiOx复合粒子的具体方法为a、称取2gFe304纳米粒子，加入160mL乙醇、40mL水和5mL质量浓度为25%的氨水，用20 40KHz的超声波分散Ih后，进行搅拌，搅拌速度为10 50r/ min,同时滴加10 50mL的正硅酸乙酯，反应1 后，得产物B ；b、用永久磁体将产物B分 离出来，用蒸馏水洗至PH值为中性，然后用lmol/L的盐酸将产物B覆盖，浸泡12h，磁分离 后，用蒸馏水洗至PH值为中性，室温下真空干燥Mh，即得到i^304/Si0x复合粒子。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中制备!^e3O4/ SiOx-APTS载体的具体方法为a、称取Ig !^3CVSiOx复合粒子，加入60mL无水乙醇，用20 40KHz的超声波分散lh，加入6mLNH3 ·Η20，再用超声波分散lOmin，在氮气保护下，于搅拌速 度为20r/min的条件下滴加4mL γ -氨丙基三乙氧基硅烷，在水浴50°C条件下保持8h，自 然冷却至室温，得产物C ；b、用永久磁体将产物C分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，再 用无水乙醇洗涤3次，每次lOmin，于室温下真空干燥Mh，得到i^e304/SiOx-APTS载体。其 它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中制备磁性 Fe304/Si0x-g-P(GMA)复合粒子的具体方法为化、称取2.(^ i^304/SiOx-APTS载体，加入 30mL 二甲基甲酰胺中，用20 40KHz的超声波分散lh，向其中加入5 20mL的三乙胺，在 冰浴冷却下向其中滴加含有3mL氯乙酰氯的二甲基甲酰胺溶液5mL，滴加时间不超过0. 5h ；
b、加热回流，反应10h，然后用无水乙醇于20KHz超声波下洗涤，真空干燥至恒重，得产物D；
c、称取0.5g产物D，加入20mL二甲基甲酰胺溶液，二甲基甲酰胺与水的体积比为1 1， 用20 40KHz的超声分散30min，通入氮气0.证，然后加入50mL甲基丙烯酸缩水甘油酯、 ImL联吡啶、0. 5gCuCl和0. IgCuCl2,室温下搅拌，反应12h，得产物E ；d、用永久磁体将产物 E从溶液中分离，并用丙酮抽提48h，最后将产物E于室温下真空干燥Mh，得到磁性!^e3O4/ SiOx-g-P(GMA)复合粒子。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤六中将 磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值为7 8的磷酸缓冲液中。其它与具体实施方式
一至五 之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤六中将 浸泡后的载体加入到25 62. 5mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中。其它与具体实施方式
一至六 之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤六中在 20 40°C下用磁力搅拌器搅拌4 几。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九、本实施方式的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进 行一、制备1 纳米粒子；二、制备Fi5304/Si0x复合粒子；三、制备!^e3CVSiOx-APTS载体； 四、制备磁性i^O/SiOx-g-PteMA)复合粒子；五、将Ig磁性i^e304/Si0x-g-P(GMA)复合粒子 加入到50mL的0. lmol/L且pH值为7的磷酸缓冲液中浸泡Mh，然后进行磁分离，得浸泡后 的载体；六、将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值7的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0. 2% 的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到62. 5mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在 30°C下用磁力搅拌器搅拌5h，搅拌速度为lOr/min，然后进行磁分离，用0. lmol/L且pH值 为7的磷酸缓冲液冲洗3次，即得到磁性固定化磷脂酶A10本实施方式制得的磁性固定化磷脂酶A1的酶蛋白负载量为98. 4mg/g固定化酶，磁性i^O/SiOx-g-P (GMA)复合载体的粒径为90 lOOnm，其比饱和磁化强度为19. 6emu/g 载体，无剩余磁和矫顽力。
具体实施方式
十本实施方式用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步 骤进行一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水 化磷脂的毛油进行水浴加热至70 90°C，加入质量浓度为40% 50%的柠檬酸溶液，混 勻，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0. 2 %，在搅拌速度为400 600r/min的条件下反应10 30min ；二、然后冷却至30 70°C，加入质量浓度为3% 5% NaOH溶液调节pH值至3 9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加 入0. 04 0. 16g的磁性固定化磷脂酶A1,于搅拌速度为40 120r/min下反应1 乩，用 磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
十不同的是步骤一中将除去水 化磷脂的毛油进行水浴加热至80°C。其它与具体实施方式
十相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
十或十一不同的是步骤一中加 入质量浓度为45%的柠檬酸溶液。其它与具体实施方式
十或十一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
十至十二之一不同的是步骤一 中柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0. 1%。其它与具体实施方式
十至十二 之一相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
十至十三之一不同的是步骤一 中柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.5% 1.5%。其它与具体实施方式
十至十三之一相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
十至十四之一不同的是步骤一 中在搅拌速度为500r/min的条件下反应20min。其它与具体实施方式
十至十四之一相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
十至十五之一不同的是步骤二 中然后冷却至40 60°C。其它与具体实施方式
十至十五之一相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
十至十六之一不同的是步骤二 中然后冷却至50°C。其它与具体实施方式
十至十六之一相同。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
十至十七之一不同的是步骤二 中加入质量浓度为4% NaOH溶液调节pH值至5 8。其它与具体实施方式
十至十七之一 相同。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
十至十八之一不同的是步骤二 中每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 08 0. 12g的磁性固定化磷脂酶Ap其它与具体实 施方式十至十八之一相同。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
十至十九之一不同的是步骤二 中每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 09 0. Ilg的磁性固定化磷脂酶A10其它与具体实 施方式十至十九之一相同。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
十至二十之一之一不同的是 步骤二中于搅拌速度为60 lOOr/min下反应2 证。其它与具体实施方式
十至二十之一 相同。
具体实施方式
二十二 本实施方式与具体实施方式
十至二十一之一不同的是步骤二中于搅拌速度为70 90r/min下反应3 4h。其它与具体实施方式
十至二i^一之一 相同。
具体实施方式
二十三本实施方式用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按 以下步骤进行一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将 300g除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至80°C，加入0. 36mL质量浓度为50%的柠檬酸溶 液，混勻，在搅拌速度为500r/min的条件下反应20min ；二、然后冷却至50°C，加入质量浓度 为4% NaOH溶液调节pH值至6，再加入0. 03g磁性固定化磷脂酶A1,于搅拌速度为60r/min 下反应4h，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。本实施方式制备的脱胶油中磷含量降到8mg/kg，磁性固定化磷脂酶A1的活力回收 率达到90%，重复使用4次以后，磁性固定化磷脂酶A1的活力仍保留85%。
权利要求
1.磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于磁性固定化磷脂酶A1的制备方 法，按以下步骤进行一、制备狗304纳米粒子；二、制备狗丛/^丨仏复合粒子；三、制备 Fe304/SIOx-APTS载体；四、制备磁性Fe304/Si0x-g-P (GMA)复合粒子；五、将磁性Fe3O4/ SiOx-g-P (GMA)复合粒子加入到0. lmol/L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液中浸泡M 26h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0. lmol/L且pH值为5. 5 9. 5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0. 2%的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体 加入到12 88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10 50°C下用磁力搅拌器搅拌2 9h，搅 拌速度为10 12r/min，然后进行磁分离，用0. lmol/L且pH值为7 7. 2的磷酸缓冲液冲 洗2 3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1 ；其中步骤五中每克磁性i^304/Si0x-g-P (GMA)复 合粒子加入到48 50mL磷酸缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤一中制备 Fe3O4纳米粒子的具体方法为a、将lmol/L的FeCl2溶液和1. 75mol/L的FeCl3溶液混合， 使Fe2+与!^3+的摩尔比为1 1.5，在氮气保护下，于水浴60°C搅拌，搅拌速度为10 40r/ min,同时滴加质量浓度为25% 的氨水调节pH值至10，然后升温至80°C保持lh，之 后冷却至室温，得产物A ;b、用永久磁体将产物A分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，于 室温下真空干燥Mh，即得到!^e3O4纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤二中制 备Fi5304/Si0x复合粒子的具体方法为a、称取2gFe304纳米粒子，加入160mL乙醇、40mL水 和5mL质量浓度为25%的氨水，用20 40KHz的超声波分散Ih后，进行搅拌，搅拌速度为 10 50r/min，同时滴加10 50mL的正硅酸乙酯，反应1 后，得产物B ;b、用永久磁体将 产物B分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，然后用lmol/L的盐酸将产物B覆盖，浸泡12h， 磁分离后，用蒸馏水洗至PH值为中性，室温下真空干燥Mh，即得到i^304/Si0x复合粒子。
4.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤三中制备 Fe304/Si0x-APTS载体的具体方法为a、称取Ig Fe304/Si0x复合粒子，加入60mL无水乙醇， 用20 40KHz的超声波分散lh，加入6mLNH3 · H2O,再用超声波分散lOmin，在氮气保护下， 于搅拌速度为20r/min的条件下滴加4mL γ -氨丙基三乙氧基硅烷，在水浴50°C条件下保 持8h，自然冷却至室温，得产物C ；b、用永久磁体将产物C分离出来，用蒸馏水洗至pH值为 中性，再用无水乙醇洗涤3次，每次lOmin，于室温下真空干燥Mh，得到i^e304/SiOx-APTS载 体。
5.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤四中制 备磁性i^CVSiOx-g-P (GMA)复合粒子的具体方法为化、称取2.(^ i^304/SiOx-APTS载体， 加入30mL 二甲基甲酰胺中，用20 40KHz的超声波分散lh，向其中加入5 20mL的三乙 胺，在冰浴冷却下向其中滴加含有3mL氯乙酰氯的二甲基甲酰胺溶液5mL，滴加时间不超过 0. 5h ；b、加热回流，反应10h，然后用无水乙醇于20KHz超声波下洗涤，真空干燥至恒重，得 产物D;c、称取0. 5g产物D，加入20mL 二甲基甲酰胺溶液，二甲基甲酰胺与水的体积比为 1 1，用20 40KHz的超声分散30min，通入氮气0.证，然后加入50mL甲基丙烯酸缩水甘 油酯、ImL联吡啶、0. 5gCuCl和0. IgCuCl2,室温下搅拌，反应12h，得产物E ；d、用永久磁体 将产物E从溶液中分离，并用丙酮抽提48h，最后将产物E于室温下真空干燥Mh，得到磁性 Fe304/Si0x-g-P (GMA)复合粒子。
6.利用权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于用磁性固 定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷 脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至70 90°C，加入质 量浓度为40% 50%的柠檬酸溶液，混勻，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量 的0. 2%，在搅拌速度为400 600r/min的条件下反应10 30min ；二、然后冷却至 30 70°C，加入质量浓度为3% 5% NaOH溶液调节pH值至3 9，再加入磁性固定化磷 脂酶A1,每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 04 0. 16g的磁性固定化磷脂酶A1,于搅拌速 度为40 120r/min下反应1 他，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油 分离，即得到脱胶油。
7.根据权利要求6所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤二 中然后冷却至40 60°C。
8.根据权利要求6或7所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步 骤二中加入质量浓度为4% NaOH溶液调节pH值至5 8。
9.根据权利要求8所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤二 中每千克除去水化磷脂的毛油加入0. 08 0. 12g的磁性固定化磷脂酶A10
10.根据权利要求9所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤 二中于搅拌速度为60 100r/min下反应2 5h。
全文摘要
磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，涉及一种固定化磷脂酶A1的制备方法及用固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。本发明为了解决现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收复杂，活力回收率低，及目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的问题。制备及精炼毛油的方法一、制备磁性固定化磷脂酶A1；二、将毛油加热，加入柠檬酸溶液；三、冷却，调节pH值，再加入磁性固定化磷脂酶A1，搅拌，分离磁性固定化磷脂酶A1，即完成磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及精炼毛油的方法。本发明制备的磁性固定化磷脂酶A1的回收率达到85％以上，使毛油的磷含量降到7～10mg/kg。应用于油脂脱胶领域。
文档编号C12P7/64GK102061293SQ20101053822
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者于坤弘, 于殿宇, 刘晶, 周晓丹, 孙博, 常云鹤, 朱秀清, 江连洲, 王妍, 王玉, 王立琦, 陈晓慧 申请人:东北农业大学