五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法
【专利摘要】本发明涉及五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法，通过提取样品总RNA，应用一步法RT-PCR扩增样品中不同血清型的轮状病毒RNA，进行血清型的鉴别，其中包括5对寡聚核苷酸引物（SEQ?ID?No.1-10），分别针对五价轮状病毒疫苗中G1血清型、G2血清型、G3血清型、G4血清型和G9血清型抗原扩增得到特异性单一条带PCR产物，产物大小分别为337bp、425bp、326bp、253bp、570bp，无交叉反应。本发明的方法具有灵敏度高、特异性好、快速简便等特点，可以准确检测五价轮状病毒疫苗中抗原血清型并且判断病毒样品中是否存在混杂现象，主要应用于五价轮状病毒疫苗开发过程中毒种纯度的监测。
【专利说明】五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法。
【背景技术】 [0002]轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒的一个属，其基因组包含11个片段的双链RNA (dsRNA)病毒，目前已知轮状病毒可分为7个组(A~G)，其中A轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，全球每年约有45~65万5岁以下儿童死于轮状病毒性腹泻。VP7和VP4是A组轮状病毒外壳的两个蛋白，能刺激宿主机体刺激产生中和抗体，是病毒中和作用相关抗原，准确对其血清型和血清型进行鉴定对于A轮状病毒疫苗研究具有重要意义。根据VP7和VP4的不同，A组RV被分为21个G血清型和35个P血清型，其中至少11个G型和12个P型为人RV0目前，全球有5种RV主要流行株，即GlP [8]、G2P [4]、G3P [8]、G4P[8]、G9P[8]。
[0003]RV初始感染主要引起同型特异抗体反应，再次感染可引起同型和异型交叉抗体反应。由于其特殊的节段性基因组结构，不同株RV在动物、人体内或体外组织培养中共感染时，可发生基因重配。此为发展多价重配疫苗的分子基础。
[0004]人-牛五价重配轮状病毒疫苗分别以编码人轮状病毒5个主要血清型G1、G2、G3、G4和G9作为VP7单基因替换的亲本毒株，其余10个基因都来自牛轮状病毒(UK株)，由此构建了以牛轮状病毒为骨架的五价基因重配疫苗。这些单基因重配体被设计为DXUK (Gl型)、DSl XUK (G2 型)、PXUK (G2 型)、ST3XUK (G4 型)和 AU32XUK (G9 型)，五个单基因重配体联合应用即为涵盖人轮状病毒主要G型(G1、G2、G3、G4和G9型)的五价基因重配减毒疫苗。
[0005]近年来通过多重聚合酶链反应(PCR)技术，即在同一反应体系中加入两种或两种以上引物，通过PCR扩增检测多种目的基因，其扩增的特异性和效率与单一 PCR相当，但同时可扩增针对不同模板的多个靶序列，是一种简便、快速的方法，尤其适合于抗原分型检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法。
[0007]为了实现本发明目的，本发明首先提供用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的引物对，所述引物对选自引物对I~5中的至少一种:
[0008]弓丨物对1:以轮状病毒Gl血清型VP7基因为靶基因的引物对
[0009]上游引物5' -CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC-3'
[0010]下游引物5' -CATATCTAATTCAAGACTTTGG-3'；
[0011]引物对2:以轮状病毒G2血清型VP7基因为靶基因的引物对
[0012]上游引物5' -TAACAGCACCATTTGTAAGG-3'[0013]下游引物5' -ACAAACTTTTACCGTGCAGTC-3'；
[0014]引物对3:以轮状病毒G3血清型VP7基因为靶基因的引物对
[0015]上游引物5' -AGTTATACTGTCACCACTCCTT-3'
[0016]下游引物5' -TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG-3'；
[0017]引物对4:以轮状病毒G4血清型VP7基因为靶基因的引物对
[0018]上游引物5' -ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG-3'
[0019]下游引物5' -TGCCAGTTTTTCGCTATCA-3'；[0020]引物对5:以轮状病毒G9血清型VP7基因为靶基因的引物对
[0021]上游引物5' -CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG-3'
[0022]下游引物5' -TACCACTAAGTTTTCACTTGCG-3'。
[0023]优选地，本发明的用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的引物对为引物对I~5。
[0024]本发明还提供含有上述引物对的用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、RNA逆转录酶、RNase抑制剂、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0025]本发明进一步提供五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法，其是利用上述引物对或试剂盒对待测五价轮状病毒疫苗抗原血清型进行RT-PCR检测。
[0026]所述方法包括以下步骤:1)提取样品中的RNA ;2)以步骤I)中提取的RNA为模板，进行RT-PCR扩增反应；3)分析扩增产物。
[0027]RT-PCR反应体系以50 μ L计为:
[0028]IOx One Step RNA PCR 缓冲液5μΙ
MgCl21()μ?
dNTP混合物5pL
RIStase抑制剂IpL
AMVRTaseXLIpL
AMV-Optimized Taq DNA 聚合晦ΙμΙ
I.游引物IpL
下游引擒IrL
模板RNAI μ￡
不含 RNase _ dH2Q24pL
[0029]RT-PCR反应程序为:50°C反转录15min ;94°C预变性2min ;94°C变性5s，60°C退火30s，72。。延伸40s，共30个循环。
[0030]优选地，以轮状病 毒RNA为模板，同时加入所述5对寡聚核苷酸引物，进行RT-PCR扩增。优选地，所述的寡聚核苷酸引物在PCR反应体系中的摩尔浓度均为5mol/L。
[0031]本发明可以使用TaKaRa —步法RT-PCR试剂盒进行扩增。
[0032]本发明中涉及的五价轮状病毒疫苗来源于分别将人源亲本毒株(D、DS-U P、ST3、AU32)的VP7基因整合到牛源亲本(UK)中而得到的人牛重配毒株。
[0033]本发明针对D、DS-1、P、ST3和AU32的VP7基因设计特异性引物，利用多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，建立了只需一步即可检测轮状病毒样品中G血清型的方法，在疫苗研发过程中可实时监测是否出现混杂现象。
[0034]本发明提供一种鉴别五价轮状病毒疫苗中抗原血清型的方法。通过提取样品总RNA，应用一步法RT-PCR扩增样品中不同血清型的轮状病毒RNA，进行血清型的鉴别，其中包括5对寡聚核苷酸引物(SEQ ID N0.1-10)，分别针对五价轮状病毒疫苗中Gl血清型、G2血清型、G3血清型、G4血清型和G9血清型抗原扩增得到特异性单一条带PCR产物，产物大小分别为337bp、425bp、326bp、253bp、570bp，无交叉反应。本发明的方法具有灵敏度高、特异性好、快速简便等特点，可以准确检测五价轮状病毒疫苗中抗原血清型并且判断病毒样品中是否存在混杂现象，主要应用于五价轮状病毒疫苗开发过程中毒种纯度的监测。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物分别对Gl血清型轮状病毒样品的RT-PCR扩增；其中，1表示Gl血清型鉴别引物；2表示G2血清型鉴别引物；3表示G3血清型鉴别引物；4表示G4血清型鉴别引物；5表示G9血清型鉴别引物。
[0036]图2为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物分别对G2血清型轮状病毒样品的RT-PCR扩增；其中，1表示Gl血清型鉴别引物；2表示G2血清型鉴别引物；3表示G3血清型鉴别引物；4表示G4血清型鉴别引物；5表示G9血清型鉴别引物。
[0037]图3为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物分别对G3血清型轮状病毒样品的RT-PCR扩增；其中，1表示Gl血清型鉴别引物；2表示G2血清型鉴别引物；3表示G3血清型鉴别引物；4表示G4血清型鉴别引物；5表示G9血清型鉴别引物。
[0038]图4为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物分别对G4血清型轮状病毒样品的RT-PCR扩增；其中，1表示Gl血清型鉴别引物；2表示G2血清型鉴别引物；3表示G3血清型鉴别引物；4表示G4血清型鉴别引物；5表示G9血清型鉴别引物。
[0039]图5为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物分别对G9血清型轮状病毒样品的RT-PCR扩增；其中，1表示Gl血清型鉴别引物；2表示G2血清型鉴别引物；3表示G3血清型鉴别引物；4表示G4血清型鉴别引物；5表示G9血清型鉴别引物。
[0040]图6为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物对五价轮状病毒疫苗中Gl血清型、G2血清型、G3血清型、G4血清型和G9血清型抗原扩增的结果；其中，1_5分别表示Gl、G2、G3、G4和G9血清型抗原。
[0041]图7为本发明实施例2中利用5对特异性鉴别引物分别对未接毒正常细胞的RT-PCR扩增；其中，1表示Gl血清型鉴别引物；2表示G2血清型鉴别引物；3表示G3血清型鉴别引物；4表示G4血清型鉴别引物；5表示G9血清型鉴别引物。
【具体实施方式】
[0042]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular clon1ng:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0043]以下实施例中涉及的所有轮状病毒毒株均由美国国立卫生研究院(N1H)提供。
[0044]实施例1用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的引物对的设计
[0045]检索GenBank上的轮状病毒(D株、DS-1株、P株、ST3株、AU32株)VP7基因序列，应用DNASTAR软件进行比对分析，分别找到特异性保守区，以保守区为靶目标，用引物设计软件Pr1mer5.0，设计5对特异性引物)，引物方向均为5’ _3’，具体如下:
[0046](1)以轮状病毒D株(Gl型)VP7基因为靶基因的引物对:
[0047]上游引物(SEQ1D N0.1):CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC
[0048]下游引物(SEQ1D N0.2):CATATCTAATTCAAGACTTTGG
[0049]预计扩增产物长度为337bp ；
[0050](2)以轮状病毒DS-1株(G2型)VP7基因为靶基因的引物对:
[0051]上游引物(SEQ1D N0.3):TAACAGCACCATTTGTAAGG
[0052]下游引物(SEQ1D N0.4):ACAAACTTTTACCGTGCAGTC[0053]预计扩增产物长度为425bp ；
[0054](3)以轮状病毒P株(G3型)VP7基因为靶基因的引物对:
[0055]上游引物(SEQID N0.5):AGTTATACTGTCACCACTCCTT
[0056]下游引物(SEQID N0.6):TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG
[0057]预计扩增产物长度为326bp ；
[0058](4)以轮状病毒ST3株(G4型)VP7基因为靶基因的引物对:
[0059]上游引物(SEQID N0.7):ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG
[0060]下游引物(SEQID N0.8):TGCCAGTTTTTCGCTATCA
[0061]预计扩增产物长度为253bp ；
[0062](5)以轮状病毒AU32株(G9型)VP7基因为靶基因的引物对:
[0063]上游引物(SEQID N0.9):CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG
[0064]下游引物(SEQID N0.10):TACCACTAAGTTTTCACTTGCG
[0065]预计扩增产物长度为570bp。
[0066]实施例2引物对的特异性检测
[0067]1、病毒RNA的提取
[0068]使用Axygen公司的总RNA小量制备试剂盒。按试剂盒说明书，分别从如下病毒样品中提取RNA (以未接种病毒的正常细胞冻融液为阴性对照):G1血清型轮状病毒株(批号:20120821)、G2血清型轮状病毒毒株(批号:20121208)、G3血清型轮状病毒株(批号:20130328)、G4血清型轮状病毒株(批号:20130508)、G9血清型轮状病毒株(批号:20130722)。
[0069]2、单对引物的特异性检测
[0070](1)Gl型鉴别引物的特异性检测
[0071]使用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)，以Gl型鉴别引物分别对步骤一获得的5个血清型轮状病毒的RNA进行一步法RT-PCR扩增，以步骤一获得的正常细胞冻融液的RNA为阴性对照，反应体系和反应程序如下:
[0072]50 μ L反应体系为:
[0073]
【权利要求】
1.用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的引物对，其特征在于，所述引物对选自引物对I~5中的至少一种: 引物对1:以轮状病毒Gl血清型VP7基因为靶基因的引物对 上游引物 5' -CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC-3' 下游引物 5' -CATATCTAATTCAAGACTTTGG-3'； 引物对2:以轮状病毒G2血清型VP7基因为靶基因的引物对 上游引物 5' -TAACAGCACCATTTGTAAGG-3'
下游引物 5' -ACAAACTTTTACCGTGCAGTC-3'； 引物对3:以轮状病毒G3血清型VP7基因为靶基因的引物对 上游引物 5' -AGTTATACTGTCACCACTCCTT-3' 下游引物 5' -TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG-3'； 引物对4:以轮状病毒G4血清型VP7基因为靶基因的引物对 上游引物 5' -ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG-3' 下游引物 5' -TGCCAGTTTTTCGCTATCA-3'； 引物对5:以轮状病毒G9血清型VP7基因为靶基因的引物对 上游引物 5' -CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG-3' 下游引物 5' -TACCACTAAGTTTTCACTTGCG-3'。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对为引物对I~5。
3.含有权利要求1或2所述引物对的用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、RNA逆转录酶、RNase抑制剂、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法，其特征在于，其是利用权利要求1或2所述引物对，或权利要求3-5任一项所述试剂盒对待测五价轮状病毒疫苗抗原血清型进行RT-PCR 检测。
7.根据权利要6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品中的RNA； 2)以步骤I)中提取的RNA为模板，进行RT-PCR扩增反应； 3)分析扩增产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，RT-PCR反应体系以50μ L计为:IOx One Step RNA PCR 缓冲液5p.L
MgCI2_L
dNTP混合物5fiL
RNase抑制劍IpL
AMYRTaseXLΙμ? AMV-Optimized Taq DNA 聚合酶Iμ?
上游引物IpL
下游引物Ιμ?
模板RNAIgL不含 RNase 的 dH2024μU`
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，RT-PCR反应程序为:50°C反转录15min ；94°C预变性2min ;94°C变性5s，60°C`退火30s，72°C延伸40s，共30个循环。
【文档编号】C12N15/11GK103642940SQ201310646174
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】宋菲菲, 付作申, 郝洪吉, 张艳红, 陈旭, 张晓雪 申请人:北京民海生物科技有限公司