鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化，包括以下步骤：（1）构建重组质粒pBSAZ2.1；（2）电转化表达pBSAZ2.1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母；（3）阳性重组菌株的筛选；（4）诱导重组菌表达鼠表皮生长因子；（5）鼠表皮生长因子的纯化。本发明采用基因工程的方法，将mEGF基因连接至表达载体上，在巴斯德酵母细胞中完成分泌表达，从而构建出含mEGF目的基因的基因工程菌。能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子。可以避免蛋白在保内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简单，利于大规模处理。
【专利说明】鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化。
【背景技术】
[0002]鼠表皮生长因子(MouseEpidermal Growth Factor,简称 mEGF)是一种含有 53个氨基酸的单链多肽，分子量为6054道尔顿。鼠表皮生长因子能与特异的跨膜受体结合，引起细胞内一系列生化变化，使静止的细胞进入分裂周期，促进细胞增殖，经过一段时间后达到生命平衡，细胞不再无限增殖。因此，鼠表皮生长因子是一种强有力的细胞分裂促进剂，微量的外源鼠表皮生长因子即能够刺激细胞增殖，从而加快受损皮肤和内上皮的再生修复，减少皮肤的畸形。所以，鼠表皮生长因子对烧伤创伤救治、角膜或皮肤移植、外伤性溃疡、胃肠道溃疡和应激性胃粘膜损伤的治疗均起到重要作用。
[0003]小鼠的颌下腺是EGF的主要合成部位，EGF合成后，释放到唾液、十二指肠、乳汁、尿液和血液等体液中。但其含量极低，采用冻干小鼠颌下腺的方法分离纯化得到的纯品蛋白量比较少，生物活性低，往往达不到大量制备供研究和临床使用的标准。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是为了解决重组鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GSl 15中分泌表达的问题，提供一种高效、稳定的表达mEGF工程菌的构建和筛选，以及分离纯化目的蛋白mEGF的方法。
[0005]本发明的目的 可通过下列技术方案来实现:一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GSl 15中的表达方法和纯化，包括以下步骤:(I)构建重组质粒pBSAZ 2.1 ;(2)电转化表达pBSAZ 2.1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母；(3)阳性重组菌株的筛选；(4)诱导重组菌表达鼠表皮生长因子；(5)鼠表皮生长因子的纯化。
[0006]本发明的鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化所述步骤(I)依次包括以下步骤:(a)PCR扩增mEGF-TEV-malE-HIS6基因；(b)将步骤(a)获得的mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和经同样限制性内切酶酶切的质粒pPIC 9k过夜连接处理，将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过卡纳霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和Afoi I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 2.1进一步地，。
[0007]本发明的鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化中所述步骤(2)依次包括以下步骤:(a)、重组质粒pBSAZ 2.1的线性化；b、感受态细胞的制备；c、电转化巴斯德毕赤酵母。
[0008]本发明的鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化中所述步骤(3)依次包括如下步骤:(a)利用巴斯德毕赤酵母GS115组氨酸营养缺陷型筛选整合重组菌；(b) G418抗性筛选高拷贝菌株。[0009]本发明采用基因工程的方法，将mEGF基因连接至表达载体上，在巴斯德酵母细胞中完成分泌表达，从而构建出含mEGF目的基因的基因工程菌。巴斯德酵母表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子。胞外分泌型表达是目前最先进的且适于工业化的表达方式，细胞外表达可以避免蛋白在保内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简单，利于大规模处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为重组质粒pBSAZ 2.1构建示意图
图2为pBSAZ 2.1备Bgl Π酶切后琼脂糖凝胶电泳图；
图3纯化后mEGF蛋白SDS-PAGE电泳图。
具体实施例
[0011]实施例1:重组质粒pBSAZ 2.1的构建
一)试验材料
(1)质粒和菌株
质粒pPIC 9k、PMAL-P5X和大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
[0012](2)试剂
限制性内切酶AcoR I和Afoi I，卡纳青霉素和卡那霉素购自NEB公司。
[0013]基因片段mEGF和引物由华大基因合成。
[0014]m-F:CGGAATTCAATAGTTATCCAGGAT
m-R:TAATGCTCCTGCTGCGAACTCCTCTAGTAACTGGAAATATAGGTTCTC
M-F:GAGAACCTATATTTCCAGTTACTAGAGGAGTTCGCAGCAGGAGCATTAAAAATAAAAACAGGT
M-R:
ATAAGAATGCGGCCGCCGCTGCTGTGATGATGATGATAGTCTGCGCGTC
二)实施方案
1.质粒pPIC 9k的酶切
大量提取重构质粒pPIC 9k，纯化后加入限制性内切酶I和Afoi I，置于37°C恒温培养箱2-3h做双酶切处理，将酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理，将去磷酸化产物纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0015]2.mEGF基因片段的获得
大量提取含mEGF基因片段的质粒pMD18-T-mEGF，纯化后作为PCR模板，加入引物m_F和m-R进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0016]3.malE基因片段的获得
大量提取含malE基因片段的质粒pMAL-p5X，纯化后作为PCR模板，加入引物M-F和M-R进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0017]4.mEGF-TEV-malE-HIS6 基因的获得将4°C冰箱保存的基因片段mEGF基因和malE基因混合物作为模板，加入引物m_F和M-R进行Overlapping PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段，纯化后加入限制性内切酶I和I，置于37°C恒温培养箱2-3h做双酶切处理，将酶切产物纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0018]5.重组质粒pBSAZ 2.1的获得
将mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和经同样限制性内切酶酶切的质粒pPIC 9k过夜连接处理。
[0019]将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过卡纳霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和Afoi I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ
2.1。
[0020]重组质粒pBSAZ 2.1构建示意图如图1所示。
[0021]实施例2:电转化巴斯德毕赤酵母 1.重组质粒pBSAZ 2.1的线性化
重组质粒pBSAZ 2.1采用限制性内切酶ife./ Π线性化，纯化回收后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，以确定纯化回收片段的正确性。
[0022]2.感受态细胞的制备
挑取巴斯德毕赤酵母GS1 15单菌落，接种至含有50mL YETO培养基的摇瓶中30°C，150rpm培养过夜。取100 μ L的培养物转接至含有50mL新鲜YETO培养基的摇瓶中30°C，150rpm培养，检测0D600值，待达到1.3-1.5将细胞培养物倒入预冷的无菌50mL离心管中，于4°C,4000rpm离心5min。在无菌条件下每管再用50mL的预冷无菌水将菌体沉淀重悬。于4°C, 4000rpm离心5min,再用25mL预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。于4°C, 4000rpm离心5min,用2mL预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。于4°C, 4000rpm离心5min,用200 μ L预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。
[0023]3.电转化
把电转化杯从无水乙醇中拿出，置超净台中风干，同时紫外照射20分钟，只后把转化杯放入冰盒预冷。取80 μ I制备的酵母感受态细胞，与5~10 μ g线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。擦干水汽，置电转仪上电击，电击参数为1500V，5ms。电击后立即加入1ml冰浴的lmol/L山梨醇，转入15ml离心管中，30°C静置l_2h。
[0024]实施例3:阳性重组菌株的筛选
1.利用巴斯德毕赤酵母GSl 15组氨酸营养缺陷型筛选整合重组菌将静置培养的菌液1500rpm离心5min后涂布MD平板，置30°C恒温培养箱培养2_3天至长出单菌落。
[0025]2.G418抗性筛选高拷贝菌株
将MD平板上长出的菌落分别用牙签点种至1.5mg/ml-2mg/ml G418的YETO平板上，置30°C恒温培养箱培养三天左右，选取长的比较大的菌落接种含1.5mg/ml-2mg/ml G418的YEPD液体培养基，置30°C摇床过夜培养，并-80°C保存菌株。
[0026]实施例4诱导重组菌表达鼠表皮生长因子
1.挑取单个菌落，接种50mL BMDY液体培养基于30°C，200r/min的摇床培养16_18h，直到0D600值达2左右。取ImL培养物离心，收集细胞作为未诱导对照。同时取ImL培养物接种于50mL BMMY液体培养基于30°C，200r/min的摇床培养，诱导基因表达，每隔24h取1mL，再补充1mL5%甲醇继续培养3~5d。
[0027]2.将取出的1mL培养物12000rpm离心3min，分离细胞和上清液。细胞沉淀无菌水水洗后12000r/min离心Imin,弃上清液,置超声波破碎仪破碎细胞，12000r/min离心Imin分离胞内液和细胞残渣。取20 μ L上清液和胞内液用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析蛋白是否分泌至胞外。
[0028]实施例5:鼠表皮生长因子的纯化
收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心去除不容性的杂质，取上清。
[0029]通过Amylose Resin亲和色谱柱,使MBP融合蛋白结合到Amylose Resin上,再用含有10mmol/L麦芽糖的column buffer洗脱，即得到纯化的MBP融合蛋白。
[0030]利用AKTA purifier 100 系统经过 His TrapTM FF crude 亲和层析，用 Washbuffer (20mmol/L 咪唑，300mmol/L NaC, 150 mmol/L NaH2PO4, ρΗ8.0)洗去杂蛋白，再用Elution buffer (250mmol/L 咪唑,300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4, ρΗ8.0)洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白。含有目的蛋白的样品缓慢加入N1-NTA柱，使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，在用PBS(pH7.3，140 mM NaCl, 2.7mMNaCl，50 mM NaH2PO4)洗 3 个柱体积。
[0031]向结合有mEGF-TEV-MBP-HIS6蛋白的N1-NTA柱中加入0.1mg的特异性切割酶TEV室温反应1-3小时。酶切下来的mEGF用PBS洗脱下来，收集流出液进行SDS-PAGE电泳检测。
[0032]实施例6 MTT法测定mEGF蛋白的活性 一)试验材料
1.小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3t3细胞)购自ATCC。
[0033]2.试剂:
(1)RPMI 1640培养基1000rnl加青霉素105IU和链霉素105IU，再加NaHC03 2.lg，溶解后，混匀，除菌过滤，4度保存；
(2)维持培养液牛血清4ml加RPMI16401000rnl ；
(3)完全培养液牛血清100mL加RPMI16401000rnl ；
(4)PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HP03 1.44g KH2P03 0.24g 加水至 1000ml 经121度15分钟灭菌。
[0034](5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0.1g加PBS20ml溶解，经0.22 μ m滤膜过滤除菌，4度避光保存。
[0035]二)实施方案
1.取重组鼠表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作；
2.取样品复溶后，用维持培养液稀释。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作；
3.Balb/c 3t3细胞株用完全培养液于37度，5%C02培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0X105~5.0X 1O5个细胞，传代后24~36h用于生物活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0 X IO4~8.0 X IO4个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μ I。在37度，5%0)2培养培养24h。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和样品溶液，每孔100 μ I。于37度，5% CO2培养64~72h。每孔加入MTT溶液20 μ 1，于37度，5% CO2培养5h。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养液中的液体后，向每孔中加入二甲基亚讽(DMSO) 100 μ I，混勾后在酶标仅上，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
[0036]综上所述结果如下:
1.成功构建重组质粒pBSAZ 2.1
重组质粒pBSAZ 2.1经限制性内切酶汝./ Π酶切验证电泳图如图2所示。
[0037]2.mEGF蛋白纯化SDS-PAGE蛋白电泳
将酶切后采用PBS缓冲液洗脱，过柱纯化的mEGF蛋白进行SDS-PAGE电泳，最后在凝胶成像仪上成像，得到结果如图3所示
3.mEGF蛋白的活性测定
Balb/c 3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比mEGF样品具有较高生物学活性，检测到mEGF样品的活性为1.3*105U/mg。
【权利要求】
1.一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化，其特征在于，包括以下步骤: (1)构建重组质粒pBSAZ2.1 ； (2)电转化表达pBSAZ2.1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母； (3)阳性重组菌株的筛选； (4)诱导重组菌表达鼠表皮生长因子； (5)鼠表皮生长因子的纯化。
2.根据权利要求1所述的一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化，其特征在于，所述步骤(1)依次包括以下步骤:(a)PCR扩增mEGF-TEV-malE-HIS6基因；(b)将步骤(a)获得的mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和经同样限制性内切酶酶切的质粒pPIC 9k过夜连接处理，将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过卡纳霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和Afoi I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 2.1。
3.根据权利要求1所述的一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化，其特征在于，所述步骤(2)依次包括以下步骤:(a)、重组质粒pBSAZ 2.1的线性化；b、感受态细胞的制备；c、电转化巴斯德毕赤酵母。
4.根据权利要求1所述的一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化，其特征在于，所述步骤(3)依次包括如下步骤:(a)利用巴斯德毕赤酵母GS115组氨酸营养缺陷型筛选整合重组菌；(b) G418抗性筛选高拷贝菌株。
【文档编号】C12R1/84GK103882050SQ201410000614
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】王喆明 申请人:杭州璞题生物科技有限公司