成肌细胞分化促进剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及选自下列的肽：Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro，Leu-Hyp，Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala，Hyp-Gly和Pro-Hyp，或其药学可接受的盐，其具有优于常规领域的成肌细胞分化促进效应。
【专利说明】成肌细胞分化促进剂 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及包含肽分子等的成肌细胞分化促进剂。 【【背景技术】】
[0002] 最近，运动器官综合征和少肌症（肌肉量和肌肉强度减小，及身体功能降低）的 预防等受到关注，及需要由肌肉量和肌肉强度的增加改善该症状。对于健康人也需求肌肉 疲乏的预防和肌肉的增强。
[0003] 在肌肉细胞分化的初始过程，未分化的细胞分化为作为肌肉纤维来源的细胞的成 肌细胞。成肌细胞进一步分化，及表达特异于肌肉细胞的蛋白。肌肉细胞的分化中的特征性 现象是细胞融合，即，单核细胞的成肌细胞融合而分化为作为多核细胞的肌管细胞的现象。 而且，通过自成熟的肌管细胞形成具有收缩能力的肌肉纤维的过程而肌肉完成。在成肌细 胞分化期间，产生特征性蛋白诸如原肌球蛋白和肌球蛋白重链，并将这些用作分化标志物 (非-专利文献1)。
[0004] 肽分子已知具有各种药理学效应。例如，专利文献1描述，二肽诸如Hyp-Gly具有 破骨细胞分化抑制效应，碱性磷酸酶抑制效应等。非-专利文献2描述，肽诸如Hyp-Gly-Pro 具有抗氧化效应。专利文献2描述，诸如Pro-Gly和Hyp-Gly(其还在它们的上游区和/或 在它们的下游区具有达10氨基酸）的肽具有刺激骨等的生长，维持和修复的效应。
[0005]专利文献3描述，刺梨（Rosaroxburghii)，大豆肽，C12肽等具有成肌细胞活化效 应。但是，不知道是否这些肽分子具有成肌细胞分化促进效应。
[0006] 非-专利文献3显示，当橄榄球运动员结合锻炼摄取胶原肽和乳清肽的等量混合 物3个月时的肌肉重量变化率。尽管在摄入此等量混合物之后肌肉重量增加（图2)，体重 也增加（图1)，及肌肉，每体重的肌肉重量比率相比开始时更减少。与此相比，在本发明中， 肌肉重量与体重的比显著地增加，如描述于随后-描述的试验例2。
[0007]【现有技术文献】
[0008]【专利文献】
[0009]专利文献I:TO2010/038323
[0010] 专利文献2 :日本特表2006-502971
[0011] 专利文献3 :日本特开2008-156294
[0012] 【非专利文献】
[0013]非专利文献IJ.Biol.Chem.，Vol. 286,No. 4, 41455(2011)
[0014] 非专利文献2 :日本氨基酸学会第5次学术大会（JSAAS2011)要点集，p. 74
[0015]非专利文献 3:FoodStyle21，Vol. 14,No. 7, 62-65(2010) 【
【发明内容】
】
[0016]【发明要解决的技术课题】
[0017] 本发明旨在提供相比以往技术更优良的包含肽分子的成肌细胞分化促进剂。
[0018] 【解决课题的技术方案】
[0019] 经锐意的努力的结果，本发明人发现，肽分子Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp,Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala,Hyp-Gly和Pro-Hyp具有优良的成肌细胞分化促 进效应，由此完成了本发明。特别是，本发明如下。
[0020] [1]成肌细胞分化促进剂，其包含选自下列的肽：Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp,Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala,Hyp-Gly和Pro-Hyp,或其药学可接受的盐。
[0021] [2]根据[1]的成肌细胞分化促进剂，其包含选自下列的肽：Hyp-Gly和Pro-Hyp, 或其药学可接受的盐。
[0022] [3]根据[1]的成肌细胞分化促进剂，其包含选自下列的2种或更多肽： Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro，Leu-Hyp，Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala，Hyp-Gly和 Pro-Hyp,或其药学可接受的盐。
[0023] [4]根据[1]?[3]之任一项的成肌细胞分化促进剂，其中促进剂为下列形式：用 于口服施用的制剂，用于向肌肉直接施用的注射剂，经皮剂，栓剂，滴鼻剂或吸入剂。
[0024] [5]饮料或食品或饲料，其包含选自下列的肽：Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp,Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala,Hyp-Gly和Pro-Hyp,或其药学可接受的盐。
[0025] 【发明效果】
[0026] 本发明可提供相比以往技术更优良的成肌细胞分化促进剂，其包含Ala-Hyp-Gly， Hyp-Gly-Pro，Leu-Hyp，Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala，Hyp-Gly和Pro-Hyp的肤分子。 [0027]【实施方式】
[0028] 以下详细地说明本发明。
[0029] 【1.肽】
[0030] 本发明中使用的肽是Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro,Leu-Hyp,Glu-Hyp, Gly-Pro-Hyp,Pro-Ala,Hyp-Gly和Pro-Hyp,且这些肽可为药学可接受的盐的形式。优选的 肽的例包括Hyp-Gly和Pro-Hyp。
[0031] 〃药学可接受的盐〃的例包括无机酸盐诸如盐酸盐，硫酸盐和磷酸盐，有机酸盐诸 如甲磺酸盐，苯磺酸盐，琥珀酸盐和草酸盐，无机碱式盐诸如钠盐，钾盐和钙盐，及有机碱式 盐诸如三乙基铵盐。
[0032] 本肽可例如，由〃固相合成方法〃和〃液相合成方法"（例如，日本特开 2003-183298)合成。作为固相合成方法，知道Fmoc方法和Boc方法，及本肽可以任何这些 方法合成。以下会具体描述固相合成方法的一例。将表面用氨基修饰的具有约0.1mm的直 径的聚苯乙烯聚合物凝胶珠用作固相，及将二异丙基碳二亚胺用作稠合剂。首先，将C-端 氨基酸的氨基用Fmoc基团或Boc基团保护，并使与上述的聚苯乙烯聚合物凝胶的氨基形成 肽键。将固相用溶剂好好洗净，及除去残留的剂和氨基酸，然后除去与固相结合的氨基酸的 氨基的保护基。随后，由使用保护了氨基的氨基酸依次重复相同的反应，在固相上合成肽。 最后，将固相在三氟乙酸中消化，以将肽自固相分开，由此可合成肽。
[0033] 本肽也可通过用2种或更多种内切蛋白酶和外切蛋白酶的组合水解明胶来产生。 而且，可将由以上水解获得的肽混合物本身，或由肽混合物的部分纯化获得的混合物用作 成肌细胞分化促进剂。
[0034] 在本发明中，本肽可化学修饰。化学修饰可对个体氨基酸，例如，在羟脯氨酸的羟 基，在N-端氨基酸的氨基，及在C-端氨基酸的羧基实施。该化学修饰致使溶解在弱酸性至 中性条件下，及也使与随后描述的其他活性成分的兼容性改善。
[0035] 具体而言，在羟脯氨酸的羟基的化学修饰包括，例如，0-乙酰化。在N-端氨基酸的 氨基的化学修饰包括，例如，聚肽基化，琥珀酰化，马来酰化，乙酰化，脱氨基化，苯甲酰化， 烷基磺酰化，烯丙基磺酰化，二硝基苯基化，三硝基苯基化，氨甲酰化，苯基氨甲酰化和巯基 化等。在C-端氨基酸的羧基的化学修饰包括，例如，酯化和酰胺化。当将本肽阳离子化时， 可实施乙二胺化，精胺化等。
[0036] 至于化学修饰的具体手段或处理条件，应用通常的肽化学修饰技术。例如，羟脯氨 酸的羟基的0-乙酰化可通过使乙酸酐在水溶剂或非水溶剂中发挥作用来达到。例如，C-端 氨基酸的羧基的酯化可例如，通过在悬浮于甲醇后，使干氯化氢气体通气来达到，及其酰胺 化可通过向其作用碳二亚胺等来达到。而且，作为化学修饰的其他具体例，可应用描述于专 利公开No. 62-44522和专利公开No. 5-79046的化学修饰技术。
[0037]【2.成肌细胞分化促进剂】
[0038] 本肽等具有成肌细胞分化促进效应，如描述于随后-描述的测试例。因此，本肽等 可用于治疗或预防需要肌肉增强的各种疾病。本发明的成肌细胞分化促进剂可用于，例如， 运动器官综合征的治疗，少肌症的治疗，运动员、学生等的训练效果的改善，老年人、长期住 院患者等的体力增强及家畜肉质改善。
[0039] 本发明的成肌细胞分化促进剂可以各种形式的药学制备物经口或肠胃外施用。所 述形式的例包括用于口服施用的片剂，颗粒剂，胶囊剂，粉剂，液剂，悬浮剂和乳剂，及用于 肠胃外施用的注射剂，经皮剂，栓剂，滴鼻剂和吸入剂。优选的例包括直接施用到患病的位 点诸如肌肉的片剂，颗粒剂，胶囊剂和液剂。本肽优选由口服施用摄取，因为其在消化道内 很少被消化为氨基酸，但快速被吸收到肠道。本肽可与膳食或饮料混合而摄取。
[0040] 本肽的剂量依赖于患者的状态或体重，化合物的种类，施用途径等而改变。在口服 施用的情况中，是一个成年人每天，例如，约0. 1?IOOOmg,优选约1?500mg，及更优选约 30?200mg，及在直接施用到患病的部分诸如肌肉的情况中是，例如，约0. 01?200mg，优选 约0. 1?IOOmg,及更优选约1?50mg。其他形式的制备物的剂量可参照这些剂量而适当 确定。这些制备物可以每天一到几次的剂量施用，或可每一到几天施用一次。
[0041] 本发明的成肌细胞分化促进剂可适当包含其他活性成分和制剂用成分，只要其不 干扰本发明的效应。其他活性成分的例包括肌肉-增强剂诸如雄性激素，及肌肉-增强补 充物诸如氨基酸混合物。配制的其他活性成分的量可依赖于个体效应适当变化。
[0042] 制备成药学制备物中使用的药学可接受的载体的例可包括稀释剂，粘合剂（糖 浆，阿拉伯胶，明胶，山梨糖醇，黄蓍胶，聚乙烯吡咯烷酮），赋形剂（乳糖，蔗糖，玉米 淀粉，磷酸钾，山梨糖醇，甘氨酸），润滑剂（硬酯酸镁，滑石，聚乙二醇，氧化硅），崩 解剂（马铃薯淀粉）和保湿剂（月桂基硫酸钠）。本药学制备物可根据常规知道的技术通 过混合本肽，其他活性成分，药学可接受的载体等来产生。
[0043]【3.饮料或食品或饲料】
[0044] 由于本肽等是源于明胶的肽，其对于日常摄入或应用是非常安全的。因此，其作为 使用本肽等的优良的成肌细胞分化促进效应的包含本肽等的饮料或食品或饲料也有用。例 如，本发明可用于老年人、长期住院患者等的体力增强，运动员、学生等的训练效果的改善 及家畜肉质改善。本发明的饮料或食品或饲料中使用的本肽等的含量可依赖于待利用的效 应而适当改变。 【实施例】
[0045] 在下文中，会通过实施例，比较例和测试例更详细描述本发明，但不以任何方式限 于此。
[0046]【实施例1?22和比较例1?4】
[0047] 使用上述的肽固相合成方法，合成以下实施例1?8和比较例1的肽。使用这些 肽，制备以下实施例9?21的2种肽的等摩尔比混合物，及制备以下比较例2和3的2种 氨基酸的等摩尔比混合物。而且，使用以下实施例22和比较例4的可商购的胶原肽。
[0048](实施例I)Ala-Hyp-Gly(AOG)
[0049](实施例2)Hyp-Gly-Pro(OGP)
[0050](实施例 3)Leu-Hyp(LO)
[0051](实施例 4)Glu-Hyp(EO)
[0052](实施例5)Gly-Pro-Hyp(GPO)
[0053](实施例 6)Pro-Ala(PA)
[0054](实施例 7)Hyp-Gly(OG)
[0055](实施例 8)Pro-Hyp(PO)
[0056] (实施例9)OG和PO的混合物（0G+P0)
[0057](实施例10)OG和AOG的混合物（0G+A0G)
[0058] (实施例11)OG和OGP的混合物（0G+0GP)
[0059](实施例12)OG和LO的混合物（0G+L0)
[0060](实施例13)OG和EO的混合物（0G+E0)
[0061](实施例14)OG和GPO的混合物（0G+GP0)
[0062](实施例15)OG和PA的混合物（0G+PA)
[0063](实施例16)PA和AOG的混合物（PA+A0G)
[0064](实施例17)PA和OGP的混合物（PA+0GP)
[0065](实施例18)PA和LO的混合物（PA+L0)
[0066](实施例19)PA和EO的混合物（ΡΑ+Ε0)
[0067](实施例20)PA和GPO的混合物（PA+GP0)
[0068](实施例21)PA和PO的混合物（ΡΑ+Ρ0)
[0069](实施例22)胶原肽"M型（新田明胶制）〃
[0070]LC-MS/MS分析的结果，此胶原肽含有以下各自肽。
[0071]Hyp-Gly：7573ppm,Pro-Ala：2541ppm,Ala-Hyp-Gly：331ppm,Pro-Hyp：184ppm, Gly-Pro-Hyp：85ppm,Glu-Hyp：72ppm,Hyp-Gly-Pro：7ppm
[0072](比较例I)Ala-Hyp(AO)
[0073](比较例2)Hyp和Gly的混合物（0+G)
[0074](比较例3)Pro和Hyp的混合物（P+0)
[0075](比较例4)胶原肽〃HDL-50SP(新田明胶制）〃
[0076]LC-MS/MS分析的结果，此胶原肽含有以下各自肽。
[0077] Hyp-Gly：llppm,Pro-Hyp：8ppm
[0078]【试验例1】
[0079]【成肌细胞培养中的成肌细胞分化促进测试】
[0080]使用含有 10%FBS，lOOU/mL钠青霉素G，100μg/mL链霉素和I.Og/LNaHCO3 的 D-MEM培养基（D-MEM培养基（10%FBS，+P/S))培养源于小鼠的C2C12成肌细胞。于37°C 含有95 %空气和5%CO2的温育器中进行培养。在C2C12成肌细胞90 %汇合的状态下，将所 述培养基用包括2%马血清（批），10(^/1^钠青霉素6，10(^8/1^链霉素和1.(^/1似!10) 3 的D-MEM培养基（D-MEM培养基（2 %HS+P/S))取代，然后每2天重复D-MEM培养基（2 % HS+P/S)取代，以使其分化为肌管细胞。每培养基取代向培养基以100μM的终浓度加入实 施例1?21和比较例1?3的肽，及向细胞连续暴露其8天。
[0081] 用以下过程进行蛋白印迹方法。将用于蛋白测量的细胞在回收时用PBS洗涤两 次，及将细胞用细胞刮具刮下及转移到管中，及于4°C及以250Xg离心3分钟，然后将PBS 完全去除。对于各管，使细胞悬浮于IOOuL的缓冲剂（20mMHEPES-Na0H(pH7. 5)，0. 5% NP-40,ImMEDTA, 100μMAEBSF, 1μg/mL抑肽酶，10μg/mL亮抑酶肽，ImMDTT,ImM正钒酸 钠，IOmM氟化钠，10μM钥酸铵，IOmM焦磷酸钠）中，然后在冰冷却下通过使用超声分散器 对各样品进行3次5s的粉碎，之后对蛋白的量进行定量。蛋白的量的定量根据Bradford 的方法，使用牛血清白蛋白作为标准蛋白进行。在SDS-PAGE结束之后，在用甲醇平衡及通 过用转移缓冲剂（48mMTris，39mM甘氨酸）浸润而预润湿的PVDF膜上，使用印迹装置以每 Icm2的膜1. 5mA进行1小时电转移。在转移结束之后，将PVDF膜用含有6 %脱脂乳的PBS(-) 封闭1小时。将第一抗体以述下方式稀释，及于4°C过夜进行抗原-抗体反应。将缀合了 过氧化物酶的针对各第一抗体的第二抗体以下列比在含有6%脱脂乳的PBS(-)中稀释：小 鼠抗-肌球蛋白重链单克隆抗体（MF20)培养上清1/2000,小鼠抗-原肌球蛋白单克隆抗 体（CHl)培养上清1/2000,兔抗-GAPDH多克隆抗体1/3000,缀合了过氧化物酶的抗-小鼠 IgG1/5000,及缀合了过氧化物酶的抗-兔IgGl/2000,使反应30分钟，及用PBS(-)进行 10分钟3次的洗涤。然后将膜浸入ImmobilonTM蛋白印迹化学发光HRP基体3分钟，及 由LAS-4000(GEHEALTHCARE，Buckinghamshire，UK)检测。将条带由imageJ转变为数，及 表示为相对于100的对照值的数值。成肌细胞分化促进测试的结果显示于表1。
[0082] [表1]
【权利要求】
1. 成肌细胞分化促进剂，其包含选自下列的肽:Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala, Hyp-Gly 和 Pro-Hyp,或其药学可接受的盐。
2. 权利要求1的成肌细胞分化促进剂，其包含选自下列的肽：Hyp-Gly和Pro-Hyp,或 其药学可接受的盐。
3. 权利要求1的成肌细胞分化促进剂，其包含选自下列的2种或更多肽： Ala-Hyp-Gly， Hyp-Gly-Pro， Leu-Hyp， Glu-Hyp， Gly-Pro-Hyp， Pro-Ala， Hyp-Gly 和 Pro-Hyp,或其药学可接受的盐。
4. 权利要求1?3之任一项的成肌细胞分化促进剂，其中促进剂为下列形式：用于口 服施用的制剂，用于向肌肉直接施用的注射剂，经皮剂，栓剂，滴鼻剂或吸入剂。
5. 饮料或食品或饲料，其包含选自下列的肽：Ala-Hyp-Gly，Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp，Gly-Pro-Hyp，Pro-Ala, Hyp-Gly 和 Pro-Hyp,或其药学可接受的盐。
【文档编号】A23L1/305GK104271144SQ201380022730
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2012年12月13日
【发明者】小泉圣子, 杉原富人, 井上直树 申请人:新田明胶株式会社