人cd3+cd8+cik细胞的制备方法
【专利摘要】本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法。本发明包括如下步骤：(1)采集外周静脉血并分离外周血单个核细胞；(2)将细胞重悬于含10％自体血浆的无血清培养基中，并加入终浓度为1000IU/ml的IFN-γ；(3)培养24小时后加入抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-1α、IL-2，48小时后加入卡介苗；(4)以后每2～3天补加含有IL-2的新鲜培养基，培养21天。通过本发明所制备的人CD3+CD8+CIK细胞，其应用主要为癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。本发明的优点是总细胞扩增效率在21天是现有技术的2倍左右；更为重要的是，本发明扩增的CD3+CD8+T淋巴细胞较现有技术数量明显提高，从先现有技术CIK细胞比例的60％提高到90％左右，而且其杀瘤活性明显提高。
【专利说明】人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种人⑶3+⑶8+CIK细胞的制备方法。【背景技术】
[0002]细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年报的从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中诱导出的一群异质性细胞。其主要效应细胞因同时表达⑶3+和⑶56+两种膜蛋白分子，因此又被称为NK细胞样T淋巴细胞(NKT细胞)。体内外的实验研究表明，CIK细胞具有杀瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及杀瘤效应不受癌细胞多重耐药的影响等优势。经典的同时也是目前最常用的CIK细胞培养方法是IFN-Y、抗⑶3单抗、IL-1a与IL-2共同培养产生的CIK细胞，其具体步骤为:将外周血分离的PBMCs用含10%的FCS的RPM1-1640培养基悬浮，调整密度为2 X 107ml，培养第O天加入1000U IFNi，24h加入100ng/ml的抗CD3单抗、100U IL-1a与300U IL-2，每3天补加300U IL-2及新鲜培养基，控制细胞密度为I~2 X 106/ml，连续培养21天，其主要效应细胞——NKT细胞，扩增约1000倍，含量占细胞群体的14%左右。上述经典的方案却存在以下问题= (I)CIK细胞中绝大部分群体为⑶3+⑶8+T淋巴细胞，大约占CIK细胞的60%左右，然而其杀瘤活性却受到极大的限制；这与目前的Q)3+0)8+T淋巴细胞,也即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗肿瘤的主要免疫效应细胞的认识存在差异。(2)虽然主要效应细胞——NKT细胞，扩增1000倍左右，但整体细胞群体扩增能力较为有限，大约80~100倍左右。目前虽然有很多改进的方案，但是这两个根本的问题依然没有很好的解决。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人⑶3+⑶8+CIK细胞的制备方法及其应用，在保证原有CIK细胞主要效应细胞——NKT细胞杀瘤活性和增值能力不降低的
情况下，使CIK细胞群体中的主要群体-CD3+CD8+T淋巴细胞的杀瘤活性和增值能力均
得到极大的提高，实现CIK细胞更加充分的发挥杀瘤效应。
[0004]本发明所提供的人⑶3+⑶8+CIK细胞，是指以⑶3+⑶8+T淋巴细胞为主效应细胞，在CIK细胞异质性群体中约90%，NKT细胞为次效应细胞，在CIK细胞异质性群体中约23%，其中本发明所制备的人⑶3+⑶8+CIK细胞的主要效应细胞⑶3+⑶8+T，其细胞毒活性与NKT细胞相当。其中，CD3+CD8+T淋巴细胞其表面标记为:人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人α β TCR受体；ΝΚΤ细胞表面标记为:人白细胞分化抗原CD56和人α β TCR受体。本发明所制备的人⑶3+⑶8+CIK细胞主要应用于癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。
[0005]本文中的“⑶3+⑶8+CIK细胞”表示CD3和⑶8均为阳性的CIK细胞。
[0006]为实现上述目的，本发明通过在经典的CIK细胞培养方案的基础上添加新的细胞因子及非特异性免疫刺激剂，开发出更加有效的CD3+CD8+CIK细胞制备方法。设计人⑶3+⑶8+CIK细胞的制备方法，包括如下步骤:
[0007](I)采集外周静脉血，获取单核细胞。
[0008](2)将上述PBMCs重悬于含10%自体灭活血浆的商品化无血清培养基中，例如PAA?或者GT-T551?等，调整细胞密度(1-3) X 106/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度500-1500IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养。
[0009](3)培养20-28小时后加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗、IL_1 α、IL-2中的一种或者几种，40-50小时后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)连续培养14~21天，其中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(I~
2)XlOVmlo
[0010]作为优选，步骤(1)具体为采集外周静脉血，然后用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得PBMCs。
[0011]作为优选，所述步骤(2)中调整细胞密度为2X106/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度 1000IU/ml。
[0012]进一步地,所述步骤(3)所加入的抗⑶3单抗浓度为50~500ng/ml,抗⑶28单抗的浓度为50~500ng/ml，IL-1 α的浓度为0.5~5ng/ml，IL-2的浓度为50~1000IU/ml ο
[0013]进一步优选地，所述抗⑶3单抗浓度为100ng/ml。
[0014]进一步优选地,所述抗0)28单抗的浓度为200ng/ml。
`[0015]进一步优选地,所述IL-1 α的浓度为lng/ml。
[0016]进一步优选地，所述IL-2的浓度为1000IU/ml。
[0017]进一步地，所述步骤(3)所加入的BCG的浓度为5~20 μ g/ml。
[0018]进一步优选地,所述BCG的浓度为10 μ g/ml。
[0019]进一步地，所述步骤(3)中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基时，IL_2的浓度为 50 ~1000IU/ml。
[0020]进一步优选地，所述IL-2的浓度为1000IU/ml。
[0021 ] 本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
[0022]与现有CIK细胞培养方法相比，本发明的优势体现在以下几方面:本发明所制备的⑶3+⑶8+CIK细胞，总细胞扩增效率在21天是现有技术的2倍左右。其中NKT细胞扩增的效率和杀瘤活性与现有技术相比无明显降低；更为重要的是，本发明扩增的CD3+CD8+T淋巴细胞较现有技术数量明显提高，从先现有技术CIK细胞比例的60%提高到90%左右，而且其杀瘤活性明显提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]1.图1不同培养方式培养的外周血来源PBMCs生长曲线(n=8);外周血来源的PBMCs。通过不同方式培养，在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，将当前细胞总数除以开始培养时(第O天)的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数。CIK组:指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞KD3⑶8CIK组:指本发明采用的培养方法。[0024]2.图2采用流式细胞仪进行免疫表型检测(n=8)。外周血来源的PBMCs，通过不同方式培养，在第14天取细胞进行流式荧光抗体:抗⑶3-FITC、⑶4-PE、⑶8-PECY5.5、CD56-APC进行表面染色并检测。CIK组:指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；⑶3⑶8CIK组:指本发明采用的培养方法。
[0025]3.图3采用CCK-8细胞毒活性检测试剂盒对不同培养方式培养的外周血来源PBMCs进行细胞毒性检测。通过不同方式培养，在第14天取细胞通过CCK-8试剂盒进行细胞毒活性检测。CIK组:指采用经典最常用的培养法培养的CIK细胞KD3⑶8CIK组:指本发明采用的培养方法KD3⑶8T组:培养13天的⑶3+⑶8+CIK细胞，首先对⑶3+细胞进行流式分选，然后通过抗CD8流式荧光抗体进行分选，所获得的细胞则为CD3+CD8+T淋巴细胞；NKT组:培养13天的⑶3+⑶8+CIK细胞，首先对⑶3+细胞进行流式分选，然后通过抗⑶56流式荧光抗体进行分选，所获得的细胞则为NKT淋巴细胞。横坐标:E:T=10:1表示效应细胞与靶细胞的比值为10:1，E:T=20:1表示效应细胞与靶细胞的比值为20:1，E:T=40:1表示效应细胞与靶细胞的比值为40:1。
【具体实施方式】
[0026]下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
[0027]实施例1
[0028]本实施例1是分离获得的PBMCs并进行⑶3+⑶8+CIK细胞的培养。包括以下步骤:
[0029]1.采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为:1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到PBMCs。
[0030]2.将上述PBMCs重悬于含10%自体灭活血浆的PAA?或者GT-T551TM等商品化无血清培养基中，调整细胞密度2 X 106/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度1000IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养。
[0031]3.培养24小时后加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗、IL-1 α、IL-2,48小时后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)连续培养14~21天，其中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在I~2X 106/ml。其中24小时后所使用的抗CD3单抗浓度为100ng/ml，抗CD28单抗的浓度为200ng/ml，IL-1 α的浓度为Ing/ml，IL-2的浓度为1000IU/ml ；48小时后加入BCG的浓度为10 μ g/m ;每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基时，IL-2的浓度为1000IU/ml。
[0032]实施例2
[0033]本实施例2是对⑶3+⑶8+CIK细胞进行形态学和增值能力检测。包括以下步骤:
[0034]1.细胞培养24小时即可见⑶3+⑶8+CIK细胞沉于培养瓶的底部，仍呈单细胞状态，48小时趋于集落化，培养3天后就可以看到大的集落和不规则的单个核细胞。对培养12~14天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见I个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养12~14天的细胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。本发明制备的细胞活力大于95%。
[0035]2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，
将当前细胞总数除以开始培养时的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数，以此进行动态观察细胞增殖情况并作为细胞补加新鲜培养基时的参考，细胞扩增倍数见图1、表1。
[0036]表1:不同培养方式培养的外周血来源PBMCs扩增倍数(η=8)
[0037]
【权利要求】
1.人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，采用如下制备步骤: 1)采集外周静脉血，获取单核细胞； 2)将步骤I)获取的单核细胞重悬于含10%自体灭活血浆的商品化无血清培养基中，调整细胞密度(1-3) X 106/ml，并加入IFN-Y至终浓度500-1500IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养； 3)培养20-28小时后加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗、IL-1a、IL-2中的一种或者几种，40-50小时后加入卡介苗连续培养14~21天，制备得到⑶3+⑶8+CIK细胞；其中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(I~2) X106/ml。
2.根据权利要求1所述的人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于:步骤I)具体为采集外周静脉血，然后用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得PBMCs。
3.根据权利要求1或2所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)加入抗CD3单抗浓度为50~500ng/ml，抗CD28单抗的浓度为50~500ng/ml，IL-1 a的浓度为0.5~5ng/ml，IL-2的浓度为50~1000IU/ml ;加入卡介苗的浓度为5~20 μ g/ml ;每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基时，IL-2的浓度为50~1000IU/ml。
4.根据权利要求3所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述抗CD3单抗浓度为100ng/ml。
5.根据权利要求1或2或4所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述抗CD28单抗的浓度为200ng/ml。
6.根据权利要求1或2或4所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述IL-1a的浓度为lng/ml。
7.根据权利要求6所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述IL-2的浓度为 1000IU/ml。
8.根据权利要求1或2或4或7所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述卡介苗的浓度为10 μ g/mL.
9.根据权利要求8所述人CD3+CD8+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中加入 IFN-Y 至终浓度 1000-1200IU/ml。
【文档编号】C12N5/0783GK103642752SQ201310638798
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】马飞, 王宇环, 罗晓玲 申请人:深圳市合一康生物科技有限公司